Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Résumé

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Résumé

Utilisation du système modèle pour étudier le développement du poisson zèbre, la régénération et la maladie est l'expansion vers l'utilisation de cœurs adultes pour la dissociation cellulaire et la purification de l'ARN, l'ADN et les protéines. Toutes ces applications exigent la reprise rapide d'un grand nombre de cœurs de poisson zèbre pour éviter gène régulateur, métabolique, et d'autres changements qui commencent après la mort. Coeurs poisson zèbre adultes sont également nécessaires pour étudier la structure de coeur pour une variété de mutants et pour étudier la régénération cardiaque. Cependant, la dissection traditionnelle cardiaque poisson zèbre est lente et difficile et nécessite des outils spécialisés, ce qui rend la dissection grande échelle des cœurs de poisson zèbre adultes fastidieux. Les méthodes traditionnelles abritent également le risque d'endommager le coeur lors de la dissection. Ici, nous décrivons une méthode pour la dissection des cœurs de poisson zèbre adultes qui est rapide, reproductible, et préserve l'architecture cardiaque. En outre, cette méthode ne nécessite pas d'outils spécialisés, est indolore pour le poisson-zèbre,peut être effectuée sur des échantillons frais ou fixes, et peut être effectuée sur le poisson zèbre dès l'âge de un mois. L'approche décrite élargit l'utilisation de poisson zèbre adulte pour la recherche cardiovasculaire.

Introduction

Zebrafish are an excellent model for studying heart development and human disease^1,2. Specific advantages include the translucent nature of zebrafish embryos, the availability of many genetic mutants and transgenic reporter lines, and the availability of genome editing technologies. In addition to their advantages for studying early heart development, zebrafish are an ideal system for studying vertebrate heart regeneration³.

More recently, adult zebrafish are playing an important part in bioinformatics approaches to studying cardiovascular development and disease, due to their relatively large clutch size and relatively quick and inexpensive breeding compared to other vertebrate models. Promising techniques include ribosome profiling, RNA-Seq, and cell dissociation and FACS sorting^4-7. However, for these techniques the quality of the data can depend on obtaining a large number of samples in a rapid, efficient, and reproducible manner, before gene regulatory, metabolic, transcriptional, and other changes occur.

Dissection of adult zebrafish organs has been described in the past^8,9. However, previous approaches to dissection of the heart were slow, ran the risk of damaging the heart during dissection, required special tools, and/or required fixation of the zebrafish prior to dissection; for these reasons, past approaches to zebrafish adult heart dissection were not optimized for high-throughput applications and/or applications requiring fresh tissue.

Here, we describe a method for adult zebrafish heart dissection that is simple, fast, efficient, and reproducible, while preserving cardiac morphology. This method does not include cutting into the pericardial space and therefore does not risk damaging the heart during dissection. Instead, this method relies on anatomical landmarks of the zebrafish, and therefore, it is highly reproducible. This dissection method is also versatile in that it can be used on fresh or fixed fish, and on zebrafish as young as one month old. Finally, this method results in minimal suffering to the zebrafish because after anesthesia and/or rapid cooling, the fish is additionally decapitated and pithed in the course of the dissection procedure.

Protocole

REMARQUE: Assurez-vous toujours que l'approbation IACUC ou comité d'éthique est en place avant de commencer toute procédure expérimentale utilisant le poisson zèbre.

1. Préparer les réactifs et configuration

1. Préparer les solutions suivantes. Trouver les recettes pour l'ensemble de ces solutions dans les manuels de poisson zèbre standards ^10.
   • 500 ml d'eau Egg
   • 200 ml de 0,03% tricaïne à Egg eau
   • 1x 100 ml de tampon phosphate salin (PBS)
   • RBC tampon de lyse (facultatif)
   • tampon de destination de choix (fixateur, Trizol, PBS, etc.) dans un tube de 1,5 ml sur la glace
     REMARQUE: fixateur et Trizol sont toxiques si elles entrent en contact avec la peau. Porter des gants lors de la manipulation de ces substances.
2. Préparer la configuration de dissection:
   1. Placez la source de lumière à col de cygne sur le microscope de dissection. Placez le couvercle d'une boîte de Pétri de 9 cm sur la scène de dissection microscope, et verser une fine couche de 1x PBS dans(le couvercle est utilisé parce que le plat lui-même est trop profonde pour une dissection facile).
   2. Placez la boîte de Pétri lui-même (pas le couvercle) sur le comptoir près du microscope à dissection et versez environ 15 ml de PBS 1x en elle. Utilisez cette solution pour laver le cœur après dissection. Vous pouvez également utiliser tampon de lyse RBC.
   3. Lieu lame de rasoir, deux paires de pinces, microciseaux (facultatif), et une pipette de transfert à côté du microscope. Obtenir un conteneur de glace si l'euthanasie d'un refroidissement rapide est choisie.
   4. Verser 200 ml de 0,03% tricaïne à Egg eau dans un bécher de 250 ml en verre si l'euthanasie par tricaïne est choisi. Préparer un petit sac de risque biologique pour l'élimination des carcasses de poisson zèbre.

2. Préparer le poisson zèbre

1. Pour les poissons fixe, apporter du poisson fixe, rincées dans du PBS, à la configuration du microscope.
   1. Euthanasier tout le poisson zèbre adulte par un refroidissement rapide avec de la glace pour> 10 min.
   2. Utilisez une pince à faire un trou dans la peau sur le péritoine(Du coeur) pour faciliter la pénétration du fixateur, puis mettez-les dans 4% de paraformaldehyde dans Fix Buffer ¹⁰ pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C.
2. Sinon, pour le poisson frais, le lieu poisson pour être euthanasié dans un petit réservoir de retenue et apporter à la configuration du microscope. Selon le protocole de poissons de l'installation individuelle et les utilisations en aval pour les cœurs de poissons disséqués, anesthésier les poissons avec de tricaïne ou euthanasier par un refroidissement rapide avant la décapitation.
   1. Pour utiliser de la glace, ramasser un poisson avec le filet de pêche et les placer dans de l'eau glacée jusqu'à ce que le poisson se arrête de bouger, environ 5 min.
   2. Sinon, pour utiliser tricaïne, ramasser un poisson avec le filet de pêche et le lieu dans le bécher de la solution jusqu'à l'arrêt des mouvements maillants.
3. Prendre rapidement le poisson euthanasié par sa nageoire caudale et le poser sur son côté dans le plat couvercle Petri qui a été rempli de PBS 1x. Utilisez la pince pour soulever une nageoire pectorale avec une main, tout en utilisant le razor lame pour décapiter le poisson avec l'autre main, juste en arrière de l'attachement de la nageoire pectorale (figure 1A). Effectuez cette étape soit en regardant par le microscope ou simplement en visualisant directement le poisson sur la platine du microscope.
   REMARQUE: poissons fraîchement euthanasiés seront toujours saigner après la décapitation.

Figure 1. poisson zèbre dissection cardiaque adulte utilise des repères anatomiques de poisson zèbre. (A) à décapiter le poisson, soulevez la nageoire pectorale avec une pince et d'utiliser une lame de rasoir propre forte le long de la ligne pointillée rouge comme indiqué. (B) Pour stabiliser la tête du poisson, placer une dent de la pince dans la bouche de poisson tout l'autre dents se trouve à travers l'œil, puis tournez la tête du poisson afin que la surface ventrale est en place et les deux dents de la pince sont stables contre le fond de la boîte de Pétri. (C) Utilisez le forc gratuitementeps pour couper l'attachement de l'opercule (flèche). (D) de levage cela, l'aorte dorsale est visible comme une structure blanche avec une bande rose dénotant sang luminale (flèche). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Disséquer le Cœur

1. Visualisez la tête de poisson sous le microscope. Avec une pince, stabiliser la tête du poisson en plaçant une dent de la pince dans la bouche de poisson, à travers le cerveau, tandis que l'autre dent est en dehors de la tête, dans l'œil (figure 1B). Vérifiez que les deux dents de la pince sont stables contre le fond de la boîte de Pétri. Tenir la tête de poisson de cette façon, sa surface ventrale doit être orientée vers le haut.
2. Avec l'autre main, utilisez les secondes pinces pour couper le attache ventral de l'opercule au corps (flèche, Figure 1C). Levage cette légèrement avec la pince, le dOrsal aorte apparaîtra sous forme d'une structure blanche avec une bande rouge de sang dans la lumière aortique (flèche, figure 1D). Couper l'aorte dorsale avec la pince en pinçant l'aorte et tirant vers le haut; alternativement, utiliser microciseaux pour couper l'aorte dorsale.
3. Maintenant, utilisez les secondes pince pour saisir la nageoire pectorale de sa base, y compris le cartilage du corps à la base de la nageoire, et soulevez cette option. Répétez avec l'autre nageoire pectorale. Parfois, le cœur sort avec les nageoires pectorales, afin d'examiner ces pièces pour se assurer que le cœur ne est pas fixé avant de les jeter.
   NOTE: A ce stade, le cœur doit être visible, encore intacte et relié à la tête de poisson restant (bien que parfois il se détache avec les nageoires pectorales). Le cœur peut être identifié par sa forme, sa couleur rose, et son être entouré par péricarde pigmentée. Parce que l'euthanasie du poisson est effectué rapidement, coeurs de poissons fraîchement euthanasiés peuvent encore être battu slovers l 'ouest.
4. Lâchez la tête du poisson avec les premiers forceps, afin que les deux mains tiennent pince et sont gratuits. Utilisez les deux pinces pour taquiner le coeur loin du péricarde. Saisissez le cœur par le reste de l'aorte dorsale tandis que le péricarde restante est retirée.
   NOTE: Que fixe ou frais, le cœur est robuste pour tirer douce tandis que le tissu conjonctif environnant est plus friable. Par conséquent, ne importe quel tissu péricardique entourant peut être disséquée avec le cœur reste intacte.
5. Jeter la carcasse de restes de poisson dans le sac pour matières contaminées.

4. Préparer le coeur pour des applications en aval

1. En utilisant des pinces, saisir le cœur par le bord de la aorte dorsale / bulbe artériel et placez le coeur dans le plat frais de 1x PBS. Vous pouvez également utiliser une pipette de transfert. Déplacez le coeur avant et en arrière dans le PBS environ 10x pour laver autant de sang que possible.
2. Pour les applications où il est important d'éliminer toute possibLe globules, laver dans une boîte de Petri de 9 cm avec 15 ml de tampon de lyse RBC au lieu de PBS, en utilisant le même mouvement de va-et-vient. Si la préservation de la structure du coeur ne est pas importante pour l'application en aval (par exemple, ce qui rend l'ARN), utiliser la pince pour ouvrir ou microciseaux la cavité cardiaque et de faciliter le rinçage loin des cellules sanguines.
3. Pour les applications dans lesquelles cavités cardiaques différents sont désirés, utiliser une pince à disséquer ou microciseaux le bulbe artériel, l'atrium et le ventricule à l'écart l'une de l'autre.
4. Transférer le cœur, ou des chambres séparées, à la mémoire tampon de destination sur de la glace.
   NOTE: destinations communs comprennent des tampons pour la dissociation cellulaire, 4% de paraformaldéhyde ou Trizol.

Résultats

En utilisant cette méthode, un poisson zèbre cœur adulte peut être disséqué en moins de 1 min, par rapport à plus de 5 min selon la méthode traditionnelle ^8. Coeurs disséqués en utilisant cette méthode sont fiable intacte (figure 2A), alors que les méthodes traditionnelles nécessitent ^huit coupe aveuglément dans le péricarde et donc souvent causer des dommages ou la perte de l'atrium ou bulbe artériel (figure 2B). Coeurs disséqués conservent l...

Discussion

Bien que les méthodes pour disséquer le cœur de poisson zèbre adulte ont été décrits, ces méthodes étaient de temps et souvent causé des dommages au cœur lors de la dissection. Pour effectuer des expériences où un grand nombre de coeurs adultes peuvent être nécessaires, et / ou lorsque éviter la dégradation du tissu cardiaque est important pour les applications en aval, le temps nécessaire en utilisant des techniques de dissection traditionnels est prohibitif. De même, l'obtention reproductible en...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small tank for transporting fish	Aquaneering	ZHCT100
Fish net	Petsmart	36-16731
250 ml glass beaker	Kimble	14005-250
9 cm polystyrene Petri dish	Nunc	172958
Razor blade	Personna American Safety Razor Company	94-120-71
2 Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dissecting microscope	Olympus	SZX16
Tricaine	Sigma	A-5040
Plastic transfer pipette	Thermo Scientific	202-20S
Gooseneck light source	Dolan-Jenner Industries, Inc	Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q	optional
Micro-scissors	Biomedical Research Instruments, Inc	11-1000	optional
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57	optional