Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Zusammenfassung

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Zusammenfassung

Verwendung des Zebrafisch-Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung, Regeneration und Krankheit wird in Richtung der Anwendung erwachsenen Herzen für Zelldissoziationslösung und Aufreinigung von RNA, DNA und Proteinen erweitert. Alle diese Anwendungen fordern die rasche Erholung der eine erhebliche Anzahl von Zebrafisch-Herz genregulatorischen, Stoffwechsel und andere Veränderungen, die nach dem Tod beginnen zu vermeiden. Erwachsenen Zebrafisch Herzen sind auch zur Untersuchung von Herzstruktur für eine Vielzahl von Mutanten und zur Untersuchung der Herzregeneration erforderlich. Jedoch ist die herkömmliche Zebrabärbling Herz Dissektion langsam und schwierig und erfordert Spezialwerkzeuge, so dass großflächige Dissektion erwachsenen Zebrafisch Herzen mühsam. Traditionelle Verfahren bergen auch das Risiko einer Beschädigung des Herzens während der Präparation. Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation der erwachsenen Zebrafisch Herzen, schnell, reproduzierbar ist, und bewahrt Herzen Architektur. Außerdem funktioniert diese Methode nicht verlangen Spezialwerkzeugen, ist schmerzfrei für den Zebrafisch,kann auf frischem oder feste Proben durchgeführt werden und kann an Zebrafischen im Alter von 1 Monat alt durchgeführt werden. Die beschriebene Vorgehensweise erweitert die Verwendung von erwachsenen Zebrafisch für Herz-Kreislauf-Forschung.

Einleitung

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protokoll

HINWEIS: Achten Sie stets darauf, dass IACUC oder Ethikkommission die Genehmigung ist an Ort und Stelle vor dem Beginn einer Versuchsdurchführung mit Zebrafisch sein.

1. Bereiten Sie Reagenzien und Setup

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen. Finden Sie die Rezepte für alle diese Lösungen in Standard Zebrafisch Handbücher ^10.
   • 500 ml Wasser Egg
   • 200 ml 0,03% Tricaine in Egg Wasser
   • 100 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
   • RBC Lysis Buffer (optional)
   • Zielpuffer der Wahl (Fixiermittel Trizol, PBS, etc.) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis
     HINWEIS: Fixativ und Trizol sind giftig, wenn sie in Kontakt mit der Haut kommen. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit diesen Stoffen.
2. Bereiten Dissektion Setup:
   1. Stellen Sie den Schwanenhals-Lichtquelle über das Binokular. Setzen Sie den Deckel eines 9 cm Petrischale auf dem Binokular Bühne, und gießen Sie eine dünne Schicht von 1 × PBS iner (der Deckel verwendet wird, weil die Schale selbst ist zu tief für eine einfache Zerlegung).
   2. Legen Sie die Petrischale selbst (nicht der Deckel) auf der Arbeitsplatte in der Nähe des Binokular und gießen Sie etwa 15 ml 1x PBS darin. Verwenden Sie diese Option, um das Herz nach der Sektion zu waschen. Alternativ können Sie RBC Lysis Buffer.
   3. Ort Rasierklinge zwei Zangenpaaren, Mikroscheren (optional) und eine Transferpipette neben dem Mikroskop. Besorgen Sie sich einen Behälter mit Eis, wenn Euthanasie durch schnelles Abkühlen gewählt wird.
   4. Gießen 200 ml von 0,03% Tricaine in Egg Wasser in einen 250 ml Glasbecher, wenn Euthanasie durch Tricaine gewählt wird. Bereiten Sie eine kleine Biohazard Sack zur Dekontaminierung von Zebrafisch-Kadaver.

2. Bereiten Sie Zebrafisch

1. Für feste Fisch, bringen festen Fisch, in PBS gespült, mit dem Mikroskop-Setup.
   1. Euthanize die ganze erwachsenen Zebrafisch durch schnelles Abkühlen mit Eis für> 10 min.
   2. Verwenden einer Pinzette, um ein Loch in der Haut über das Bauchfell machen(Vom Herzen), um das Eindringen von Fixiermittel zu unterstützen, und sie dann in 4% Paraformaldehyd in Fix-Puffer ¹⁰ für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C.
2. Alternativ für frischen Fisch, statt Fisch in einem kleinen Vorratstank eingeschläfert werden und bringen auf den Mikroskopaufbau. Je nach Fisch Protokoll der individuellen Einrichtung und die nachgelagerten Anwendungen für die seziert Fischherzen, betäuben Fisch mit Tricaine oder einschläfern durch schnelles Abkühlen, bevor Enthauptung.
   1. Um Eis zu verwenden, nehmen Sie einen Fisch mit dem Fisch net und in Eiswasser, bis der Fisch nicht mehr bewegt, ca. 5 min.
   2. Alternativ zu Tricaine verwenden, nehmen Sie einen Fisch mit dem Fischnetz und in das Becherglas von der Lösung, bis Kiemenbewegungen zu stoppen.
3. Holen schnell auf die eingeschläfert Fisch durch seine Schwanzflosse und legen Sie sie auf die Seite, in der Petrischale Abdeckung, die mit 1x PBS gefüllt war. Verwenden Sie die Pinzette, um eine Brustflosse mit einer Hand zu heben, während der Verwendung der razor Klinge, um die Fische mit der anderen Hand zu köpfen, nur zur Befestigung der Brustflosse (1A) posterior. Führen Sie diesen Schritt, indem Sie entweder dem Mikroskop oder durch direkt Visualisierung der Fisch auf dem Mikroskoptisch.
   HINWEIS: frisch getöteten Fischen noch nach Enthauptung bluten.

Abbildung 1: Zebrafisch erwachsenen Herzen Dissektion nutzt Zebrafisch anatomischen Landmarken. (A), um die Fische zu enthaupten, heben Sie den Brustflosse mit einer Pinzette und mit einem scharfen Rasierklinge entlang der rot gestrichelten Linie, wie dargestellt. (B), um die Fischkopf zu stabilisieren, legen Sie die Zinken der Zange im Fischmaul während der andere Zinken liegt über das Auge, und drehen Sie den Fischkopf, so dass die Bauchseite ist und die beiden Zinken der Zange sind gegen den Boden der Petrischale stabil. (C) Verwenden Sie die kostenlose forceps, um die Befestigung der Kiemendeckel (Pfeil). (D) Deinstallations diese geschnitten, als weißer Struktur mit einem rosa Streifen bezeichnet Lumen Blut (Pfeil) zu erkennen ist die dorsale Aorta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

3. Präparieren Sie die Herz

1. Visualisieren Sie die Fischkopf unter dem Mikroskop. Mit einer Pinzette, beruhigen die Fischkopf, indem Sie eine Zinken der Zange im Fischmaul, durch das Gehirn, während die andere Zinke ist außerhalb des Kopfes, über das Auge (Abbildung 1B). Sicherzustellen, dass beide Zinken der Zange sind stabil gegen den Boden der Petrischale. Halten der Fischkopf auf diese Weise, sollte seine Bauchseite nach oben zeigen.
2. Mit der anderen Hand verwendet man die zweite Pinzette zum ventralen Befestigung des Verschlusses an dem Körper (Pfeil, 1C) geschnitten. Heben Sie diese leicht mit der Pinzette, die dØrsal Aorta wird unterhalb als weißer Aufbau mit einem roten Streifen von Blut in den Aortenlumen (Pfeil, 1D) angezeigt. Schneiden Sie die dorsale Aorta mit der Zange durch Zusammendrücken der Aorta und nach oben ziehen; alternativ können Sie Mikroschere, um die dorsale Aorta geschnitten.
3. Verwenden Sie nun die zweite Zange, um die Brustflosse von seiner Basis zu erfassen, einschließlich des Körpers Knorpel an der Basis der Flosse, und heben Sie diese ab. Wiederholen Sie mit der anderen Brustflosse. Gelegentlich kommt das Herz mit den Brustflossen, so prüfen, diese Stücke um sicherzustellen, dass das Herz nicht vor dem Wegwerfen ihnen verbunden.
   HINWEIS: An dieser Stelle sollte das Herz sichtbar, noch intakt und mit dem restlichen Fischkopf verbunden sein (obwohl es gelegentlich kommt mit den Brustflossen). Das Herz kann durch seine Form, seine rosa Farbe, und sein Wesen durch pigmentierte Herzbeutel umgeben identifiziert werden. Da die Euthanasie der Fische wird schnell ausgeführt wird, können frisch getöteten Fischen Herz noch schlägt slo seinWLY.
4. Lassen Sie den Fischkopf mit der ersten Zange, so dass beide Hände halten Pinzette und sind kostenlos. Benutzen Sie beide Zangen, um das Herz von der Herzbeutel zu necken. Fassen Sie die Herzen durch den Rest der dorsalen Aorta während die restlichen Herzbeutel weggezogen.
   HINWEIS: Ob fest oder frisch, ist robust leichtes Ziehen, während das umgebende Bindegewebe ist brüchig das Herz. Daher kann jeder umgebenden Herzbeutelgewebe weg mit das Herz intakt bleibt seziert werden.
5. Entsorgen Sie die übrig gebliebenen Fisch Karkasse in der biohazard Tasche.

4. Bereiten Sie den Inneres für Downstream-Anwendungen

1. Mit einer Pinzette, fassen Sie die Herzen durch den Rand der dorsalen Aorta / Bulbus arteriosus und legen Sie die Herzen in der frischen Schüssel mit 1x PBS. Alternativ können Sie einen Transferpipette. Bewegen Sie die Herzen in der PBS und zurück zu 10-fach zu wie möglich weg zu waschen, so viel Blut.
2. Für Anwendungen, bei denen es wichtig ist, alle possib entfernenle Blutkörperchen, Waschen in einer 9 cm Petrischale mit 15 ml RBC Lysispuffer anstelle von PBS mit derselben hin- und herbewegt. Wenn die Erhaltung der Struktur des Herzens ist nicht wichtig für die nachgeschaltete Anwendung (zB, was RNA), mit den Zangen oder Mikroscheren, um die Herzhohlraum zu öffnen und zu erleichtern Abspülen von Blutzellen.
3. Für Anwendungen, bei denen separate Herzkammern gewünscht werden, verwenden Pinzette oder Mikroschere, um den Bulbus arteriosus, Vorhof und Herzkammer voneinander zu sezieren.
4. Übertragen Sie das Herz, oder getrennte Kammern, in die Zielpuffer auf Eis.
   HINWEIS: Gemeinsame Ziele sind Puffer für Zelldissoziation, 4% Paraformaldehyd oder Trizol.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Verfahrens kann ein Erwachsener Zebrabärbling Herz in weniger als 1 min präpariert werden, im Vergleich zu über 5 min mit traditionellen Methoden ^8. Herz seziert mit dieser Methode sind zuverlässig intakt (2A), während die traditionellen Methoden ⁸ erfordern Schneiden blindlings in den Herzbeutel und damit häufig Beschädigung oder Verlust von Atrium oder Bulbus arteriosus (2B) verursachen. Herz präpariert behalten ihre strukturelle I...

Diskussion

Während Verfahren zum Präparieren des erwachsenen Zebrafisch Herzen beschrieben worden sind, sind diese Methoden zeitaufwendig und häufig verursacht beim Präparieren von Schädigungen des Herzens. Experimente, wo eine große Anzahl von erwachsenen Herzen erforderlich sein, führen und / oder wenn die Vermeidung von Abbau von Herzgewebe ist wichtig für die Downstream-Anwendungen ist die Zeit unter Verwendung traditioneller Techniken Dissektion erforderlich unerschwinglich. Ebenso ist reproduzierbar erhalten unbesch?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional