Восстановление взрослых данио сердца для высокой пропускной приложений

Резюме

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Аннотация

Использование данио модели системы для изучения развития, регенерации и болезнь расширяет к использованию взрослых сердцах клеточной диссоциации и очистки РНК, ДНК и белков. Все эти приложения требуют быстрого восстановления значительного числа данио сердца, чтобы избежать ген регулирования, метаболические и другие изменения, которые начинаются после смерти. Взрослых данио сердца также необходимы для изучения структуры сердца для различных мутантов и для изучения регенерации сердца. Тем не менее, традиционный данио сердце рассечение медленно и трудно и требует специальных инструментов, что делает крупномасштабное рассечение взрослых данио сердца утомительным. Традиционные методы также питают риск повреждения сердца во время вскрытия. Здесь мы опишем метод рассечения взрослых данио сердца, которое быстро, воспроизводимым, и сохраняет сердце архитектуры. Кроме того, этот метод не требует специальных инструментов, является безболезненным для рыбок данио,может быть выполнена на свежих или фиксированных экземпляров, и может быть выполнена на рыбок данио, как молодой, как один месяц. Описанный подход расширяет использование взрослых данио сердечно-сосудистых исследований.

Введение

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда быть уверены, что утверждение IACUC или комитет по этике на месте перед началом любой экспериментальной методике, используя данио.

1. Подготовьте реактивы и настройки

1. Подготовьте следующие решения. Найти рецепты для всех этих решений в стандартных данио пособий ^10.
   • 500 мл Яйцо воды
   • 200 мл 0,03% Tricaine в яйце воды
   • 100 мл 1x фосфатно-солевом буфере (PBS)
   • РБК лизис буфера (по желанию)
   • Направление буфера выбора (фиксатор, Trizol, PBS, и т.д.) в 1,5 мл пробирке на льду
     ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксатив и Trizol являются токсичными, если они вступают в контакт с кожей. Надевайте перчатки при работе с этими веществами.
2. Подготовка установки рассечение:
   1. Расположите источник гусиная шея света над вскрытии микроскопом. Поместите крышку в 9 см чашки Петри на стадии вскрытии микроскопом, и залить тонким слоем 1x PBS вэто (крышка используется потому, что сама по себе блюдо слишком глубоко для легкого вскрытия).
   2. Поместите саму чашку Петри (не крышки) на столешницу вблизи рассекает рамки и влейте примерно 15 мл 1x PBS в нем. Используйте это, чтобы вымыть сердце после вскрытия. Кроме того, использование РБК буфера для лизиса.
   3. Место лезвие бритвы, две пары щипцов, microscissors (опционально), и пипетки рядом с микроскопом. Получение контейнер льдом, если эвтаназии путем быстрого охлаждения выбирается.
   4. Залить 200 мл 0,03% Tricaine в яйце воды в стеклянном стакане 250 мл, если эвтаназия по Tricaine выбран. Подготовьте небольшую биологическую мешок для утилизации данио туш.

2. Подготовьте данио рерио

1. При фиксированном рыбы, довести фиксированный рыбу, промытую в PBS, в зависимости от настроек микроскопа.
   1. Эвтаназии весь взрослых данио при быстром охлаждении льдом в течение> 10 мин.
   2. Используйте пинцет, чтобы сделать отверстие в коже в течение брюшины(От сердца), чтобы помочь проникновению фиксатора, а затем поместить их в 4% параформальдегид в Фикс буфера ¹⁰ в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С.
2. Кроме того, для свежей рыбы, рыбное место, чтобы быть умерщвлены в небольшом бак и довести до установки микроскопа. В зависимости от протокола рыба отдельного объекта и ниже по течению использования для расчлененных рыбы сердца, обезболить рыбу с Tricaine или усыпить быстрым охлаждением до обезглавливания.
   1. Чтобы использовать лед, подобрать одну рыбу с сетью рыбы и место в ледяной воде, пока рыба не перестает двигаться, примерно 5 мин.
   2. Кроме того, чтобы использовать Tricaine, подобрать одну рыбу с чистым и место рыбы в стакане раствора до движения жаберных упора.
3. Быстро подобрать эвтаназии рыбу ее хвостового плавника и положите ее на бок в посудомоечной крышкой Петри, которая была заполнена с 1x PBS. Используйте пинцет, чтобы поднять грудного плавника с одной стороны, при использовании RAZOR лезвие, чтобы обезглавить рыбу с другой стороны, просто позади прикрепления грудного плавника (рис 1А). Выполните этот шаг либо, глядя в микроскоп или просто напрямую визуализации рыбу на столике микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свежий эвтаназии рыбы будет по-прежнему кровотечения после обезглавливания.

Рисунок 1. Данио рерио взрослых сердце рассечение использует данио анатомические ориентиры. (), Чтобы обезглавить рыбу, поднимите грудную плавник с пинцетом и использовать острый чистый лезвие вдоль красной пунктирной линии, как показано на рисунке. (B), чтобы стабилизировать голову рыбы, положите одну зуб щипцов в рот рыбы время Другое зубцы лежит через глаза, а затем поверните голову рыбы, так что вентральной поверхности и обе лапы щипцов устойчивы по отношению к нижней части чашки Петри. (C) Используйте бесплатную ForcEPS сократить крепление крышечки (стрелка). (D) Подъемные это, спинной аорты видна в виде белой структуры с розовой полосой, обозначающей просвета кровь (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

3. Проанализируйте Сердце

1. Представьте голову рыбы под микроскопом. С одной щипцов, стабилизировать голова рыбы путем размещения один зубец из щипцов во рту рыбы, через мозг, а другой выступ находится вне головки, через глаз (Фиг.1В). Убедитесь, что оба зубья пинцетом устойчивы к нижней части чашки Петри. Проведение голова рыбы таким образом, его вентральной поверхности должна быть обращена вверх.
2. С другой стороны, использовать второй пинцет, чтобы сократить брюшной крепление крышечки к корпусу (стрелка, рис 1в). Подъемные это немного пинцетом, dorsal аорты появится под в виде белой структуры с красной полосой крови в просвет аорты (стрелка, рис 1D). Отрежьте спинной аорты с помощью пинцета зажимая аорты и потянув вверх; альтернативно можно использовать microscissors сократить спинной аорты.
3. Теперь, используя второй пинцет, чтобы понять грудного плавника от своей базы, в том числе хрящ тела у основания плавника, и поднимите это от. Повторите с другой грудного плавника. Иногда сердце выходит наружу вместе с грудными плавниками, поэтому рассмотрим эти части, чтобы убедиться, что сердце не прилагается, прежде чем выбросить их.
   Примечание: В этот момент, сердце должно быть видно, еще цела и соединен с остальной головы рыбы (хотя иногда он сходит с грудных плавников). Сердце может быть идентифицирован по его форме, его розового цвета, и его в окружении пигментной перикарда. Потому что эвтаназия рыб выполняется быстро, только что эвтаназии рыбы сердца все еще может быть избиение SLOwly.
4. Отпусти головы рыбы с первых щипцов, так что обе руки держат пинцетом и бесплатно. Используйте оба щипцы дразнить сердце от перикарда. Возьмитесь за сердце от остальной части спинной аорты, а остальные перикард оторвался.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если фиксированный или свежие, сердце является устойчивым к нежным тянет, а окружающая их соединительная ткань более рыхлая. Таким образом, любой среде, в полости перикарда ткань может быть отсечен с сердцем оставшиеся нетронутыми.
5. Откажитесь от остатки рыбы тушу в биологической мешок.

4. Подготовьте сердце для последующих применений

1. Использование щипцов, держитесь сердце у края спинной аорты / Bulbus артериального и поместить сердце в свежем блюдо 1x PBS. Кроме того, использование передачи пипетки. Перемещение сердце и обратно в PBS примерно в 10 раз, чтобы смыть столько крови, сколько возможно.
2. Для применений, в которых важно, чтобы удалить все possibле кровяные клетки, вымыть в 9 см чашки Петри с 15 мл РБК лизирующего буфера вместо PBS, используя те же движения назад и вперед. Если сохранение структуры сердца, не важно по нисходящему приложения (например, делая РНК), используйте щипцы или microscissors, чтобы открыть полости сердца и облегчить вымывания клеток крови.
3. Для приложений, в которых отдельные камеры сердца желательны, используйте щипцы или microscissors препарировать бульбус артериальный атриум, и желудочек друг от друга.
4. Перевести на сердце, или отдельные камеры, в буфер назначения на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общие направления включают буферы для диссоциации клеток, 4% параформальдегида, или TRIZOL.

Результаты

Используя этот метод, взрослых данио сердце можно разбить менее чем 1 мин, по сравнению с более 5 мин с использованием традиционных методов ^8. Сердца рассеченные с помощью этого метода достоверно нетронутыми (2А), в то время как традиционные методы ⁸ требуют резки слеп...

Обсуждение

В то время как методы рассечения взрослых данио сердце были описаны, эти методы были трудоемким и обычно вызывается к повреждению сердца во время вскрытия. Для проведения экспериментов, где большое количество взрослых сердца могут быть необходимы, и / или когда избежать деградации тка?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional