Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Özet

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Özet

Vektör Sivrisinek başka bir organizma daha çok insan acı indirebilmek - ve bir milyondan fazla insanı her yıl öldürmek. Sivrisinek genom projeleri birincil Afrika sıtma vektörü Anopheles gambiae ve dang ve sarı humma vektör Aedes aegypti fonksiyonel genetik çalışmalar da dahil olmak üzere sivrisinek biyoloji yeni yönleriyle, araştırma kolaylaştırdı. RNA parazitsiz (RNAi-) aracılık ettiği gen susması, bu hastalık taşıyıcıları sivrisinek türlerinin her ikisi de ilgi genleri hedef olarak kullanılmaktadır. Burada, gıda ile birlikte ve larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri müdahale / çitosan hazırlanması için bir prosedür tarif eder. Uzun çift kollu RNA (dsRNA), ya da küçük müdahale edici RNA (siRNA) molekülleri ile uyumlu olan bu teknik basit, yüksek hacimli, ve nispeten pahalı olmayan bir yöntem, A. farklı geninin başarılı bir şekilde demonte kullanılmaktadır gambiae ve A. aegyptiMah-PCR ile veya in situ hibridizasyon doğrulandı larva. larva beslenmeye ardından, demonte, en azından geç pupa aşamasından devam edebilirsiniz. Bu yöntem, bir sivrisinek ve tarımsal zararlıların da dahil olmak üzere diğer böcek türleri, çok çeşitli, hem de diğer olmayan modeli organizmalar için de geçerli olabilir. Araştırma laboratuarında de yararlı ek olarak, gelecekte, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer içinde, potansiyel alanında kullanılabilir.

Giriş

Anopheline türü ve aedine cins Kan besleme vektör sivrisinek insanlığın en kötü bela birkaç sorumlu hastalığa neden olan ajanlar iletir. Tahminen 3,4 milyar insan yılda dünya çapında üzerinden bir buçuk milyon kişinin ölümünden sorumlu olan sıtma, sözleşme için risk altındadır. Plasmodium sp enfeksiyonundan Sıtma sonuçları. Başlıca Afrika vektörü Anopheles gambiae (dahil Anopheles cinsi sivrisineklerin enfekte, ısırıkları ile insanlara iletilir parazitler, http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) ^1. Aedes aegypti dang ateşi, dünyanın en yaygın ve önemli arboviral hastalıktır nonspesifik ateşli hastalığa neden dang virüsü, birincil sivrisinek vektör. Dang virüsü yıllık inciden ile, halen tropik> 2,5 milyar kişiye bir tehdittir24.000 ölüm yıl ~ sonuçlanan yaklaşık 50 milyon olgunun ce ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. Insan sağlığı üzerindeki sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıkların yıkıcı küresel etkilerine rağmen, önlenmesi ve bu hastalıkların tedavisinde etkili aracı eksiktir. Sivrisinek kontrolü halen hastalığın önlenmesi en iyi yöntemdir.

Vektör böceklerin genetik manipülasyon yoluyla Artropod kaynaklı hastalıkların kontrolü için potansiyeli dört yılı aşkın bir süredir ³ için kabul edilmiştir. A. Transgenik soylar Son zamanlarda transgenik vektör kontrol stratejileri gerçeğe ^4-6 kullanarak potansiyelini yaptık aegypti bir bastırılabilir kadın-özel uçamayan fenotip sahip tasarlanmış. Bu gelişmeler vektör kontrolü ve vektör sivrisinek gen fonksiyonunu manipüle ek araçları için yeni genetik hedefler belirlemek için araştırmacılar meydan var. Gen ifadesi d Tadilatınakadın-uçamayan sivrisinekler ⁴ yılında olduğu gibi uring geliştirme, yeni vektör kontrol stratejilerinin açıklanmasını teşvik edebilir. Ancak, büyük ölçüde teknik zorluklar, çok az genlerin fonksiyonları A. geliştirilmesi sırasında karakterize edilmiştir gambiae, A. aegypti veya diğer sivrisinek türleridir.

C yılında keşfedilmesinden bu yana elegans ^7, hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar muhafaza edilir, RNA interferans (RNAi), yaygın olarak böcekler ^8,9 dahil olmak üzere, geniş bir organizma, çeşitli işlevsel genetik çalışmalar için kullanılmıştır. RNAi yolu diziye özgü müdahale RNA olarak işlev kısa 20-25 nükleotid uzunluğundaki siRNA'lar içine Dicer bölünen uzun dsRNA ile başlatılır. transkript ciro, bölünme ve çeviri ⁹ bozulması teşvik ederek sırayla tamamlayıcı siRNA'lar sessizlik genler. Bir Particula hedefleme uzun dsRNA molekülleri (tipik olarak 300-600 bp) ya da özel siRNA'larR dizisi, ilgi konusu herhangi bir gen susturma araştırma laboratuarda kullanılabilir. RNA teslim edilir müdahale sırasında yöneterek, araştırmacılar hangi gen de inisiyelere susturulması zaman kontrol edebilirsiniz. Bu üretim ve kalıtsal mutasyonlar, henüz tüm böcek türlerinin mevcut değildir pahalı ve emek-yoğun bir süreç taşıyan suşların bakım engelleyebilir gibi gelişimsel öldürücülüğü veya kısırlık gibi zorlukların üstesinden gelmek için kullanılabildiği gibi bu avantaj yararlıdır. RNAi, gen susturma derecesi hayvana geni, dokuya doku ve hayvan geninin arasında değişebilir, ancak, RNAi yaygın sivrisinek ve diğer böcekler ^8,9 genlerin işlevsel analiz için kullanılmaktadır.

Üç müdahale RNA teslim stratejileri sivrisinekler kullanılmıştır: mikroenjeksiyon, iliklerine / topikal uygulama, ve yenmesi. Detaylı bir tarih ve böcekler bu üç teknikler kullanılarak Karşılaştırma için, Yu ve arkadaşları ⁸ bakınız. WE başarılı bir şekilde A. gelişim hedef genlere siRNA'lar vermek için bir araç olarak mikroenjeksiyon ¹⁰ kullandık aegypti embriyolar, larva, pupa ve ^11-14. Ancak, bu emek-yoğun teslimat strateji mikroenjeksiyon kurulum ve yetenekli bir el hem de gerektirir. Ayrıca, mikroenjeksiyon davranışsal fenotipleri değerlendirilecek, özellikle organizma, bir karıştırıcı faktör streslidir. Son olarak, mikro-enjeksiyon aktarım vektörü kontrol alanına uzatılamaz. Bu uygundur ve küçük ekipman veya emek gerektirir bir alternatif olarak, RNA çözümü müdahale organizmayı iliklerine de, gen susturulması tetikleme popüler bir araç haline gelmiştir. Islatma öncelikle böcek hücre hattında uygulanmaktadır ⁸ çalışmaları, ancak son çalışmada, Knockdown A'da elde edildi aegypti larva hayvanlar sindirerek ortaya çıktı dsRNA ^15, ihtiva eden bir çözeltiye batırılır. Bununla birlikte, birden fazla experimenta analizini kapsayan çalışmalar içinL grubu veya fenotipleri, ıslatma oldukça maliyetlidir. Lopez-Martinez ve diğ. ¹⁶ RNAi, engelleyen RNA ihtiva eden tek bir su damlası ile tuzlu su çözeltisi ve rehidrasyon dehidratasyon içeren RNA teslim müdahale için yeni bir yaklaşım tahrik rehidrasyon tarif. Bu yaklaşım, tüm hayvan daldırma ile ilişkili maliyetlerini düşürmek, ancak mikroenjeksiyon daha pahalı ve yüksek ozmotik basınçları tolere edebilir türlere uygulanması sınırlı edilebilir değildir. Ayrıca, daldırma ya da dehidrasyon / rehidrasyon daldırma yöntemi alanında vektör kontrolü için uyarlanabilir nasıl tasavvur etmek zordur. Bu nedenlerden dolayı, post-embriyonik çalışmalar için alınan gıda ile müdahaleci RNA teslim uygun bir alternatif bir stratejidir.

Yenmesi-tabanlı stratejiler, tüm böcek türleri, belki de en önemlisi Drosophila melanogaster çalışmıyor rağmen, gıda ile karışık RNA müdahale oral teslim gen si terfi ettiBöceklerin ^8,17 çeşitli lencing, aşağıdakileri içeren A. aegypti yetişkin ^18. Bu A'da kitosan nanopartikül aracılı RNAi tarif gambiae larva ¹⁹ ve başarılı bir şekilde A. gen ekspresyonunun azaltılması için, bu yaklaşım uyguladık aegypti larvaları ^20,21. Burada, polimer kitosan ile RNA müdahale sürüklenmemesine içerir bu RNAi prosedürü, metodolojisi, ayrıntılı. Kitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller çitosan amino gruplarının pozitif yüklerin ve RNA ¹⁹ müdahale omurgasında fosfat grupları tarafından taşınan negatif yük arasındaki elektrostatik kuvvetler aracılığıyla müdahaleci RNA ile polikatyonlar kendini düzenlemesinden oluşur. açıklanan prosedür uzun dsRNA moleküllerinin (bundan sonra siRNA olarak anılacaktır) siRNA şeritli (bundan sonra dsRNA olarak anılacaktır) ya da çift ile uyumludur. Aşağıdaki sentez, çitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller Konukçu ile karıştırıldı ve teslim edilirOral yoldan alım yoluyla larva. Bu metodoloji, nispeten ucuz küçük ekipman ve emek gerektirir ^19, ve davranışların ^20,21 analizi de dahil olmak üzere çok sayıda fenotip, yüksek verimlilik analizini kolaylaştırır. Diğer hastalık vektörleri ve böcek tarım haşere de dahil olmak üzere diğer böcekler, gen susturma çalışmaları için adapte edilebilir Bu metodoloji, potansiyel olarak diğer hayvan türlerinin çeşitli gen susturma için kullanılabilir. Ayrıca, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer ^22, potansiyel olarak türe özgü sivrisinek kontrolü için alanda kullanılabilir.

Protokol

1. Sivrisinek Türlerinin ve Yetiştirme

1. A. koruyun gambiae G3 ve A. aegypti Liverpool IB12 (aşağıda temsili çalışmalarda kullanılan) suşları veya standart laboratuar uygulamaları ya da daha önce ^23,24 açıklandığı gibi uygun diğer ilgi suşları.

2. dsRNA'nın ve siRNA Tasarım ve Üretimi

1. Tasarım primerler ilgi konusu gen için özel uzun dsRNA şablonlar oluşturmak için yerleştirildi. E-RNAi aracını ²⁵ kullanın. Gibi bir seçim ya da yöntemine göre dsRNA üretmek önce ¹⁹ tanımladı.
   1. Negatif bir kontrol olarak, yeşil flüoresan proteini (GFP), β-galaktosidaz (β-gal) veya sivrisinek ifade edilmeyen başka bir gen sekansına karşılık gelen dsRNA ¹⁹ sentezler. Bu şekilde istenmesi halinde, aşağıda temsil sonuçları üretmek için kullanılan dsRNA ^19, bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Mağaza dsRNA'nın -80 ° 'de RNAse içermeyen su içinde çözüldüC kadar gerekli.
2. Seçenek olarak ise, tasarım gene özel siRNA standart laboratuar uygulamaya göre ya da daha önce tarif ^{edilen, 10.} Sivrisinek genine karşılık negatif kontrol siRNA tasarımı için portatif siRNA dizisini karıştırmak. Saygın satıcıları bir numara ile mevcut özel siRNA'ları, satın alın.
   1. Bu şekilde istenmesi halinde, aşağıda temsil sonuçları elde etmek için kullanılan siRNA'lar ^20,21 pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Gerekli olana kadar mağazası siRNA -80 ° C RNAse içermeyen su içinde çözülmüştür.

3. RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan Hazırlama

1. Önceden yapılan RT 100 mM sodyum sülfat toplamak (deiyonize H ₂ O 100 mM Na _{2SO 4)} ve 0.1 M sodyum asetat (deiyonize H ₂ O 0.1 M, NAC _{2H 3} O ₂ -0.1 M asetik asit, pH 4.5) tamponlar.
2. Kitosan çözülür (≥75%deasetillenmiş), 0.1 M sodyum asetat tampon maddesi içinde () ağırlık / hacim çalışma çözeltisi% 0.02 yapmak ve kullanılmadan önce oda sıcaklığında çözelti tutun.
3. _H2O deiyonize 50 ul dsRNA veya siRNA çözülür ve 50 mM sodyum sülfat, 100 ul başına dsRNA / siRNA 32 ug 100 ul solüsyon yapmak için, 100 mM sodyum sülfat tamponu ekleyin.
4. DsRNA'nın / siRNA çözeltisine çitosan solüsyonu, 100 ul ilave edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 55 ° C'de bir su banyosunda karışım ısı. Kitosan çözeltisinin 100 ul 50 mM sodyum sülfat 100 ul ekleyerek bir denetim kurmak ve aynı prosedürü izleyin.
5. Nanopartiküllerin oluşumunu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında yüksek hızlı bir girdaplama ile 30 saniye için hemen çözüm karıştırın.
6. Pelet görünür olmalıdır, bu süreden sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin karışımı. Yeni 1.5 ml tüp süpernatant aktarın. Sivrisinek yemek hazırlamak için kullanmadan önce oda sıcaklığında ≈10 dakika pelet Hava kurulayın.
7. Msüpernatant kaldı DsRNA / siRNA'nın toplam miktarını hesaplamak için boş olarak kontrol (3.5 bakınız) süpernatant kullanarak süpernatanda DsRNA / siRNA'nın konsantrasyonunu gözetim kuruluşunun onayını almıştır. Başlangıç ​​dsRNA'nın / siRNA'nın miktarlarda ve nanopartiküller içinde sıkışıp kalan DsRNA / siRNA'nın yüzdesini hesaplamak için Süpernatantları kalan tutarları arasındaki farkı kullanın. Bu yükleme verimliliği normalde% 90 üzerindedir.
8. Daha fazla nanopartiküller gerekirse aynı işlemi tekrarlayın. Hemen kurutuldu nano-tanecikleri kullanın. kullanımdan önce parçacıkların soğuk depolama etkisi değerlendirilmemiştir.

4. Sivrisinek Gıda RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan içeren Hazırlanması

1. Iyonu giderilmiş su içinde, agaroz eriyik (ağırlık / hacim),% 2 agaroz çözeltisi 1 ml hazırlayın ve kullanımdan önce bir 55 ° su banyosu içinde eritilmiş agaroz çözüm tutmak.
2. Balık gevreği karıştırın (% 47 ham protein, dk. Ham yağ% 10, maks. Ham lif% 3) en ve kuru maya(ağırlık / ağırlık) 1: 2 oranı. Bir havan ve tokmak (No 50 ABD standart test elek boyunca yeterli) küçük parçacıklara mikserden. Ya hemen, kahverengimsi renkte olmalıdır zemin yiyecek, kullanın ya da birkaç hafta boyunca 4 ˚C de kapalı bir kapta saklayın.
3. 1.5 ml bir tüp içinde, bir kürdan ile Bölüm 3.7 kurutulmuş nanopartiküller ile yer gıda 6 mg karıştırın.
4. Gıda nanopartikül karışımı,% 2, önceden eritilmiş agaroz jel çözeltisi 30 ul ilave et; Bir kürdan veya pipet ucu ile hemen ve iyice karıştırın.
5. Hemen sivrisinek larvaları beslemek için yiyecek ve nanopartiküller içeren jel kullanın. Jel tamamen oda sıcaklığında katılaşan bir kez, alternatif olarak, 4 ° C'de jel depolama ve kullanma ertesi gün ya da daha sonra kullanmak için -80 ° C 'de.

5. Gıda RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan İçeren ile Sivrisinek Larva Besleme

1. Besleme A. gambiae sivrisinek larvaları:
   1. Bir si kaldırBir kürdan kullanarak ve temiz bir jilet veya diş çekme kullanarak 6 eşit dilimler halinde kesilmiş 1.5 ml tüp ngle jel pelet.
   2. Iyonu giderilmiş su, 100 ml içeren 500 ml'lik bir Petri tabağına aktarın 20 üçüncü instar larvaları.
   3. Petri kabı bir kez, dört gün boyunca, günde jel pellet (ince küçük parçalar halinde kesilmiş) bir dilim ekleyerek sivrisinek larvaları besleyin. Önemli ölçüde küçültülür veya ertesi gün tamamen yok edilmelidir pelet, üzerinde larva besleme gözlemlemek için emin olun. Süre sonra, sivrisinekler geç dördüncü evre larvaları dönüşecek.
   4. Deney sırasında herhangi bir görünür fenotipik değişiklikleri kaydedin. Dört günlük sürenin sonunda 6. bölümde tartışıldığı gibi transkript düzeyleri ve diğer fenotipik değişiklikleri incelemek.
2. Besleme A. aegypti sivrisinek larvaları:
   1. Temiz bir jilet veya kürdan kullanarak 6 eşit dilimler halinde jel pelet kesin.
   2. Yumurta kuluçka fi sonra 50 yaş senkronize 24 saat yerleştirindeiyonize su ≈40 ml bir petri çanağı içine ilk instar larvaları.
   3. Günün geri kalanı için 1 zemin balık yiyecek gevreği ve kuru maya: sonra 2 normal larva diyetine geri larvaları transfer 4 saat / gün petri başına larva bir dilim besleyin. Günde dört larva dönemi boyunca prosedürü tekrarlayın.
   4. Istenen gelişimsel zaman noktalarında bölüm 6'da anlatıldığı gibi transkript düzeyleri ve diğer fenotipik değişiklikleri incelemek.

Gen demonte 6. Onay

1. A. Mah-PCR ile Bağıl transkript ölçümü aegypti ve A. gambiae larvaları.
   1. Gerçekleştirin ve ^11,19,20 tarif, ya da standart laboratuar prosedüre göre deney larva vs en az 10 havuza kontrol üç biyolojik çoğaltır ile Mah-PCR deneyleri analiz. Örnek sonuçlar aşağıda yer almaktadır.
   2. Özel bir doku tipi / gövde parçası (örn. Beyin veya anten), perfo analizi içinÇevrede bulunan doku kurtarma 6.1.1 aşağıdaki diseksiyon tarif edildiği gibi rm QRT-PCR (örneğin, bakınız Mysore ve ark. ^21).
2. In situ olarak melezleşme ile demonte teyidi
   1. Dioksijenin-etiketli antisens sentez ve standart laboratuar uygulamaları ya da ²⁶ anlatıldığı gibi uygun kontrol riboprobes seziyorum.
   2. Daha önce ^11,20 açıklandığı ve aşağıda temsilcisi sonuç bölümünde tartışıldığı gibi demonte teyidi için Haugen ark. ²⁷ protokol başına in situ hibridizasyon yürütün.
3. Immünohistokimyasal olarak demonte Onayı
   1. Hedeflenmiş genin protein ürünü karşı antikorların mevcut ise, daha önce tarif edildiği gibi ^28, representati örneklendiği gibi fenotip analizi ²⁰ demonte büyük seviyeleri olan bireylerin belirlenmesi kolaylaştıran, immünohistokimya gerçekleştirmekAşağıdaki sonuçlar bölümünde ettik.

Sonuçlar

A. gambiae:

Kitosan / dsRNA'nın nanopartiküller bağlı çitosan amino grupları ve dsRNA'nın fosfat grupları arasındaki elektrostatik etkileşim oluşur. çözeltiden dsRNA'nın azalması ile ölçülen nanopartiküller olarak dsRNA dahil verimliliği genellikle% 90 üzerindedir. Atomik kuvvet mikroskopisi görüntüler şunu gösterir ki, 100-200 nm'de (Şekil 1) arasında değişen çap olarak kitosan-dsRNA parçacık b...

Tartışmalar

Burada tarif edilen çitosan / müdahale edici RNA nanopartikül yöntem etkili bir şekilde A. larva gelişimi sırasında hedef genlere kullanılmıştır gambiae (Şekil 2, 3) ve A. aegypti (Şekiller 4, 5, 6, Tablolar 1, 2). Kitosan nanopartiküller olarak burada tarif edilen sonuçları ile kanıtlandığı gibi, sivrisinek olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır, her ikisi de uzun dsRNA veya siRNA, ya da hazırlanabilir. DsRNA'nın Sentezi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings