Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Özet

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Özet

Elektron cryo tomografi gibi moleküler ayrıntılı olarak hücrelere, organel, zar veziküllerinin ya da virüsler gibi biyolojik örnekler, üç-boyutlu bir yapıya sahip görselleştirme yapısal biyolojide güçlü bir araçtır. Bunu elde etmek için, sulu bir örneği hızla bir yakın-yerli, dondurulmuş sulu halde de korur sıvı etan, içinde vitrifiye edildi. Elektron mikroskobu, tilt serisi 3D tomografi yeniden oluşturulmasını sağlayan sıvı azot sıcaklığında kaydedilir. Tomografik hacminin sinyal-gürültü oranı doğal düşüktür. Tanınabilir, yinelenen özellikleri, bireysel hacimler, kesip hizalanmış ve gürültüyü azaltmak için ortalama tarafından hangi subtomogram ortalamaya tarafından geliştirilmiş. Bu şekilde, 3 boyutlu elde edilebilir 2 nm ya da daha iyi bir çözünürlüğe sahip eşleştirir. 3D hacmine kullanılabilir yüksek çözünürlüklü yapıların bir uyum sonra kendi doğal ortamında protein kompleksleri atom modelleri üretiyor. Burada biz elektron cryo-tomograp kullanımı nasıl göstermekhy mitokondri büyük membran protein kompleksleri yerinde organizasyonu incelemek. Karmaşık rasgele sıraların her iki tarafında membran bölgeleri dağıtılır ise ATP sentez, iç membran krista derece eğimli uçları dışa boyunca dimerlerin sıralar halinde organize olduğunu bulmak. Subtomogram ortalama alma terimi ile krista zarı içinde mitokondriyal ATP sentetaz dimerinin bir yapı elde edilmiştir.

Giriş

Mitokondri hücrenin güç evler. Kimyasal bağ enerji içine iç mitokondrial membran genelinde bir elektrokimyasal proton degrade dönüştürerek, mitokondriyal ATP sentaz hücresel süreçleri sürücüler ATP'nin en üretir. Mitokondrial enerji dönüşümü arkasındaki mekanizmaları anlamak için, biz yerinde ATP sentaz yapısını belirlemek için, ve düzenlenmiş ve iç mitokondrial membran nasıl dağıldığını bulmak gerekir. Tüm karmaşık ⁴ mitokondrial ATP sentetaz bileşenleri ^1-3 ve düşük çözünürlüklü haritalar çoğu yüksek çözünürlüklü yapılar mevcut olmakla birlikte, bu membran, işçi enzimin yapısını ve bir biçimini oluşturmaktır önemlidir. Iç mitokondrial membran ATP sentaz dağılımı yaygın olarak rastgele olduğu varsayılır, ancak ⁶ bu t değil belirtti ⁵ ve kendi ilk sonuçları erken olmuşturO durumda. Elektron taşıma zincirinin proton pompa her iki tarafında bulunduğu görülür iken sonradan bizim gruptan çalışmalar ve diğerleri ^7, ATP sentaz iç mitokondrial membran kristalarında ⁸ sıkıca kavisli sırtlar boyunca dimerlerinin uzun sıralar halinde düzenlenmiş olduğunu doğruladı Sıralar ^9. Bu düzenleme mitokondriyal enerji dönüşüm mekanizmalarının önemli etkileri vardır.

Biz bu düzenlemeyi belirlemek için kullandık tekniği elektron cryo-tomografi (cryo-ET) 'dir. Cryo-ET şu anda moleküler çözünürlükte hücreler, hücre bölmeleri veya organellerin doğru üç boyutlu (3D) hacimlerini veren tek yöntemdir. Zarlar iyi kontrast görünür ve 3D tomografik hacimlerde iz kolay çünkü cryo-ET, biyolojik zarların büyük kompleksleri eğitim için uygundur.

Diğer yöntemler, hücrelerin veya organell 3D yapısını incelemek içines moleküler detay vermeyin. Süper çözünürlük ışık mikroskobu ^{10, 11} pozisyon veya nm onlarca hassasiyetle ilgi proteinlere bağlı ışık yayan etiketler arasındaki mesafeleri ortaya çıkarmayı mükemmel, ama bu bile düşük çözünürlükte, proteinin kendi yapısını ortaya koymuyor . Plastik-gömülü biyolojik numunelerin elektron mikroskobu ¹³ taramalı seri bölümleri ¹² ya da blok-yüz görüntüleme transmisyon elektron mikroskopisi, hücre hacimlerinin düşük çözünürlüklü manzaralar sunar ama aynı şekilde moleküler detay ortaya koymuyoruz. Atomik kuvvet mikroskobu ¹⁴ prensip moleküler hatta atomik çözünürlük sunuyor, ama sadece bir atomik düz, katı destek nesnelerin yüzeyinde olabilir. Son olarak, X-ışını tomografisi ¹⁵ ya da serbest elektron lazerleri yoğun X-ışını palslarının saçılma örneğin ¹⁶ m bütün hücrelerin veya organel olarak büyük, kompleks, aperiyodik nesne yapısını ortaya çıkarmak için pek mümkün değildiröngörülebilir gelecekte olecular çözünürlük. Böylece şu anda, nanometre çözünürlükte hücreleri veya organellerin 3D yapı çalışmaları için-ET cryo için hiçbir alternatif yoktur.

Kriyo-ET, çekirdek gözenek kompleks ^17, grip başak ¹⁸ kompleksleri de dahil olmak üzere zara bağlı protein düzeneklerinin yapısını ve şeklini incelenmesi için tercih edilen bir yöntem, ve kamçı motor proteinleri, ^{22, 23,} aynı zamanda, tüm bakteri hücreleri ¹⁹ arasında organizasyon hücrelerde ^20-23 ile HIV gibi patojenik virüslerin ve giriş. Cryo-ET aktin filamentler ²⁴ veya axonemes ²⁵ dahil ipliksi proteinler ve hücre içindeki etkileşimleri, görselleştirmek için paha biçilmezdir. Çözünürlüğü tekrar düzenli özellikler hacimler tek parçacık Image Pro bir tomografik birimin kesilmiş ve ortalaması alınır ve bu sayede subtomogram, ^26, ortalama 2 nm ya da daha iyi arttırılabilircessing teknikleri.

Cryo-ET transmisyon elektron mikroskobu (TEM) farklı tilt açıları alınan ince bir örneğinin (<250nm) projeksiyon görüntüleri bir dizi satın içerir. Madde ile kuvvetli bir etkileşimi elektronlar, birden fazla dağılmış şekilde örnek ince olmalıdır. Çoklu saçılma yorumlamak çıkan görüntülerin zorlaştırır ve kontrastı azaltır. Seçilen örnek alanın Görüntüler her bir diğerine göre hizalanmış ve numunenin bir 3D hacmi üretme, uygun bir bilgisayar programı tarafından 3D uzaya yansıtılır. Görüntülerin hizalama dondurma öncesi numune ile karıştırılır altın yanlılık belirteçleri tarafından desteklenir. İdeal olarak 10 ya da daha fazla eşit dağıtılmış yanlılık belirteçler iyi bir uyum elde etmek için, her bir görüntü mevcut olmalıdır.

Moleküler ayrıntı gözlemek için, numuneler dalma-dondurulmuş onların yerli hidrate durumunu korur sıvı etan, vardır. Bir sıvı içinde dondurulmasıetan kadar hızlı (~ ⁵ ° 10 ° C / sn) su kristalize ama vitrifiye, cam benzeri durumda kalır değil ^27. Buz kristallerinin oluşması zarar verir ve hassas biyolojik yapıları. Biyolojik örnekler radyasyon hasarı muzdarip gibi, numune tahammül saçılma olaylarının toplam sayısı için bir sınır yoktur. Görüntüler böylece düşük doz modunda edinilen: ilgi alanı 1 e altında bir elektron doz düşük büyütme (1,500X) tespit edilir ^- / ² nm (arama modu). Görüntü daha sonra faiz (odak modu) alanı kapalı, yüksek büyütmede odaklanmıştır. Bir görüntü elde edilir sadece, ilgi alanı yüksek bir elektron dozda (pozlama modu) ile ışınlanır.

Burada, bir örnek olarak iç mitokondrial membran ATP sentaz dimerleri kullanarak toplama ve proses elektron cryo-tomografi için nasıl bir bakış sunacak. Aşağıdaki protokol cryo-ET için mitokondri nasıl hazırlanacağını anlatır, nasıl kurmakve belirli bir toplam elektron dozu ve nasıl ilgi alanındaki bir 3 boyutlu hacim elde etmek için tenteli serisi işlemek için olan bir eğim dizi toplamak. Işlem bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protokol

Diferansiyel Santrifüj ile hücreler ya da dokulardan Mitokondri hazırlanması 1.

Bu bölüm, çeşitli ökaryotik sağlam mitokondri izolasyonu için genel bir prosedürü anlatmaktadır. Tampon parçaları ve santrifüj hızları hassas, her doku için optimize edilmesi gerekir / türler okudu.

1. Izotonik tampon hücreleri Ayrılma (örneğin, 250 mM sakaroz, 10 mM HEPES, pH 7.4) içinde bir cam boncuk öğütücüsü kullanılarak (mantar miselyumu), ^28, enzimatik hücre duvarı (Saccharomyces cerevisiae) ^29, bir bilyalı homojenleştirici sindirimi (tek cell ökaryotlar / kültür hücre / nematodlar) ³⁰ veya blender (hayvan veya bitki dokuları) ^31.
2. Düşük hızlı santrifüj (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika) ve ardından da müslin içinden süzme ile hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır.
3. 9000 xg, 4 ° C (yüksek hızda santrifüj ile yüzer madde ve topak mitokondri toplayın, 10 dakika).
4. Gerekli olduğu takdirde, mitokondrial fraksiyonu ^32, ilave saflaştırma için izotonik yoğunluk basamaklı bir derece kullanın.

Elektron Cryo-tomografi için Mitokondri 2. hazırlanması

Aşağıdaki bölümde, cryo-ET için dondurulmuş hidratlanır örnekleri elde açıklamaktadır. Not: Bu yöntem ciddi deri yanıklarına neden olabilmektedir derece soğuk sıvı azot ve etan kullanılmasını da gerektirir. Koruyucu gözlük ve cryo-koruma eldiven giyilmelidir. Ayrıca yanıcı sıvı etan, davlumbaz içerisinde ele alınmalıdır.

1. 250 mM Trehaloz, yaklaşık 5 mg / ml toplam protein konsantrasyonunda, pH 7.4 'de 10 mM HEPES tamponu içerisinde yeniden süspanse topak mitokondri.
2. Glow-deşarj holey karbon EM ızgaraları, üreticinin talimatlarına göre bir vakum cihazı karbon tarafı yukarı.
3. Bir sıvı azot serin iç tarafı üzerine etan gazı akımının yönlendirilmesi ile etan birkaç mililitre sıvılaştırılmasıed alüminyum kap.
4. Mitokondriyal süspansiyon ile 1 ve hemen cımbız düzenlenen kızdırma deşarj EM ızgara 3 ul geçerlidir: protein A-konjuge altın yanlılık süspansiyon 1 karıştırın.
5. Bir vitrifikasyon cihaz örneğin, bir ev yapımı giyotin içinde cımbız yerleştirin. Filtre kağıdı bir kama ile (~ 5 saniye veya sıvı durduktan yayma kadar) ve hemen tetiği bırakmadan tarafından sıvı etan içine ızgara dalma aşırı sıvı kurulayın.
6. Sıvı azot içine sıvı etan ızgara aktarın. Taşıma sırasında, filtre kağıdı ile ızgara fazla etan çıkarın. Sıvı etan içine bir filtre kağıdı kama şeklindeki parçanın ucu ile. Sıvı etan yükseldikçe, hafifçe filtre kağıdı ızgara sürükler ancak sıvı ön altında tutun. Sıvı etan kılcal hareket ile ızgara çıkarılır ve tüm sıvı etan çıkarıldıktan sonra, hemen sıvı azot içine ızgara aktarılmaktadır.
7. , Izgara saklama kutusu içine vitrifiye ızgara yerleştirin, birnd uygun şekilde daha sonraki kullanım için sıvı azot altında depolayın.

Tomografik Tilt Serisi 3. Kaydı

Aşağıdaki bölümde kurmak ve bir post-kolon enerji filtre ve CCD kamera ile donatılmış bir Polara elektron mikroskobu ile bir mitokondrinin bir tomografik eğim dizi toplamak açıklamaktadır. Benzer protokolleri CCD veya doğrudan elektron dedektör kameralarla donatılmış tüm elektron cryo mikroskopları kullanılır.

1. Mikroskop hizalayın
   1. Testi takın örnek, örneğin, grafit ve holey karbon film altın adalar.
   2. Mikroskobun düşük doz sisteminde seçiniz arama modu.
   3. Eucentric yüksekliğe örnek getirin. Numune tutucu eğildiğinde bu minimal xy hareket noktasıdır. , 0 ° eğimde ilgi noktasını ortalamak 20 ° sahne eğin ve z yüksekliğini değiştirerek noktasını yeniden ortalamak. 0 ° dönün ve yanal ofset minimize edilinceye kadar tekrarlayın.
   4. Seçinizpozlama modu. Bir tomogram toplamak için istenen büyütme seçin (örneğin, piksel boyutunu numune nm dedektör ≈ 0.6 üzerinde 25,000X).
   5. Küçük bir kondansatör diyaframı (50-70 mm) seçin ve ışın görüntüleme cihazı yerine sadece daha geniş ve 60 e bir piksel okuma verir, böylece bir nokta boyutu ve ışın yoğunluğunu seçmek ^- / piksel (CCD) veya 14 e ^- / piksel / sn (doğrudan elektron dedektörü, sayma modu).
   6. Merkezi kondansatör diyafram.
   7. Gauss odak örneğin minimal kontrast noktasını bulun. Sıfırlama mikroskop bulanıklaştırma okuma ve doğru mafsal noktalarını ve üreticinin talimatlarına göre rotasyon merkezi.
   8. Tomogram kayıt için istenen flulaştırmayla olarak çevirin. NOT: Düşük odaksızlık (2-4 mikron) kontrast pahasına çözünürlüğü artar ise Yüksek odaksızlık (8 mikron), kontrastı artırır ama çözünürlüğü azaltır.
   9. Boş bir çukurun üzerine, göre üreticinin yeni kazanç referans oluşturmak ve enerji filtresi hizalamatalimatları.
   10. Arama ve pozlama modları hizalayın. Pozlama modunda, bir ilgi noktasını ortalamak ve arama moduna geçmek. Seç 1,500X büyütme (dedektör üzerinde numunenin 0.033 mm / piksel) ve (artmış kontrast için) 100 mikron odaksızlık. Görüntü kaydırma bobinleri kullanarak ortalamak için faiz arka noktaya getirmek.
   11. / Piksel (CCD) veya ~ 8 ^- e ^- ışın görüntüleme cihazı yerine sadece daha geniş ve 20 e ~ piksel okuma verir böylece arama modunda, spot boyutu ve ışın yoğunluğunu ayarlayın / piksel / sn (doğrudan elektron dedektörü, ) modunu sayma.
2. İyi bir Numune Alanı bulma
   1. Sıvı azot sıcaklığında elektron mikroskop içine donmuş hidratlanır mitokondri ile ızgara yerleştirin (EM üreticinin talimatlarına bakın).
   2. Arama modunda, uygun buz kalınlığı ve örnek kalitesi alanları için ızgara arayın. Tomogram koleksiyon için uygunluğunu belirlemek umut verici alanlarından bir 6 saniye arama görüntüsünü alın. Both iç ve dış mitokondrial membran bu büyütme görünür olmalıdır.
3. Bir Tomografik Tilt Serisi Kayıt
   1. İyi bir örnek alanı bulunduktan sonra 60 ° pozlama herhangi bir engel olmadan kullanılabilir maksimum eğim aralığı belirlemek veya ızgara çubukları veya buz parçaları ile odak alanı için ±, sahne yatırın.
   2. / CCD veya 6-8 e piksel ^{- -} ​​benzer görünüm yakındaki bir buz dolu delik, böylece her kaydedilen görüntü 30-50 e bir elektron dozu var ışın yoğunluğu veya görüntü alma zamanı pozlama moduna geçmek ve ayarlayın / piksel / modu sayma, doğrudan elektron dedektörleri s.
   3. 60 ° görüntünün o ile 0 ° edinilen 1 sn görüntü için ortalama elektron sayısının bölünmesiyle doz dağılımı oranını (I ₀ / I ₆₀₎ hesaplayın. Bu oran (tutma süresi = 1 / C eğim açısı arttığında görüntü başına sabit bir elektron sayılmasını sağlamak için gerekli maruz kalma süresinde artış demektiros (α) ⁿ burada (I ₀ / I ₆₀₎ = 2 ^n). Oranı da buz kalınlığı iyi bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Mitokondri İyi tomografi genellikle I ₀ / I ₆₀ = 2.3-2.6 ile kaydedilir.
   4. Boş bir çukurun üzerine, pozlama modu 1 sn görüntü elde ve Å ² başına elektron sayısını unutmayın. Dikkate doz dağılımı oranını alarak, belirli bir toplam elektron doz için kaydedilebilir resimlerin toplam sayısını hesaplamak (örneğin, <40 e ^- yapı tayini için / Å ² & ~ 160 e ^- morfoloji için / Å ^2).
   5. Toplam eğim aralığı bölünmesi ile tomogram toplanması için uygun bir eğim aralığını belirlemek (örneğin, ± 60 °, 120 °) 3.3.4 hesaplanan görüntülerin toplam sayısına göre.
4. Set up ve uygun otomatik veri toplama yazılımı ³ kullanılarak yukarıda belirlenen parametreler ile bir tomogram kayıt^{3, 34.} Tilt dizi genellikle ± 20 ° başladı ve artan elektron doz tarafından tahrip düşük eğim görüntülerin bilgi içeriğini maksimize etmek için yüksek tilts ulaşmadan 0 ° geçmesi edilir.

4. Oluşturma ve Tomografi Ciltler Segmentasyon

Bu bölüm mitokondri tomografik hacimleri eğim serisi ve hacimleri genel görüntüleme için mevcut ne üretilir açıklamaktadır.

1. Uygun bir dizine tomografik tilt dizi kaydedebilirsiniz. Görüntü yığını oluşturmak ve mrc yığınlarının .dm3, .dm4 veya .tif dosyalarını dönüştürmek gibi dm2mrc veya tif2mrc (IMOD paket) gibi açık kaynak yazılım, uygun bir dosya biçimi, dönüştürün. mrc yığınları imod ³⁵ tomografik yeniden yapılanma için gereklidir. Diğer paketler farklı biçimleri gerektirir.
2. (Görüntüleri hizalayın ve IMOD öğretici ayrıntılı adımları izleyerek bir tomogram oluşturmak http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
3. Imod ile dağıtılan doğrusal olmayan anizotropik difüzyon filtresi kullanılarak tomografisinde kontrastını arttırmak. Bu filtre membranlar ve bu ATP sentaz gibi membran-ilişkili parçacıklar için de çalışıyor.
4. Görselleştirme için, el ile kademeli tomogram, örneğin, ticari olarak temin edilebilir Amira programları kullanılarak. Iç ve dış zar tekabül eden vokseller atama ve bir yüzey oluşturur. Amira ³⁶ için EM-paket eklenti tıkırtı seçeneğini kullanarak ATPsentaz parçacıkların konumunu işaretleyin.

5. Subtomogram ATP Sintazı dimerlerinin ortalamasının ve X-Ray Yapılarının Dizaynı

Aşağıdaki bölümde ATPsentaz dimerlerinin subtomogram ortalamaları elde edilebilir anlatılmaktadır.

1. Böyle 'Kapsamında girdi ve uygun bir yazılım paketi olarak işaretlenmiş parçacıklar kullanılarakElektron Tomografi 'programı için icle Tahmini, bir subtomogram ortalamasını hesaplamak.
2. Bir çözünürlük tahmini için, Fourier kabuk korelasyon ³⁷ iki bağımsız olarak belirlenir subtomogram ortalamalarının karşılaştırılması.
3. Rijit gövde tarafından subtomogram ortalama içine mevcut, rıhtım bilinen X-ışını yapılar, ya elle uydurma veya programda Chimera ³⁸ gibi otomatik sıralı yerleştirme rutinleri kullanıyorsanız.

Sonuçlar

Mitokondri elektron cryo-tomografi açıkça (Şekil 2) organelinin 3D morfolojisini ortaya koymaktadır. Tomografik hacimde zarların manüel olarak bir mitokondride krista yapısını göstermektedir. Belirli bir protein bileşenleri eksikliği farklı maya nakavt soylarından mitokondri görüntüleme ile, krista morfolojisi bu proteinlerin etki değerlendirilebilir yoluyla elde. 3 ATP sentetaz alt-birimi E eksik maya kökü bir mitokondri göstermektedir. ATP sintaz kompleksinin bu bileşeni, mitokondriyal ATP sentaz dimerizasyonunun için gereklidir. Bu gövdeden mitokondri (Şekil 2), yabani tür mitokondri normal katmanlı krista yoktur ve bunun yerine, iç zar bölümlerine bir dizi içerir. Bu bölmeler, krista ya yoksun olan veya küçük balon şeklinde membran invajinasyonları (Şekil 3) içerir.

Tomograms Bu durumda ATP sentaz dimerlerdeki iyi kontrast, geniş mitokondriyal protein kompleksleri ile, kolayca görülebilir (Şekil 4; Film 1). (; Film 2, Şekil 5) komplekslerinin yapıları subtomogram ortalamaya 2-3 nm çözünürlükte belirlenebilir. (; Film 3, Şekil 6), ortalama hacim zar içinde birbirlerine göre ve diğer protein kompleksleri bireysel komplekslerinin organizasyonu değerlendirmek amacıyla tomografisinde geri yerleştirilebilir.

Elektron cryo-tomografisinin aşamalarını gösteren 1. Akış şeması Şekil. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Yabanitip S. Cerevisiae'den bir mitokondrinin Şekil 2. Morfoloji. Bir yabanitipte S. bir tomografik hacmi ile Orta dilim cerevisiae Mitokondri (solda) ve ilgili yüzey-render hacmi (sağ). Ancak, dış membranın segmente gri renkle gösterilir ve iç sınır hacimleri ve açık mavi zar krista edilir. Davies ve arkadaşları ⁸ uyarlanmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Bir S 3. Mitokondri Şekil. Cerevisiae suşu için gerekli bir alt birimini eksikATP sentaz Dimerleştirme. Tomografik hacmi (solda) ve S bir mitokondrinin yüzey hale hacmi (sağ) eşlik aracılığıyla dilimleyin. ATPsentaz dimerizasyonundan için gerekli protein alt birimi E eksik cerevisiae suşu. Şekil 2 ile karşılaştırıldığında, mutant suşu olan mitokondri vahşi tipli mitokondri normal katmanlı krista yoksundur. Bunun yerine, herhangi bir Mitokondri ya da balon krista şeklindeki krista ya da birçok iç membran bölmeleri vardır. Böylece elektron cryo-tomografi delesyonlardır nedeniyle membran morfolojisi değişiklikleri vurgular. Davies ve arkadaşları ⁸ uyarlanmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Figurmantar S. e 4. Mitokondri anserina. ipliksi mantar P. bir mitokondrinin tomografik hacmi (sol) ve (sağ) Ekteki yüzey render hacmi ile dilimleyin anserina. Bu tomografisinde, 10 nm'lik bir partikül (sarı ok başları) sıraları, iç membran kristalarında derece eğimli membran sırtlar üzerinde yer alır (Film 1 e bakınız). Bu parçacıklar subtomogram ortalamaya ATPsentaz dimerler olarak tespit edilmiştir. Davies ve ark ^9. Den büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Mitokondriyal ATP sentaz Şekil 5. yapısı ve organizasyon. Side ve S'den bir ATPsentaz dimerin elektron yoğunluğunu gösteren üstten görünümü c erevisiae monte atom modelleri (solda) subtomogram ortalama alma ile belirlenmiştir. Satır (sağda) ATPsentaz dimerlerinin organizasyonunu gösteren mitokondriyal iç membran vezikül. Şekil ortalama sırasında hesaplanan koordinatları kullanarak, zar vesikül segmentli hacmi içine ATP sintaz dimerinin subtomogram ortalama konumlandırılmasıyla elde edilmiştir. Davies ve arkadaşları ⁸ uyarlanmıştır. Atom modelleri: F ₁ / rotor-halkası [PDB: 2WPD] ³⁹ (mavi ve mor); duyarlı kazandıran protein OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] ⁴⁰ (yeşil); periferik sapı fragmanı [PDB: 2CLY] N-terminal kalıntıları ile ¹ [PDB: 2WSS] ² (sarı ve kırmızı) (Film 2 bakınız). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

_upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Bir P. Şekil 6. İzole krista vezikül anserina Mitokondri. Dilimler P. krista vesikülün tomografik hacmi (sol) ve (sağ) Ekteki yüzey render birimdeki anserina. Zarından çıkıntı yapan protein yoğunlukları açık bir şekilde görülebilir. Subtomogram ortalamaya tanımlanan sarı ok uçları ile gösterilen yoğunlukları, ATPsentaz dimerlerdir. Yeşil ok uçları NADH dehidrojenaz gibi antikor etiketleme tarafından tespit yoğunlukları işaret (1 kompleksi; detayları ⁹ bakınız). Protein yoğunlukları bölümlendirilmesi (bakınız sıraların her iki tarafındaki zar bölgelerde yüksek kıvrımlı sırtlar boyunca krista sıraları oluşturarak (kırmızı ve sarı) ATP sintaz dimerleri ve NADH dehidrogenaz kompleksleri (yeşil) ile, kristalarında düzenlenmelerini göstermektedir Film 3). Davies ve ark ^9'dan.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Bir P. Film 1. Elektron cryo-tomogram anserina Mitokondri. filmi ipliksi mantar P. bir mitokondri alınan tomografik hacmi ile art arda dilimler gösterir anserina. ATP sentaz satırlar sarı ok uçları ile gösterilir. Yüzey-render, bölümlenmiş hacmi 3D kristalarında yapısına göre ATP sentaz (sarı küreler) yerini gösterir. Dış zar, gri; iç sınır zar, saydam mavi; membranlar, opak mavi krista. Davies ve ark ^9'dan. Ayrıca Şekil 4 bakınız. Videoyu izlemek için burayı tıklayın.

S mitokondriyal ATP sentaz dimerinden Film 2. Subtomogram ortalama. Donatılmış atom modelleri ile cerevisiae'de. Ortalama121 hacimler hesaplandı. Yoğunluk üç kontur düzeyde görüntülenir: 1s - örgü, 2s - açık gri ve 3s - koyu gri. Atom modelleri Chimera sıralı uygun rutin kullanılarak yoğunluğu içine monte edildi. Atom modelleri: F ₁ / rotor-halkası [PDB: 2WPD] ³⁹ (mavi ve mor); duyarlı kazandıran protein OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] ⁴⁰ (yeşil); periferik sapı fragmanı [PDB: 2CLY] N-terminal kalıntıları ile ¹ [PDB: 2WSS]. ² (sarı ve kırmızı) Videoyu izlemek için burayı tıklayın.

Davies ve arkadaşları ⁸ uyarlanmıştır. Ayrıca Şekil 5 bakınız.

Bir P. Film 3. İzole kristalarında vezikül Mitokondri anserina. ardına dilimleri tomografik hacim ile parçalara ayrılmış yüzey işlenmiş hacim olarak takip etmektedir. Membranın çıkıntı yapan protein yoğunluklarıE açıkça görülebilir. Kırmızı ve sarı yoğunlukları ATPsentaz dimerlerdir. Yeşil yoğunlukları antikor etiketlemesi ile saptandığı haliyle NADH dehidrojenaz (karmaşık I) bileşikleridir. Davies ve ark ^9'dan. Ayrıca Şekil 6 bakınız. Videoyu izlemek için burayı tıklayın.

Tartışmalar

Burada sunulan protokol ve mitokondri subtomogram ortalamasını ET-kriyo bir giriş sağlar, ancak esas itibariyle aynı prosedürü herhangi bir başka hücre bölmesi veya membrana uygulanabilir. Mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, işlem sırasında kritik adımlar numune hazırlama, dalma dondurma işlemi ve veri toplama stratejisi vardır. Başarı için kritik olan örnek kalitesi, iyi görüntü kontrastı için büyük önem taşımaktadır uygun buz kalınlığının sağlanması için optimize edilmiş bir donma protokolü bağlıdır. En iyi veri elde etme stratejisi cihaz ve örnek bağlıdır. Optimize edilmesi Parametreler görüntü başına elektron doz, eğim düzeni ve bulanıklaştırma bulunmaktadır. İyi bir örnek iyi bir tomogram Kazanılması bütün işleme kolay adımları ve tatmin edici bir uç sonuç sağlar yapar.

Cryo-ET subtomogram ortalama alma ve atom modeli montaj ile kombine protein kompleksleri inci nasıl düzenlenir ayrıntılarını sağlarEIR yerli hücresel ortamı. Bu teknik, örneğin solunum zinciri supercomplexes (1.7 MDA), ATP sentetaz dimerlerinden oluştuğunu gösterir (2x500 kDa), ya da çekirdek gözenek kompleks (~ 120 MDA) ^{8, 9, 17} gibi büyük bir zar protein kompleksleri, yapısını araştırmak için de aynı derecede uygundur. Dimer satırlar izolasyonu gerekli bir adımdır deterjan ekstraksiyon, bozulur çünkü satır içine ATPsentaz dimerlerinin organizasyonu, örneğin X-ışını kristalografisi, NMR veya tek-parçacık cryo-EM gibi yüksek çözünürlüklü teknikleri ile görülemez ve membran protein komplekslerinin saflaştırılması.

Kristalarında sırtlarda dimerlerinin satır ATP sentaz düzenlemesi bütün türlerin mitokondri evrensel bir örgütlenme ilkesidir. Elektron nakil zincirinin proton pompalama kompleksleri, özel komplekse, I (NADH ^{dehidrojenaz),} ya da yan satır ⁸ zarı alanları bulunur9. Solunum zinciri Bu organizasyon mitokondriyal Bioenerji üzerinde derin bir etkisi vardır. Dimer satır bağlı dimer özel protein alt birimlerinin olmaması oluşturamazsa, Şekil 3 ^41'de gösterilen maya mutant de görüldüğü gibi, hücreler daha uzun üretim süresi ve düşük hücresel uygunluk gösterirler. Mitokondriyal hastalıklarda artan ilgi ile, detaylı bir mitokondriyal ultrastrüktürünü ve işlevini yöneten moleküler temeli anlaşılması önem taşımaktadır. Elektron cryo tomografi nanometre ölçeğinde zar protein yüksek çözünürlüklü metodlarla tespit yapısı ve dağılımı ve bu proteinlerin düzenleme arasında bir bağlantı sağlar. Bu cryo-ET sağlığı ve hastalıkları, mitokondriyal yapısını ve işlevini anlamak için gerekli bir araç yapar.

Cryo-ET de teknik ilerlemeler ve gelişmeler Protei konumunu belirlemek için protein etiketleme stratejileri içerirmakromoleküler kompleksleri n alt üniteleri veya hücrelerde daha küçük veya daha az farklı proteinlerin yeri (<0.5 MDa). Ayrıca, tek parçacık analizi veya sarmal imarlı subtomogram ortalamasını birleştiren hibrid EM işleme yöntemleri, son zamanlarda protein yapılarını tespit ettik Å ^{42, 43} 8 ~ için. Bu işleme yöntemleri şu anda iyi buz ayrılmış veya sarmal meclisleri oluşturmak ve şu anda mitokondri gibi kalabalık ortamlarda hücresel için geçerli değildir ve membranlar kristalarında olan saflaştırılmış proteinlerin, kısıtlanır. Veri toplama için yeni bilgisayar ve donanım araçları, otomatik tomogram satın izin görüntü kontrastını artırmak ve gereken toplam elektron dozu azaltmak için geliştirilmektedir. Kriyo-ET tek temel sınırlama elektron ışını ile radyasyon numuneye zarar verir. Bu, sadece çok düşük dozlarda elektron zayıf sinyal-t ile sonuçlanan bir tomografik eğim serinin her görüntüyü kaydetmek için kullanılan anlamına gelirO-gürültü sonuçta elde çözünürlüğünü sınırlar oranı. Bir yıl önce daha az piyasaya yeni doğrudan elektron dedektörleri, şu anda tek parçacık cryo-EM ^{44, 45} alanında devrim vardır. Bu yeni detektörler düşük elektron dozlarda daha yüksek kontrast ve daha iyi çözünürlük sağlar. Elektron cryo-tomografi için, bu aşırı radyasyon hasarı (bir CCD görüntü 5 doğrudan elektron dedektörü görüntüleri elektron dozunda eşdeğer) endişe olmadan alınabilir küçük adım boyutlarda hatta çift eksenli tomogramları ile Eğim dizi anlamına gelir. Bu dedektörler tarafından üretilen verilerin büyük miktarlarda üstesinden gerekecektir veri işleme, saklama ve işleme kendi zorlukları, oluşturun.

Buna ek olarak, faz kontrastı arttırmak için ışık mikroskobu rutin olarak kullanılanlar gibi benzer prensipler ile çalışır faz plakaları şu anda, transmisyon elektron mikroskopisi ^{46, 4} için geliştirilmektedir7. Bu tomografi odaklanmak yakın toplanmış ve dolayısıyla daha yüksek çözünürlükte, aynı zamanda düşük çözünürlüklü koruyarak uyum ve tomografik hacimleri yorumlanması için gerekli özellikleri izin vermelidir. Birlikte ele alındığında, bu teknolojik gelişmeler büyük ölçüde cryo-ET tarafından ele alınabilir biyolojik sorular yelpazesini genişletmek olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Roth	4621.2
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9449
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Zymolase	biomol	Z1000.1
Density gradient medium	Sigma-Aldrich	D1556 or P1644
Protein A gold	Aurion	810.111	10 nm
Ethane	Air Liquide	P0502S02R0A001
Nitrogen	Air Liquide	I4150RG
Consumables
Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1004 090	Nr 4
Tweezers	Dumont	T506	Non-magnetic, pattern #5
EM combined test grid	Plano GmbH	S142	grapite and gold islands on holey carbon film
Holey carbon grids	Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat		R2/2 300 Cu mesh
Cryo grid boxes	Plano GmbH	160-42	Alternative home-made metal boxes
Potter	Sigma-Aldrich	P7984
Blender	Waring	8011S
Glass bead mill - bead beater	BioSpec Products	1107900-105	Including 0.5 mm beads
Ball-bearing (Balch) homogeniser	isobiotec	H8
Centrifuge	Thermo Scientific	46915	Sorvall RC6+
Glow-discharge apparatus	Bal-Tec A.G.	CTA 010
Grid vitrification device	FEI, Gatan or Leica		Alternative home-made plunger
Transmission electron microscope	FEI or Jeol		300 keV
Direct electron detector	Gatan	K2 summit	4k x 4k pixels, counted mode
Charge coupled device (CCD)	Gatan	US4000	4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector)
Energy filter	Gatan or Jeol
Software
Image acquisition software	Gatan
Tomogram acquisition software	Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder		4 alternatives
Tomogram processing software	FEI, UCSF or UC-Boulder		3 alternatives
Subtomogram averaging software	UC-Boulder, or University of Basel		2 alternatives
Tomogram visualization software	UC-Boulder, FEI, or University of Utah		3 alternatives
Visualization software plugin	Goethe university		http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/
Structure visualization software	UCSF		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Numerical calculation software	MathWorks		http://www.mathworks.de/academia/