Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Özet

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Özet

Geliştirme, rejenerasyon okuyan ve hastalık hücre ayrışma ve RNA, DNA ve protein saflaştırılması için erişkin kalplerinde kullanımına doğru genişleyen için zebra balığı model sistem kullanımı. Bu uygulamaların hepsi düzenleyici geni, metabolik ve ölümden sonra başlar diğer değişiklikleri önlemek için zebrabalıkları kalplerin önemli sayıda hızlı iyileşme talep. Yetişkin zebrabalıkları kalpler de mutantların çeşitli kalp yapısını incelemek için ve kalp rejenerasyonu çalışmak için gereklidir. Ancak, geleneksel Zebra balığı kalp diseksiyon yavaş ve zor ve yetişkin zebrabalıkları kalplerin büyük ölçekli diseksiyonu sıkıcı hale özel araçlar gerektirir. Geleneksel yöntemler de diseksiyonu sırasında kalp zarar riskini barındırır. Burada, biz, hızlı, tekrarlanabilir ve kalp mimarisini koruyan yetişkin zebrabalıkları kalplerin diseksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem özel araçlar gerektirmez, Zebra balığı için ağrısızcan taze veya sabit örnekler üzerinde yapılabilir, ve bir aylık gibi genç zebrafish yapılabilir. açıklanan yaklaşım kardiyovasküler araştırma için yetişkin zebrafish kullanımını genişletiyor.

Giriş

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protokol

NOT: Her zaman IACUC veya etik kurul onayı zebrafish kullanarak herhangi bir deneysel prosedür başlamadan önce yerinde olduğundan emin olun.

1. reaktifler ve kurulumu hazırlayın

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Standart zebrabalıkları kılavuzları ¹⁰ bu çözümlerin tüm tarifleri bulun.
   • Yumurta 500 ml su
   • Yumurta Su 0.03% Tricaine 200 ml
   • 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu su, 100 ml (PBS)
   • RBC Lizis Tamponu (isteğe bağlı)
   • Buz üzerinde 1.5 ml mikrofüj tüpe tercih edilen hedef tamponu (sabitleyici olarak Trizol PBS, vs.)
     NOT: Deri ile temas halinde Fiksatif ve Trizol zehirlidir. Bu maddelerin tutarken eldiven giyin.
2. Diseksiyon kurulumu hazırlayın:
   1. Mikroskop üzerinde boyun ışık kaynağı yerleştirin. Diseksiyon mikroskop sahnede 9 cm Petri kabı kapağını yerleştirin ve içine 1x PBS ince bir tabaka dökmeko (çanak kendisi kolay bir diseksiyon için çok derin olduğu için kapak kullanılır).
   2. Diseksiyon kapsamı yakın tezgah üzerinde Petri kabı kendisi (değil kapak) yerleştirin ve o 1x PBS yaklaşık 15 ml dökün. Diseksiyonu sonrası kalbi yıkamak için kullanın. Alternatif olarak, RBC Lizis Buffer kullanın.
   3. Yer jilet, iki forseps, microscissors (isteğe bağlı) çiftleri, ve mikroskop yanında bir transfer pipet. Hızlı soğutma ile ötanazi seçilirse, bir buz kabı elde edilir.
   4. Tricaine ile ötanazi seçilirse, 250 ml'lik bir cam kabın içine yumurta su içinde% 0.03 Tricaine 200 ml dökün. Zebra balığı karkasların imhası için küçük bir biyolojik tehlike çanta hazırlayın.

2. Zebra balığı hazırlayın

1. Sabit balık için, mikroskop kurulum, PBS içinde durulanır sabit balık, getir.
   1. > 10 dakika boyunca buz ile hızlı soğutma ile bütün yetişkin zebrafish öldürülür.
   2. Periton üzerinde deri bir delik yapmak için forseps kullanın(Kalp uzak) fiksatif nüfuz etmesini sağlamak ve daha sonra, 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile düzeltme Tampon ¹⁰ içinde% 4 paraformaldehid içinde koymak.
2. Alternatif olarak, taze balık için yer balık küçük tutma tankında ötenazi edilecek ve mikroskop kurulum getirmek. Bireysel tesisin balık protokolü ve disseke balık kalpleri için mansap kullanımları bağlı, Tricaine ile balık uyutmak veya dekapitasyon önce hızlı soğutma ile euthanize.
   1. Balık durana kadar, buzlu suda balık net ve yerinde yaklaşık 5 dk bir balık pick up, buz kullanmak için.
   2. Alternatif olarak, solungaç hareketleri durana kadar çözümün beher balık ağı ve yer ile bir balık pick up, Tricaine kullanmak için.
3. Hızla kuyruk yüzgecinin tarafından ötenazi balık almak ve 1x PBS ile doluydu Petri kabı kapağındaki yan yatıyordu. Razo kullanırken, bir yandan bir göğüs yüzgeci kaldırmak için forseps kullanınr bıçak sadece göğüs yüzgeci (Şekil 1A) bağlanması için posterior, diğer elinizle balık başını kesmek için. Mikroskop aracılığıyla bakarak ya da sadece doğrudan mikroskop sahnede balık görselleştirerek ya bu adımı gerçekleştirin.
   NOT: Taze ötenazi balık hala dekapitasyon sonra kanayacak.

Şekil 1. Zebra balığı kalp diseksiyon yetişkin zebrabalıkları anatomik yerlerinden kullanır. (A), balık başını kesmek bir forseps ile göğüs yüzgeci kaldırın ve gösterildiği gibi kırmızı noktalı çizgi boyunca keskin, temiz jilet kullanmak için. (B), balık kafası kararlı balık ağzı süre forseps bir tine yerleştirmek için Diğer tine göz genelinde yatıyor, ve ventral yüzeyi yukarı ve forseps iki dişler Petri kabı dibine kararlı olduğunu böylece daha sonra balık kafasını çevirin. (C) serbest forc kullanıneps operculum'un (ok). (D) bu Kaldırma eki kesmek için, dorsal aort lümen kan (ok) gösteren bir pembe şeritli beyaz bir yapı olarak görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Kalp teşrih

1. Mikroskop altında balık kafası gözünüzde canlandırın. Diğer tine göz (Şekil 1B) karşısında, baş dışında iken bir forseps ile, beynin aracılığıyla, balık ağızda forseps bir tine koyarak balık başını kararlı. Forseps iki dişler petri alt karşı kararlı olduğundan emin olun. Balık kafasını bu şekilde tutarak, ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde olmalıdır.
2. Diğer elinizle, vücudun (Şekil 1C ok) için operculum'un ventral eki kesmek için ikinci forseps kullanabilir. Forseps ile biraz bu kaldırma dORSAL aort aort lümen (Şekil 1D ok) kan kırmızı şeritli beyaz bir yapı olarak altında görünecektir. Aort kısma ve yukarı doğru çekerek forseps ile dorsal aorta kesin; Alternatif olarak, sırt aorta kesmek için Microscissors kullanır.
3. Şimdi, fin dibinde vücut kıkırdak dahil olmak üzere, tabanından göğüs yüzgeci kavramak için ikinci forseps kullanımı, ve bu kaldırın. Diğer göğüs yüzgeci ile tekrarlayın. Bazen, kalp göğüs yüzgeçleri ile geliyor, bu yüzden kalp onları atılmadan önce takılı olmadığından emin olmak için bu parçaları incelemek.
   NOT: (zaman zaman göğüs yüzgeçleri ile kapalı geliyor olsa da) bu noktada, kalp, görünür hala bozulmamış ve kalan balık kafasına bağlı olmalıdır. Kalp şekli, onun pembe renk ve pigmentli perikard ile çevrili varlık tarafından tespit edilebilir. Balık ötenazi hızla yapılır, çünkü taze balık ötenazi kalpleri hala SLO yenerek olabilirWLY.
4. Her iki el forseps tutun ve ücretsiz böylece, ilk forseps ile balık kafa gidelim. Uzakta perikarttan kalp kızdırmak için her iki forseps kullanın. Kalan perikard uzak çekilirken dorsal aorta geri kalan kalbi kavrayın.
   NOT: Sabit veya taze olsun, kalp çevreleyen bağ dokusu daha gevrek iken çekerek nazik sağlam olduğunu. Bu nedenle, herhangi bir çevreleyen perikard dokusu bozulmamış kalp kalan uzak disseke edilebilir.
5. Biohazard çanta içinde kalan balık karkas atın.

4. Alt Uygulamaları için Kalp hazırlayın

1. Forseps kullanarak, dorsal aorta / bulbusu arteriosusun kenarında kalp kavramak ve 1x PBS taze çanak kalp yerleştirin. Seçenek olarak ise, bir transfer pipeti kullanılır. Ileri ve geri PBS içinde kalp Taşı yaklaşık 10x mümkün olduğunca çok kan yıkayacak için.
2. Uygulamalar için her possib kaldırmak için önemli olduğule kan hücreleri, aynı arka ve ileri-hareketi ile yerine 15 ml PBS RBC Lizis Tamponu ile 9 cm'lik bir Petri kabındaki yıkayın. Kalbin yapısını koruyarak (örneğin, RNA yapma), kalp boşluğunu açın ve uzak kan hücrelerinin durulama kolaylaştırmak için forseps veya Microscissors kullanmak alt uygulama için önemli değilse.
3. Ayrı kalp odaları istenilen edildiği uygulamalar için, birbirinden bulbusu arteriozus, atrium ve ventrikül incelemek için forseps veya Microscissors kullanın.
4. Buz üzerinde hedef tampon kalp, ya da ayrı ayrı odaları, aktarın.
   NOT: Ortak hedefler hücre ayrışma,% 4 paraformaldehid veya Trizol için tamponlar bulunmaktadır.

Sonuçlar

Bu yöntem kullanılarak, bir yetişkin, zebra balığı, kalp, geleneksel yöntemler kullanılarak ⁸ üzerinde 5 dakika ile karşılaştırıldığında, en az 1 dakika içinde parçalara edilebilir. Geleneksel yöntemler ⁸ perikard içine körü körüne kesme ve bu nedenle yaygın atrium veya bulbus arteriozus (Şekil 2B) hasar veya kaybına neden gerektirir ise, bu yöntem kullanılarak disseke Kalpler, (Şekil 2A) güvenilir sağlam. Parçalara Kalpler yapısa...

Tartışmalar

Yetişkin zebrabalıkları kalp kesme yöntemleri tarif edilmiş olmasına rağmen, bu yöntemler zaman alıcıdır ve genel olarak Diseksiyon sırasında kalbin hasar görmesine neden oldu. Yetişkin kalpte çok sayıda gerekli olabilir deneyleri gerçekleştirmek için, ve / veya kalp dokusu bozulmasını önlemek alt baş uygulamalar için önemli olduğunda, geleneksel diseksiyon teknikleri kullanılarak gereken süre engelleyicidir. Benzer bir şekilde, yeniden üretilebilir, hasarsız sağlam kalpleri elde kalp ya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional