Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

Özet

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Özet

1970'lerin western blot, varlığını ve karmaşık biyolojik örneklerin içindeki belirli proteinlerin göreceli bolluk değerlendirmek için bir tekniğin ilk halka bildirdi kullanımı gördüm. O zamandan beri, batı lekeleme metodoloji moleküler biyologlar deneysel repertuarı ortak bir bileşeni haline gelmiştir. Terimini "western blot" kullanırken PubMed'e üstünkörü bir arama 220.000 yayınlanan yazılarda aşan önemlisi 2014 yılına kadar bu tekniğin kullanımını yapmış önerir, son on yıl kalkınma ile birleştiğinde teknik görüntüleme gelişmeler gördük daha iyi bir duyarlılıktır ve doğrusal algılama daha büyük aralıkları vermiştir duyarlı floresan etiketler. Sonuç biyologlar her zamankinden daha fazla hassasiyet ve doğruluk ile karşılaştırmalı ifade analizi yürütmek için izin verir Western Blot (QFWB) tabanlı bir şimdi gerçekten Ölçülebilir Floresans. Pek çok "optimize" batı lekelememetodolojileri vardır ve farklı laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bunlar genellikle nedeniyle ince ama belgesiz usul değişikliklerinin ihtiyacına uygulamak zordur kanıtlamak. Bu protokol giderme stratejileri ile tam bir kurulan ve sağlam QFWB yönteminin açıklayıcı bir tarifini sağlar.

Giriş

Western blot analizi (DB), orijinal olarak bir doku homojenatı ¹ gibi, karmaşık bir biyolojik numunede ilgi konusu bir proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için, 1970'lerin geliştirilen bir analiz tekniğidir. Yaygın nedeniyle önemli antikor-antijen etkileşimi, protein immunoblot olarak anılacaktır, bu yöntemin 5 ayrı adımlardan oluşur: izoelektrik alanına göre proteinlerin 1) elektroforez yolu ile ayrılması; 2) nitroselüloz veya Polivinil difluoride (PVDF) membran transfer; 3), ilgi konusu proteine ​​özel bir birincil antikor ile etiketlenmesi; Birincil antikora karşı yönlendirilmiş bir ikincil antikorla 4) inkübasyon; ve 5) görselleştirme.

Görselleştirme metodoloji güvenliği ve duyarlılığı artırmak için zamanla gelişti. İlk Kitaplarına bazıları, daha sonra daha yaygın olarak kullanılan chemilluminescent (ECL) metodları, kolorimetrik ve ilerlemiş radyo-etiketli etiketler kullanılarak gerçekleştirildi. Radioactivikolorimetrik ve ECL metodolojiler örneğin alkalin fosfataz ya da streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) ² gibi bir enzim haberci ile dolaylı bir etiketleme tekniğini kullanırlar Ty doğrudan belirli bir antijen için problar üzerine etiketlendi. Chromagen ya da lüminesan ürünün etiketlenmesi yoğunluğu güçlü ya da zayıf bir sinyal gücü, örnek olarak, ilgi konusu proteinin daha fazla veya daha az varlığını belirtir, burada densitometrisi kullanılarak ölçülür. ECL daha hassas ve bu nedenle tercih edilen yöntem ^2, ancak 3 yöntemleri ilk olarak daha sonra ³ Kurulan daha gelişmiş bir dijital görüntüleme teknikleri ile X-ışını filmi üzerinde geliştirilmiştir. WB dijital görüntüleme ilerlemesi sadece kendi ilgi proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için, bir araştırmacı izin verilir, ancak başka numuneler karşı karşılaştırıldığında, aynı zamanda seçilmiş bir protein ekspresyon düzeyi için çıkarsama bırakıldı ve bu yüzden şu şekilde de ifade edilebilir "Yarı-kantitatif & #8221 ;. Ölçülen floresan seviyesinin doğrudan numune içindeki miktarı ve tek bir proteinin ekspresyonu ile ilgilidir, burada en son, gerçek bir nicel ve daha hassas Batı lekeleme tekniği geliştirilmiştir: nicel (QFWB) batı beneklemesinden floresan değildir.

ECL etiketi ile QFWB karşılaştırıldığı zaman, bir fluorescent sekonder antikor kullanımı doğrusal tespit profili ⁴ oluşturur. Bu sinyal doğrusallık, genellikle her yerde ifade hazırlık geninin ^5,6 ile örneğin, doğrudan protein ifadesi ile ilgili olan 5 ug ve sinyal doygunluk altında düşük protein yükleri ile oluşur ECL tekniklerine tersidir. Bu dengesizlik, muhtemelen potansiyel bir sinyal doyma daha yüksek bir olasılıkla edilen biyotinlenmiş sekonder bağlamak için bir avidin ECL alt-tabaka için müsait bağlanma mevkilerinin daha fazla sayıda neden olur. Bu gibi onl bahsedilerek ECL baz immünolekeleme için ana nedenlerinden biridiry "yarı-kantitatif" ^7. Ekspresyon düzeylerinde ince farkları ölçmek ve doğru ölçümlerine neden zaman sinyalinin doyma noktası önem taşımaktadır. Son yıllarda giderek artan duyarlılık ve ince ifade farklılıklarının belirlenmesini detaylandırma yaygın proteomik tekniklerin gelişiyle doğrulama deneyleri ^8,9 için gerçekten kantitatif batı lekeleme üzerinde gittikçe artan bir güven sonuçlandı. , Hassas, sağlam ve gerçekten kantitatif metodoloji uygulanması çok önemlidir.

Pek çok "optimize" batı lekeleme metodolojileri nedeniyle sık sık resmi belgelenmiş protokollerde belirgin olmayabilir ince metodolojik ayarlamalar kurmak veya taklit edilmesi zor kanıtlamak bağımsız laboratuarlar tarafından kullanılmıştır. Bu QFWB için kurulan ve sağlam bir protokoldür ve ayrıca ortak sorunları tha gidermek için değerli stratejiler sunart uygulanması sırasında ortaya çıkabilir.

Bu protokol başlangıçta murin beyin homojenatlarının ile kullanım için optimize edilmiş, ancak bu yana doku örnekleri ve türlerin ^4,9,10 geniş bir dizi etkili kullanılmıştır. Belirli sorunların giderilmesi için gerekli potansiyel protokol varyasyonları dahildir.

Protokol

Bu protokol değişkenliği azaltmak ve tutarlılığını artırmak amacıyla ticari olarak üretilen tamponlar, jeller ve transfer yığınları kullanılarak optimize edilmiştir. Gerekli sarf tam listesi için Malzemeler Listesi'nde bakın.

I-Blot hızlı transfer ve LI-COR Odyssey görüntüleme sistemi kullanılarak Floresan WB protokolü

Numune hazırlanması 1.

1. Tampon seçimi / hazırlanması
   1. Örnek homojenizasyon için uygun bir ekstraksiyon tampon seçin ve tüm alt teknikleri kullanılacak olan ile tampon uyumlu olduğundan emin olun. Bir ekstraksiyon tamponu hazırlayın: RIPA tamponu (25 mM Tris-HCI (pH 7.6), 150 mM NaCI,% 1 NP-40,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS) izolasyonu örnek alınmadan önce% 5 bir proteaz inhibitör kokteyli ihtiva etmektedir.
      NOT: Burada ekstraksiyon tampon pek çok farklı türleri bulunmaktadır ve hücre içerisinde ilgilenilen proteinin yere bağlı olarak seçilir. Bunlara aşağıdakiler dahildir fakat olmadığındaRIPA tamponu (bütün hücre, mitokondri ve çekirdek bileşenlerinin) ve NP-40 lisis tampon maddesi (bütün hücre ya da zar bağlı) ve Tris-Triton ile sınırlıdır (sitoplazmik bağlı iskelet). Ancak, ekstraksiyon tampon içinde bazı kimyasal deterjanlar çözündürülmesi ya da hatta bir proteinin devre dışı bırakmak için yardımcı olabilir, fakat, örneğin, Bikinkoninik asit (BCA) deneyi, belirli bir protein belirleme deneyi kullanarak protein saptaması yapmak engelleyebilir. Deneyde kimyasal uyumluluk için üreticinin yönergelerine edin.
2. Protein ekstraksiyonu / çözünürleşme
   1. El kadar bir Dounce veya yaklaşık 01:10 / h (doku ağırlığı / tampon hacim), w hazırlanan ekstre tampon maddesi içinde bir polipropilen ucu ile bir elde tutulan elektrikli bir homojenleştirici kullanılarak homojenize ardından makas ve / veya bir bisturi bıçağını kullanarak doku numunesi yumuşatıp pürüzsüz / tutarlı homojenatında üretilmektedir.
      NOT: Daha küçük, / değerli zor örnekleri elde etmek için, deterjan bazlı ekstraksiyon can hala 1 aşağı etkili: 5.
   2. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj örnekleri homojenizasyon Gönderin. Gerekene kadar -80 ° C de çözünür proteinler ve deposu ihtiva eden üst sıvıyı çıkarın. Gerekirse daha sonra daha daha sıkı boşaltılmasına izin vermek için çözünmez pelet saklayın. Protein tayini adım 1.3 ile devam edin.
3. Protein belirlenmesi
   1. Bir BCA, Bradford ve benzeri deneyi kullanılarak her bir ekstre örnek içindeki protein konsantrasyonunu belirleyin. Standart eğri hesaplanırken, tespit etme oranı, R-kare değeri katsayısı, örneklerin ¹⁵ içindeki protein oranından en doğru tespiti yansıtıyor 0.99 eşit veya daha büyük olduğundan emin olun.
      Not: Tüm numuneler QFWB ile karşılaştırılan, aynı standart eğriye karşı test edilmelidir.
4. Örneğin hazırlanması
   1. Plan ve 2 aynı g için merdiven ve numunelerin yükleme sırasını kaydetmekels: yükleme kontrolü olarak transferi ve jel 2 jel 1. Zayıf veya kesin transferi ile oluşabilecek herhangi bir önyargı önlemek için sırayla kontrol ve "tedavi" örnekleri yükleyin.
   2. Her bir örnek için gerekli protein hacmi hesaplayın. Nöronal İZOLATLARINDA proteinleri tespit etmek için standart bir protein yükü 15 ug olduğunu. DH ₂ O ile 10 ul hacim, her bir numune yapın 2 dakika boyunca 98 ° C 'de, yükleme tamponu, girdap ve ısı 5 ul ekle.
   3. Bu ilgi doğru bandının belirlenmesine yardımcı olmak üzere bir rekombinant protein gibi bir pozitif kontrol örneği içerir. Ancak yanlış bantların noktası önlemek için üreticinin kullanım kılavuzu takip doğru pozitif kontrol örneği hazırlayın. Şekil 1'e bakınız.

Şekil 1. Positive kontrol seçimi. Bir deney için pozitif kontroller eklenmesi tespit etiketleme gerçek olduğunu onaylar. Ancak, dikkatli denetim deneysel örnekleri kullanmadan önce düzgün şekilde çalıştığından emin olmak için alınmalıdır. A) Füzyon proteini TREM 2 1 mcg / ml üreticinin kılavuzlara yüklenen, ancak veri sayfası ile 110 kDa çatışmaların gözlenen etiketleme moleküler tahmin 60-70 kDa kadardır. B), indirgeme maddesi ile eklenmesi ve inkübasyon sonrasında ağırlığı, füzyon proteini, etiketleme tahmin edilen molekül ağırlığı tespit edildi. Bununla birlikte, bu indirgeme işlemi, proteinin sinyal azalması gibi daha büyük bir protein yükü gerekli anlamına geliyordu.

Proteinlerin 2. Elektroforetik Ayırma

1. % 4-12 Bis / Tris Jelin hazırlanması (1.0 mm)
   Not: gradyan jelleri geniş bir molekül ağırlığı aralığı boyunca daha büyük bir protein ayırma üretmek için kullanılır.
   1. Seçin ve MES hazırlamakveya MOPS DH ₂ O. ile sulandırarak (tank başına 1 L) çalışan tampon MES tamponu kDa'lık temizleme bezleri şimdi ise işlem tampon maddesi, ancak 15 kDa altında düşük molekül ağırlıklı proteinlerin zayıf çözünürlüğe sahip olacak, 200 kDa, yukarıda daha yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin tespit edilmesi tercih edilir 3,5-160 olan proteinlerin daha iyi çözünürlük üretir.
   2. Jel ayak kapsar tarak ve bant şeridini çıkarın. Yavaşça 1 ml pipet kullanarak tampon ile çalışan kuyular yıkayın. Tamponu ile çalışan kuyu doldurun ve hiçbir kabarcıklar jel kalmasını sağlamak.
2. Jel hazırlanması ve yüklenmesi
   1. Tankına jeller yerleştirin ve tüm conta etkin çalışan sağlamak için çalışan tampon ile arası jel bölmesini doldurun.
   2. Daha sonra kuyulara jel, 1 ve jel 2. Yük birinci kuyuya her bir numune için 10 ul molekül ağırlığı standardı 3 ul ekle.
      Not: merdivenler dışında, jel, 1 ve jeli 2 aynı olmalıdır. Bu zorunludur thOdyssey görüntüleyici ve 700 kanal görünür olması için toplam proteinin leke kullanıldığında jel 2 için kullanılan önceden lekelenmiş moleküler ağırlık standardı olarak mavi ve görülebilir.
   3. Her iki jeller yüklendikten sonra, kalan çalışan tamponu ile deposunu doldurun ve kapağı sabitleyin.
3. Elektroforez
   1. "Çalışma" örnek elde etmek için, 4 dakika için 80 V jel düzgün bir şekilde poliakrilamid jel matrisi girer. Bundan sonra sırasıyla, ya da örnek Renk verici madde jelin dibinde görülebileceği kadar, 50 dakika süre ile 180 V gerilimi ve zamanını uzatır.
      NOT: Yüksek gerilimler kısa çalışma süreleri elde uygulanabilir. Bununla birlikte, bu jeller orta örnekleri hızlı sıcaklığında ¹⁴ artışa neden olduğu dış şerit örneklerinden daha çalıştırılır "gülen" jeller neden olabilir.

Yükleme Kontrol Gel 3. Total Protein Leke

1. Kullanarak kaset Release jel 2bir jel bıçak. Kuyuları ve jelin ayağı çıkarın. Yönünü yardım etmek için jel işaretleyin.
2. Bir kare Petri kabı (yaklaşık boyutu 12 x 12 cm) içine protein leke yaklaşık 30 ml süzün. Çözeltinin sağlanması tüm jel kapsayan, protein lekelerinin jel 2 yerleştirin ve leke, oda sıcaklığında, 1 saat, en az jel çalkalayın.
3. Protein leke süzün ve görselleştirme önce damıtılmış su içinde jel 3x yıkayın. Görselleştirmek için 6.3 adıma geçin.

4. I-Blot Yarı Kuru Hızlı Protein Transferi

Not: I-Blot makinesi kullanılarak protein transferi için gerekli olan bütün reaktifler, özellikle I-Blot yöntem için kullanılan ticari ürünlerdir ve Malzeme Listesi bulunabilir.

1. "Alt" transfer yığını hazırlayın. Folyo kapağı ve jel tanktan direkt çalışan tampon ile ön ıslak çıkarın. Damıtılmış su ile önceden ıslatılmış filtre kağıdı.
2. Adımı yineleyin 3.1 ve yer jel 1 üzerineHazırlanan "alt" transfer yığını.
3. Jel üzerinde ön-ıslak filtre kağıdı yatıyordu. Kabarcıklar katmanları arasında sıkışıp sağlamak için filtre kağıdı ve jel yuvarlayın.
4. Üst transferi yığından folyo kapağını çıkarın ve filtre kağıdı ve alt yığının üstüne üst yığını yatıyordu. Herhangi bir hava kabarcıklarını yok etmek için aktarım yığın "sandviç" yuvarlayın.
5. I-Blot makinenin kapağının üzerine transfer yığını kiti sünger yerleştirin. Sonra kapağı güvenli şekilde kapatır I-Blot makinede adanmış alan üzerine transferi yığın sandviç yerleştirin. I-Blot başlatın ve program 3 8.5 dakika transfer.
6. Düşük protein sinyal veya düzensiz yüksek varsa: düşük molekül ağırlıklı protein oranları yarı kuru "hızlı" aktarma yöntemini kullanırken, üreticinin transfer sürelerini test edin. Şekil 2'de görüldüğü gibi, ideal bir aktarım voltajı / saat kombinasyonunu belirlemek için aynı yük örneği tekrarlarını kullanarak basit bir iyileştirme protokol başlat .

Şekil 2. I-Blot. A kullanarak transferi) merdiven yüklü bir tek jel Optimizasyon ve üç tandem tekrarlar kemirgen beyin homojenatında 15 ug üç bölüme kesildi. Bir bölüm transfer değildi, bir (üreticinin yönergelerine göre) 7.5 dakika transfer ve 8.5 dakika boyunca biri oldu. Jel bölümler daha sonra 680 kanal kızılötesi görüntüleyicisi taranır ve nicel. B) Her jel artık protein içeriğinde farkı gösteren ölçüm değerleri grafiksel gösterimi 0, 7.5, ve 8.5 dakika sonra, Anında Mavi protein boyası ile boyandı transfer. Transfer süresi bir dakika daha yaklaşık olarak% 45 arasında ilave bir protein transferine neden unutmayın.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Proteinlerin 5. Antikor Algılama

1. Membran hazırlama ve bloke
   1. I-Blot makineden transferi destesini çıkarın. Alt Transfer yığını jel açığa üst ve filtre kağıdı katmanı kaldırın.
   2. Bir neşter ile jel etrafında kesin ve yönlendirme amaçlı bir üçgen kesim membran üzerinde temsil edilmesini sağlamak. Membran kırpma sonra protein transferi verimliliğini kontrol ve / veya atmak için jel leke.
   3. Hızla 1x 5 ml PBS içeren temiz bir 50 ml tüp (veya eşdeğeri haznenin) içine membran hareket eder ve sabit bir ajitasyon bir mekanik silindir (ya da orbital platform) üzerine yerleştirin.
      NOT: Bu membran kurumasına izin olmadığı önemlidir. Yarı kuru transferi sırasında zar sıcak olacak. Bu i sağlayacak şekilde aktarım yığınını açmadan önce 2 dakika bekleyint serin ve yığın sökümüne sırasında yavaş kuruma süresi. Yıkama ve inkubasyon sırasında çalkalama için bir silindir ve tüp kullanılması gerekmektedir çözümleri hacimlerinde önemli bir azalma sağlar.
   4. 1x PBS içinde membran 3 x 5 dk yıkayın. 1x PBS atın ve oda sıcaklığında 30 dakika içinde en az sulandırılmamış bloke edici tampon ile membran engeller.
2. Primer antikor terkibi.
   1. % 0.1 Tween20 ile, bloke edici tampon içinde 5 ml üreticinin yönergelerine göre birincil antikor hazırlayın. Sürekli çalkalama ile 4 ° C'de bir gece boyunca hazırlanan birincil antikor ile membran inkübe edin.
      NOT: tamponu Engelleme genelde sulandırılmadan kullanılır ama 1 kadar seyreltilmiş olabilir: 4 PBS ile birincil antikor yeterince yüksek özgüllük varsa.
   2. Birincil antikor atın ve 1 x PBS ile 5 dakika her biri için, membran 6 kez yıkayın.
3. İkincil antikor seçimi & hazırlık
   1. Seco İçinndary sadece yukarıdaki adımları 5.2.1 ve 5.2.2 ihmal ve örnek belirli bir ikincil bantlama kalıplarını belirlemek için 5.3 adıma geçin, kontrol amacıyla değerlendirme etiketleme. Şekil 3'e bakın.

İkincil antikor Şekil 3. Optimizasyonu. A), murin, 15 ug (M) karşı orta yalnızca spesifik olmayan etiketleme bir çok tür karşılaştırma Koyun (O) ve floresan çeşitli At (D), sinir doku homojenatları ikincil antikorlar etiketlenir . L molekül ağırlıklı bir basamağı ifade etmektedir. Koyun Doku homojenatı, eşek anti-keçi 800 antikoru. Oda kullanıldığında tek örnek, farklı bir doku numunesi kullanılıyorsa spesifik olmayan etiketleme oluşursa teyit edilmesi de önemlidir) ikincil etiketi ile çapraz reaksiyona olduğu, yani sıçangil gastroknemius kası (15 _6 g yük). Bu örnek çapraz fare beyin homojenatmı kullanırken ancak bu meydana gelmedi, eşek anti-fare 680 ikincil antikor ile reaksiyona girer.

2. Floresan% 0.1 Tween®20 ile tampon engelleme konsantrasyonları önerilen üreticisi takiben sekonder antikor 680 veya 800 (kırmızı veya yeşil kanal) etiketli hazırlayın. Sabit çalkalama ile oda sıcaklığında 90 dakika boyunca hazırlanan ikincil antikor ile karanlıkta membran inkübe edin.
3. İkincil antikor atın ve 1 x PBS ile yıkama başına 5 dakika için, dokunun 6 kez yıkayın. Görselleştirme - 6 adıma geçin.
   1. Uygun bir ek adım olarak ikincil antikor bir dizi belirteçleri görselleştirme olarak beklenen çalışma değilse, sınav merdivenler. Tüm ikincil antikorlar piyasada bulunan tüm basamaklarında tüm işaretleyici bantları görselleştirme izin.
   2. Beklenen bantlar görünür değilse, yani, donk alternatif bir ikincil host kullanmakkeçi anti tavşan karşı ey anti tavşan uygun bir protokol değişikliği temsil eder. Şekil 4'e bakın. Ikincil antikor geliştirmek için kullanılan Sunucu türler bazen nedeniyle kendine özgü primer antikorlar özgüllük eksikliği görselleştirme ile bir soruna neden olabilir.

Kemik yağ, kas, karaciğer ve - - Erk birincil antikor ile inkübe edilir ve üç farklı sekonder antikor ile inkübe Şekil 4. giderme ikincil antikor özgüllüğü dokusu örneğinden oluşan bir dizi için yapılan Western lekesi (şerit başına 15 ug protein).. Üst panel: LI-COR keçi anti-tavşan ile 680 ikincil antikor DB yağ ve kemik zayıf etiketleme üretilen sinyal, karaciğer, kas örneklerde tespit edildi. Orta panel: Membran (üst panelden) elimden ve repr edildiİkincil bağlantılı ECL metodoloji ve Keçi anti-tavşan HRP kullanılarak obed. Gruplar kas ve karaciğer örnekleri şimdi görebilir ve etiketleme yağ ve kemik örneklerinde daha yoğun görünür. Alt panel: (üst ve orta panelden) Membran, sıyrılmış ve LI-COR Eşek anti-tavşan ERK Birincil antikor için daha büyük bir afiniteye göstermiştir 680 sekonder antikor kullanılarak yeniden sondaj edildi. Kas ve karaciğer için Etiketleme şimdi yağ ve kemik iki numuneden artmış sinyal yoğunluğu ile görülebilir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

6. Görselleştirme

NOT: Tüm görüntüler LI-COR Odyssey Klasik görüntüleyicisi ve ilişkili Image Pro analizi yazılımı (versiyon 3.1.4) kullanılarak elde edilir.

1. Çevirin ve bilgisayar ve görüntüleyici oturum açın. Görüntüleme yazılımı açın ve yeni bir dosya oluşturun. Şekil 5'e bakınız.

: fo "jove_content"
Şekil 5. Görselleştirme ve western blot ölçümü. Murin gastrokinemius kası (30 ug yük) gösteren bir Western lekesinin tarama Annexin V birincil antikor (36 kDa) ve keçi anti-tavşan 800 ikincil antikor ile problanmıştır. Zar taranır ve 800 kanal görselleştirildi. Protein (Annexin V) ölçmek için, bir dikdörtgen kutu Bu, daha sonra kopyalanabilir ve aynı bölgede ölçümü sağlamak için geri kalan numune çizgilerinin üzerine yapıştırılır örnek 1. ilgi bant olarak çizilir. Arka plan otomatik olarak çizilmiş bir şekil çevresinde oluşturmaktadır, ancak bu doğru şekilde tanımlandığı plan ölçümü sağlamak için değiştirilebilir. Aşağıdaki tablo çıkarılır arka plan ile elde edilen toplam sinyal, arka plan ve sinyal dahil olmak üzere çekilen her şeklin sayısal ölçümleri görüntüler. Bu bilgiler daha sonra bir ihraç edilebilirelektronik tablo programı (nispi floresan yoğunluğu tarafından belirlendiği gibi) ifade oranlarını hesaplamak ve sonraki istatistiksel analizler yapılmasına olanak sağlar. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Görüntüleyici kapağını açınız. Sol alt köşesinde cama 1x PBS dökünüz ve daha sonra PBS üstüne membran yerleştirin. Zarın, zar ve ızgara ekseni arasında kalan görüntüleyici üzerinde eksen ve bir 1 cm aralıklı kare olduğundan emin olun.
   1. Baloncuklar cam ile membran arasında sıkışıp sağlamak için membran döndürün.
   2. Membran, x ve y ekseni üzerinde kapladığı kareler sayısını. Görüntüleyici kapağını kapatın. Membran bilgisayar yazılımı kapladığı kareler numarasını girin.
   3. Floresan etiketi bağlıdır membran tarama uygun kanalı seçinİkincil antikor, yani, 700 kanalı ya da 680 ya da 800 floresan etiketli antikor, sırasıyla kullanılmaktadır 800 kanalı. Çift etiketli bir biçimde gerçekleştirildiği zaman, her iki kanal tarama.
      NOT: önce ikili etiketleme yürüten tek bir protein etiketleme Optimize.
   4. Bir yüksek bolluk protein, düşük yoğunluklu tarama kullanırsanız, membran tarama yoğunluğunu seçin. Primer antikor ilgi protein daha yüksek bir yoğunluk tarama seçmek zayıf afinite sahip Alternatif varsa, yani, seviye 5. Taramayı başlatmak başlar. 6.4 adıma geçin.
3. Yükleme kontrol jel görselleştirilmesi (Şekil 6).
   
   Panel A Şekil 6. Toplam protein etiketleme ve analizi. A) şeritli. B başına at servikal ganglion homojenatın 20 mikrogram içeren toplam protein etiketli jel Fotoğraf) Jeltoplam protein lekeli jelden nicel ölçümlerin 680 kanal. C) Grafik taranan görüntüleme yazılımı kullanılarak elde. Moleküler ağırlık belirteçleri ile belirlenen ölçüm aralığı, yani, 30-110 kDa standart hata sağlamak için ölçümler histogramını sunmak için alınır (SEM), her numunedeki toplam protein düzeyi ile aynı olacak şekilde gösteren (gruplandırılmış örneklerin) düşüktür jel üzerinde. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   1. Takip 6.1 ve 6.2 adımları.
   2. Izgara eksen başlar görüntüleyici alt köşesinde cam üzerine distile su dökün.
   3. Su üstünde jel yerleştirin ve böylece şerit x veya ızgaranın y ekseni ya da diktir manevra. Izgaranın y ve x ekseni ve jel arasındaki bir 1 cm boşluk boş ve jel kılavuz ekseni kapladığı kare sayısını sayar. Yakıngörüntüleyici bir kapak.
   4. Jel bilgisayar yazılımı kapladığı kareler numarasını girin.
   5. Toplam protein lekeli jel taramak için 700 kanalı seçin.
      Not: Mavi 700 kanal ışıldamaktadır.
   6. 5 ve basın başlangıç ​​yoğunluğunu ayarlayın.
4. Taranan görüntünün sayısallaştırılması
   1. En iyi görüntü kalitesini elde etmek için parlaklık ve kontrast düğmeleri ayarlayın. Yüksek arka plan gürültü olduğu ortaya çıkarsa, düşük yoğunlukta zarı yeniden taramak ve yüksek kaliteli tarama ayarını kullanın.
      NOT: Herhangi ayarlamalar tararken edinilen floresan verileri değiştirmez.
   2. Edinilen verilere hiçbir değişiklik ile istenilen yönde görmek için görüntüleri 90 °, 180 ° ve 270 ° döndürün. Fazla 3 ° "serbest dönme" yönelime küçük ayarlamalar, yaparken Ancak pixilation değerlerinde elde edilen veriler bozuk olabilir ve böylece ölçüm sonuçlarını etkileyebilir.
   3. Şekiller menüden bir şekil seçin - çoğu durumda bir dikdörtgen kullanın - ve ilgi bandında (WB) veya numune şeritte 1 tüm kulvarda (toplam protein jel) çizin.
   4. Kopyala ve faiz veya tüm sokağın örnek şeritli 2 bant üzerinden şekil yapıştırın. Her bir örnek için ilgi her bant ve toplam protein jeller için her sokağın tekrarlayın.
   5. Arka plan ölçüm sonraki şeritte bir sinyal dahil olmadığını kontrol edin. Arka planda otomatik olarak yazılım tarafından kesilir ve çizilen şeklin etrafında tüm kenar kapsayacak ya da alt / üst veya sol ve şeklin doğru olması için belirtilebilir olabilir. Alternatif olarak, bir kullanıcı tanımlı arka plan kutusunu belirler.
   6. Keyfi floresan birimlerinde çekilen her şekil için şekiller tablo için sinyalini görüntülemek. Arka planda otomatik olarak sinyal düşülecektir.
   7. Farklı yazılımlar görüntülemek için TIF dosyası olarak görüntü ihracat. Görüntü ihracat ve USI manipüle etmeyinBu gibi ng olmayan görüntü pro yazılımı yanlış veri üreten kamera tarafından edinilen özgün verileri değiştirecektir.
   8. Adımları tekrarlayın 6.4.3-6.4.7 çift etiketleme ölçülmesini veya üretmek ve standart hata verileri harmanlamak için yükleme kontrol jeller üzerinde çoklu ölçümler yaparken.

7. Mesaj Görselleştirme

1. 1x PBS membranlar tutmak veya gelecekte yeniden sondalama ve diğer ilgi proteinlerin için membranların sıyırma için uzun süreli depolama için kurur.
2. Sıyırma ve membranların yeniden sondalama. Şekil 7 bakınız.
   
   Şekil 7. Membran sıyırma ve reprobing. Kızılötesi görüntüleme sistemi. A ile taranan çeşitli sıyırma adımları takip zarlarının temsili örnekleri. İlk immunodeteksiyon CSP birincil antikor (tavşan) ile gerçekleştirilir ve 7 tarandığı00 kanal. B. İlk sıyırma ve 800 kanal ile Rock2 (tavşan) ile reprobing. Turuncu ok şerit ve yeniden-prob sonra mevcut CSP birincil antikor kaldığını gösterir. Bant, yüksek bir moleküler ağırlığa (beyaz ok). C'de bulunduğundan, bu Rock2 ölçümünü etkilemez. Ikinci sıyırma ve 800 kanal. D β-spektrin antikor (keçi) ile yeniden sondaj ve görsel. Üçüncü sıyırma ve α-sinüklein antikor (tavşan). E reprobing. Dördüncü soyma ve 800 kanalı ile ubikitin antikoru (fare) ile reprobing. Son antikor kalan sinyal hala var (α-sinüklein. Turuncu ok). F. Beşinci sıyırma ve 700 kanalında görüntülenmiştir CALB2 antikor (tavşan) ile reprobing. Kullanılan ikincil antikorlar: keçi anti-fare 800cw, keçi anti-tavşan 680rd, keçi anti-tavşan 800cw, eşek anti-keçi 800cw (Malzeme listesi). Lane etiketler: L - merdiven, 1/260; - örnek 1/2. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   1. Revitablot sıyırma tamponu, yaklaşık 30 ml içeren ve sürekli çalkalama ile, oda sıcaklığında 5-20 dakika arasında kuluçkalanır kare Petri tabağına yerleştirin zar (lar).
   2. Oluştu zar (lar) PBS içinde 3 kez yıkanmış, sonra flüoresans tam olarak çıkarılmasının sağlanması için görüntüleyici üzerinde yeniden taramak yıkayın - bu aşama, her şerit sonra tekrar edilmelidir.
   3. Floresan kalırsa daha uzun süreler için membran (ler) inkübe edin. Kalan ikincil sinyal olduğunu onaylamak için her şerit sonra membran yeniden tarayın.
      Not: Membran (ler) i yalnızca sıyrılmış ve zarın bütünlüğünün oranını sinyallemek için arzu edilmeyen yüksek bir arka plana neden tehlikeye olmadığını garanti etmek için 3 kez fazla yeniden sondaj olmalıdır.

Sonuçlar

QFWB duyarlılık ve algılama doğrusal aralığı geleneksel ECL algılama daha büyük olduğu, dolayısıyla etkili yorumuyla yardım doğru veri toplanması sağlamak için önemli olan kontrol tedbirleri, bir dizi vardır. İlk olarak, pozitif kontrol numunelerinin dahil Şekil 1 'de gösterildiği gibi. İkinci olarak, transfer optimizasyonu membrana jelden yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin denk hareketini garanti altına almak için, Şekil 2'de sergilenen. Üçüncü olarak, antikor optimizasyonu, özellikle orta kimin optimizasyonu genellikle gözden kaçan, ancak antikorlar ilgi protein (ler) doğru yorumlanması ile müdahale edebilen bantlama non-spesifik üretebilir. Şekil 3'e bakın. Dördüncüsü, o da olabilir davayı bir protein saptanamayan görünür ama mevcut olması bekleniyor zaman, bu da sadece ikincil Rais kullanılarak düzeltilebilir ikincil antikor sorunu olabilir kifarklı bir tür konak ed. Şekil 4'e bakınız. Beşinci olarak, toplam protein etiketleme ve analizi her yerde bulunan bir dahili referans standartları ³ olarak ifade edilmiştir geleneksel tek protein (ler) in kullanımı ile karşılaştırıldığında, çok daha sağlam ve ölçülebilir bir yöntemdir. Bu tür tek proteinlerin bir çok farklı şekilde, nörodejeneratif hastalıkların model yanı sıra arasında farklı doku örneklerinin ifade edildiği tespit edilmiştir ve ifade homojenliği, aynı doku ³ olan değiştirilebilir. Standart hata göstermek için karşılaştıran ve her numune karşı ölçülen, çeşitli molekül ağırlıkları aralıkları, her bir şeritte protein yükü miktarının bir toplam protein analizi ile birlikte, Şekil 6'da gösterildiği gibi, Bu nedenle, yükleme kontrol jel üretim örneği yükün homojen teyit edecektir . Önemlisi, bu sorun giderme teknikleri ve tüm denetimleri sadece analiz t duyarlılığı ve tutarlılığı kadar etkilidiroperatör (Şekil 5) tarafından uygulanan ools. Son olarak, bu teknik, soyma ve bağlı faktörler de dahil olmak üzere, ancak, uzun süreli depolama koşulları altında artan bir hassasiyet, azaltılmış arka plan, iki renkli algılama ve zar stabilitesi bunlarla sınırlı olmamak üzere, ECL daha fazla esneklik membran yeniden sondalama için çok uygundur. Şekil 7 bakınız.

Tartışmalar

Nedeniyle göz ve planlama, herhangi bir deney öncesinde esastır ve sonuçta kullanılan tekniğin başarısını belirlemek olabilir. Uygun antikorlar, transfer ve görüntüleme yöntemleri kullanmayı tercih çalışırken potansiyel engellerden bir bolluk sunabilir WB kullanarak protein algılama gelişmeler. Neyse ki, protein varlığı ve örnekler arasındaki giderek ince anlatım farklılıkları belirlemek için rutin olarak kullanılabileceği QFWB dikkatli bir kontrol listesi ve uygun kontrol önlemleri kullanarak. Bu protokol önlemek ve / veya onunla ilişkili birçok ortak tuzaklar bazılarının üstesinden gelmek için floresan nicel batı lekeleme yanı sıra birkaç sorun giderme stratejileri kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Duyarlılığı korumak ve elde etmek için kullanılan kritik adımlar gerçekten ölçülebilir ve karşılaştırılabilir ölçümler şunlardır: doku örneklerinden 1) sağlam protein izolasyonu; 2) numune hazırlama; 3) doğru bir proteini loading toplam protein analizi ile belirlendi; Ben-Blot kullanarak proteinlerin 4) Optimal transfer; Bir termal görüşleri ve ilgili yazılım kullanılarak,% 0.1 Tween20 içeren bloke edici tampon içinde birincil ve ikincil antikorlar 5) hazırlanması, ve 6) doğru görselleştirme ve analiz.

Kızılötesi floresan algılama gerçekten kantitatif ve daha geleneksel ECL algılama tekniklerle ^3,11 ile karşılaştırıldığında daha fazla hassasiyet sağlar. Bu algılama sistemi çok yüzlü olan ve bu nedenle QFWB sınırlı değildir. Bu sistem, tam doku bölümleri ¹² görselleştirme ve sayılmasına olanak tanıyan düşük güçte immünohistolojik etiketleme görüntüleme yeteneğine sahiptir. Bu nicel değerlendirme açısından geleneksel mikroskopları ile geleneksel immunofloresan yakalayan rakip kadar kırmızı görüntüleme görebiliyordu çözünürlük açısından gelecekteki potansiyel gelişim bir alandır.

Bununla birlikte, p içerisindeki hafif değişiklikler, daha büyük hassasiyet ileminimum ve kontrol önlemlerine tutulur ifade bu çeşitliliği sağlamak açısından önemli olduğunu rotein sağlam protokolleri ile sıkıdır. Bu örnek yükleme düzgün, algılama gerçek ve ilgili üreticinin kullanım kılavuzu test aktarmak için olup olmadığını belirlemek için, birincil ve ikincil antikorlar optimizasyonu olduğu güvence sağlamak için toplam protein lekeli jellerin üretimi ve ardından bu doku örneğinin titiz protein ekstre etme ile başlar Zaman verimli protein transferini elde etmek.

Yine de, WB koşulları optimize edilmiş bile, hala sorunlar tam burada keşfedilmiş olmayabilir western'lerine çalışan ile orada ilişkili olabilir. Bunlara aşağıdakiler dahildir fakat Protein çözünmüş ve ekstraksiyon tamponu seçimi dahil çeşitli faktörlere bunlarla sınırlı değildir. Bazı tampon protein konsantrasyonu deneyleri engelleyebilir ve bazı dokular gibi otomatik MACERA kullanılması gibi daha sağlam teknikler gerektiren, çözünür hale getirmek için özellikle zordurting böyle bir Mac'ler dissociator ile birlikte M tüpler gibi kapları kapalı. Buna ek olarak, -80 ° C'de ayıklanır ve non-çıkartılan malzemenin depolanması için basit kontrol tedbirleri hemen çekimi sonrası optimum etiketleme elde edilmesi ve kötü sonuç hafta sonra olması arasında fark olabilir.

Modern QFWB yöntemleri protein ifadesindeki ince farklılıkları yakalamak için daha duyarlı olduğu kanıtlanmış ve bu ECL gibi eski tekniklere göre daha çok yönlü eşzamanlı ikili etiketleme ³ izin veriyoruz. Bu batı lekeleme protokolleri sağlam ve doğru ölçümü ve istatistiksel analiz için kolayca tekrarlanabilir olmaları önemlidir. Bu protokol, farklı doku örneklerinin ve türler ³ çeşitli boyunca proteinlerinin tespiti için rutin olarak kullanılacak yeterince hassas ve sağlamdır ve bu nedenle deney ^{1 'deki} sarf malzemesi kullanımını hem de süresini azaltmak, aynı QFWB içinde düşük ve yüksek bolluk proteinlerin ölçülmesine olanak sağlar. ^9,14 Ancak hassasiyeti bu şekilde hatalı veri toplama kaçınarak uyulması gereken önemli ve uygun kontrol önlemlerinin dahil edilmesi omic çalışmaları - 1 Buna ek olarak, bu tekniğin artan duyarlılık giderek popüler doğrulama sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
RIPA Buffer	Fisher Scientific UK Ltd	10230544
M Tubes	Miltenyi Biotec Inc.	130-093-236
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Life technologies, UK	IB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)	Life technologies, UK	LC5602	Use in gel 1 for Western blotting
SeeBlue Pre-stained protein standard	Life technologies, UK	LC5625	Use in gel 2 Total protein stained gel
NuPAge LDS Sample buffer 4X	Life technologies, UK	NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)	Life technologies, UK	NP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well	Life technologies, UK	NP0322BOX
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET	Sigma-Aldrich, UK	P4417-100TAB
Micro BCA, Protein Assay Kit	Fisher Scientific UK Ltd	10249133
Odyssey  blocking buffer	Li-Cor Biosciences	P/N 927-40000
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg	Li-Cor Biosciences	926-68071
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg	Li-Cor Biosciences	926-68072
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg	Li-Cor Biosciences	926-32211
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg	Li-Cor Biosciences	926-32214
ODYSSEY CL Infra-red imager	Li-Cor Biosciences		Call for quotation
iBlot 7-Minute Blotting System	Life technologies, UK		This model is no longer in production
InstantBlue Protein stain	Expedeon, UK	ISB1L
Revitablot western blot stripping buffer	Rockland Immunochemicals Inc.	MB-085-0050