A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

Resumo

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

Resumo

Mosquitos vetores infligir sofrimento mais humano do que qualquer outro organismo - e matar mais de um milhão de pessoas a cada ano. Os projetos mosquito genoma facilitou a pesquisa em novas facetas da biologia do mosquito, incluindo estudos genéticos funcionais no principal vetor Africano malária Anopheles gambiae eo dengue e amarelo vetor da febre Aedes aegypti. ARN de interferência (RNAi-) silenciamento de genes mediado foi usado para genes alvo de interesse em ambas as espécies de mosquito vector doença. Aqui, descrevemos um procedimento para a preparação de quitosana / interferindo nanopartículas de RNA que são combinados com alimentos e ingeridos pelas larvas. Este, de alto rendimento tecnicamente simples, relativamente barato e metodologia, que é compatível com o RNA de cadeia dupla de comprimento (dsRNA) ou pequenos ARN interferentes (siRNA) moléculas, tem sido utilizado para o knockdown bem sucedida de um número de diferentes genes em A. gambiae e A. aegyptilarvas. Após as mamadas larvais, knockdown, o que é verificado através de qRT-PCR ou hibridação in situ, podem persistir pelo menos até a fase de pupa tarde. Esta metodologia pode ser aplicada a uma grande variedade de espécies de mosquitos e outros insectos, incluindo pragas agrícolas, bem como outros organismos não-modelo. Para além da sua utilidade no laboratório de investigação, no futuro, o quitosano, um polímero barato, não-tóxicos e biodegradáveis, podem ser potencialmente utilizados no campo.

Introdução

Mosquitos sanguíneos que alimentam vetor dos gêneros de anofelinos e aedine transmitir agentes causadores de doenças responsáveis ​​por vários dos piores flagelos da humanidade. Estima-se que 3,4 bilhões de pessoas estão em risco de contrair a malária, que é responsável por mais de meio milhão de mortes por ano em todo o mundo. Resultados da malária de infecção por Plasmodium sp., Que parasita, que são transmitidos às pessoas através da picada de mosquitos infectados do gênero Anopheles, incluindo o principal vector Africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) ^1. Aedes aegypti é o mosquito vector primário para o vírus da dengue, o que provoca a febre de dengue, uma doença febril não específica que é a doença mais comum e arbovírus significativa no mundo. O vírus da dengue é, actualmente, uma ameaça para a> 2,5 bilhões de pessoas nos trópicos, com uma inciden anualce de cerca de 50 milhões de casos, resultando em ~ 24 mil mortes por ano ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. Apesar do impacto mundial devastador de doenças transmitidas por mosquitos na saúde humana, meio eficaz de prevenir e tratar essas doenças estão faltando. Controle do mosquito é atualmente o melhor método de prevenção da doença.

O potencial para o controle de doenças transmitidas por artrópodes pela manipulação genética de insetos vetores tem sido reconhecida por mais de quatro décadas ^3. Estirpes transgénicas de A. aegypti projetado para ter um específico feminino repressible flightless fenótipo fizeram recentemente o potencial para o uso de estratégias de controle de vetores transgênicos uma realidade ^4-6. Estes avanços têm desafiado os pesquisadores a identificar alvos genéticos novos para controle do vetor e meios adicionais de manipular a função do gene em mosquitos vetores. A alteração da expressão gênica durante desenvolvimento, como foi o caso em mosquitos fêmeas ^{flightless-4,} pode promover a elucidação de novas estratégias de controle do vetor. No entanto, em grande parte devido a dificuldades técnicas, as funções de muito poucos genes foram caracterizadas durante o desenvolvimento de A. gambiae, A. aegypti, ou outras espécies de mosquitos.

Desde a sua descoberta em C. elegans ^7, a interferência de RNA (RNAi), que é conservado em animais, plantas e microrganismos, tem sido amplamente utilizada para estudos genéticos funcionais em uma ampla variedade de organismos, incluindo insectos ^8,9. A via de RNAi é iniciada por Dicer, que cliva o ARNcd longos em curtos siRNAs de 20-25 nucleótidos de comprimento, que funcionam como ARN de interferência específica da sequência. silenciar genes siRNAs que são complementares em sequência através da promoção de mudança de transcritos, segmentação, e rompimento de tradução ^9. Longas moléculas de dsRNA (tipicamente 300-600 pb) ou siRNAs segmentação personalizada uma particulasequência r pode ser utilizado no laboratório de pesquisa para silenciar qualquer gene de interesse. Ao gerir quando interferência RNA é entregue, os pesquisadores podem controlar o tempo no qual gene silenciar iniciados. Esta vantagem é útil como ele pode ser usado para superar desafios como a letalidade de desenvolvimento ou esterilidade, que pode dificultar a produção e manutenção de cepas de rolamento mutações hereditárias, um processo caro e trabalhoso, que ainda não está disponível em todas as espécies de insetos. Embora o grau de silenciamento de genes por RNAi pode variar de gene para gene, tecido para tecido e animal para animal, RNAi é amplamente utilizado para a análise funcional de genes em mosquitos e outros insectos ^8,9.

Três estratégias que interferem entrega ARN têm sido usados ​​em mosquitos: microinjecção, aplicação de imersão / tópica, e ingestão. Para uma história detalhada e comparação da utilização destas três técnicas de insectos, por favor, referir-se a Yu et al ^8. We foram utilizados com sucesso microinjecção ¹⁰ como um meio de entrega de siRNAs para alvejar genes de desenvolvimento em A. embriões aegypti, larvas, pupas e ^11-14. No entanto, esta estratégia de entrega de trabalho intensivo requer tanto uma configuração de microinjeção e uma mão hábil. Além disso, a microinjeção é estressante para o organismo, um fator de confusão, especialmente quando fenótipos comportamentais serão avaliados. Por fim, a entrega microinjeção não pode ser estendida para o campo para o controle de vetores. Como alternativa, a imersão do organismo em interferir solução RNA também tornou-se um meio popular de induzir o silenciamento de genes, como é conveniente e requer pouco equipamento ou de trabalho. De imersão tem sido principalmente aplicado na linha celular de insecto estuda ^8, mas num estudo recente, foi conseguida em knockdown A. aegypti imerso numa solução de ARNcd de ^15, o que os animais pareceram ser ingestão. No entanto, para os estudos que envolvem a análise de múltiplos experimentagrupos l ou fenótipos, imersão é bastante dispendioso. Lopez-Martinez et ^{al., 16} descrito reidratação impulsionada RNAi, uma nova abordagem para entrega de RNA interferente que envolve a desidratação em solução salina e de re-hidratação com uma única gota de água contendo ARN interferente. Esta abordagem não reduzir os custos associados com a imersão dos animais todo, mas é mais caro do que a microinjecção e pode ser limitado na sua aplicação a espécies que podem tolerar elevadas pressões osmóticas. Além disso, é difícil imaginar como a imersão ou desidratação / reidratação metodologia de imersão poderia ser adaptado para o controle do vetor no campo. Por estas razões, para estudos de pós-embrionárias, a entrega de RNA de interferência com os alimentos ingeridos é uma estratégia alternativa viável.

Embora estratégias baseadas ingestão não funcionam em todas as espécies de insetos, talvez mais notavelmente Drosophila melanogaster, a administração oral de RNA de interferência misturado com alimentos promoveu si genelencing em uma variedade de insectos ^8,17, incluindo A. adultos aegypti ^18. Descrevemos quitosano mediada por ARNi de nanopartículas em A. larvas gambiae ¹⁹ e têm aplicado com sucesso esta abordagem para a redução da expressão do gene em A. aegypti ^20,21. Aqui, a metodologia para este processo de RNAi, que envolve o aprisionamento de ARN interferente por o polímero de quitosano, é detalhado. Quitosano / ARN interferentes nanopartículas são formadas por auto-montagem de policatiões com ARN interferente através das forças electrostáticas entre cargas positivas dos grupos amino na quitosana e as cargas negativas transportadas por os grupos fosfato na espinha dorsal de ARN de interferência ^19. O procedimento descrito é compatível com ambas as moléculas de dsRNA longos (a seguir denominados dsRNA) ou dupla siRNA (doravante referida como siRNA). Após a síntese, o quitosano / interferentes nanopartículas de ARN são misturados com comida de larvas e entregue aolarvas através da ingestão oral. Esta metodologia é relativamente barato, requer pouco equipamento e mão de obra ^19, e facilita a análise de alto rendimento de vários fenótipos, incluindo a análise de comportamentos ^20,21. Esta metodologia, que pode ser adaptado para estudos de silenciamento de genes em outros insectos, incluindo outros vectores de doenças e pragas de insectos agrícolas, poderia potencialmente ser usada para o silenciamento do gene numa variedade de outras espécies animais. Além disso, o quitosano, um polímero barato, não-tóxica e biodegradável ^22, poderia potencialmente ser utilizada no campo de controlo de mosquitos específica da espécie.

Protocolo

1. Mosquito Espécies e Empinar

1. Manter A. gambiae G3 e A. estirpes aegypti Liverpool IB12 (utilizadas nos estudos representativos abaixo) ou outras estirpes de interesse de acordo com a prática padrão do laboratório ou como descrito anteriormente ^23,24.

2. dsRNA e siRNA Design e Produção

1. Iniciadores de design para a construção de modelos de ARNcd longos específicos para o gene de interesse. Use a ferramenta E-RNAi ^25. Produzir ARNcd de acordo com o método de escolha ou como previamente descrito ^19.
   1. Para um controlo negativo, sintetizar dsRNA ¹⁹ que corresponde à sequência de proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidase (β-gal), ou algum outro gene não expresso em mosquitos. Se assim for desejado, o dsRNA ¹⁹ utilizados para gerar os resultados representativos resumidos abaixo pode ser utilizada como um controlo positivo. Loja dsRNA dissolvido em água livre de RNAse a -80 °; C até ser necessário.
2. Alternativamente, siRNA específico do gene de criação de acordo com a prática padrão do laboratório ou como previamente descrito ^10. Codificar a sequência de um siRNA knockdown para conceber siRNA controlo negativo que não corresponde a qualquer gene de mosquito. Compre os siRNAs personalizados, que estão disponíveis através de um número de fornecedores de confiança.
   1. Se assim for desejado, os siRNAs ^20,21 utilizado para obter os resultados representativos resumidos abaixo podem ser utilizados como controlos positivos. Loja siRNA dissolvido em água isenta de RNase à temperatura de -80 ° C até ser necessário.

3. Preparação de quitosano / ARN interferente Nanopartículas

1. Reunir RT sulfato de sódio pré-fabricados 100 mM (100 mM de Na ₂ SO ₄ em _H2O desionizada) e acetato de sódio 0,1 M (0,1 M de NaC ₂ H ₃ O ₂ -0,1 M de ácido acético, pH 4,5 em água desionizada _H2O) tampões.
2. Dissolver quitosana (≥75%desacetilada) em tampão de acetato de sódio 0,1 M para tornar a 0,02% (w / v) de solução de trabalho e manter a solução à temperatura ambiente antes da sua utilização.
3. Dissolve-se ou siRNA dsRNA em 50 ul _{de H2O} desionizada e adicioná-lo ao tampão de sulfato de sódio 100 mM a fazer uma solução de 100 ul de 32 mg de dsRNA / siRNA por 100 ul de sulfato de sódio 50 mM.
4. Adicionar 100 ul de solução de quitosano à solução de dsRNA / siRNA e, em seguida, aquecer a mistura num banho de água a 55 ° C durante 1 min. Defina-se um controlo por adição de 100 ul de sulfato de sódio 50 mM a 100 ul de solução de quitosano e seguem o mesmo procedimento.
5. Misturar as soluções imediatamente durante 30 seg por vórtice de alta velocidade à TA para facilitar a formação de nanopartículas.
6. Centrifuga-se a mistura a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente, tempo após o qual uma pastilha deve ser visível. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Secar o pellet para ≈10 min à temperatura ambiente antes de usá-lo para preparar a comida mosquito.
7. Medir a concentração de ARNcd / siARN no sobrenadante, utilizando o sobrenadante de controlo (ver 3.5), um espaço em branco para calcular a quantidade total de dsRNA / siRNA que permaneceu no sobrenadante. Use a diferença entre os valores de partida de dsRNA / siRNA e valores remanescentes nos sobrenadantes para calcular a porcentagem de dsRNA / siRNA aprisionado nas nanopartículas. Esta eficiência de carga é normalmente superior a 90%.
8. Repita o mesmo procedimento se são necessários mais nanopartículas. Use as nanopartículas secas imediatamente. O impacto do armazenamento a frio de partículas antes do uso não foi avaliado.

4. Preparando Mosquito Alimentos que contém quitosana / interferência RNA Nanopartículas

1. Preparar 1 mL de uma solução de agarose a 2% (w / v) em água desionizada, derreter a agarose, e manter a solução de agarose fundida em um banho de água 55 C antes da utilização.
2. Misture os flocos de comida de peixe (proteína bruta de 47%, min. Gordura bruta de 10%, no máximo. Fibra bruta 3%) e levedura seca em umproporção de 2: 1 (w / w). Moer a mistura de pequenas partículas com um almofariz e pilão (passável através No. 50 EUA peneiro standard). Use a comida solo, que deve ser de cor acastanhada, imediatamente ou armazená-lo em um recipiente fechado a 4 ° C durante várias semanas.
3. Em um tubo de 1,5 mL, 6 mg de misturar alimentos chão com as nanopartículas secas a partir da Secção 3.7 com um palito.
4. Adicionar 30 ul de solução de gel de agarose a 2% pré-fundido para a mistura de alimentos-nanopartícula; agitar imediata e cuidadosamente usando um palito ou pipeta de ponta.
5. Use o gel contendo alimentos e nanopartículas para alimentar as larvas do mosquito imediatamente. Alternativamente, uma vez que o gel é solidificado completamente à TA, armazenar o gel a 4 ° C e usar no dia seguinte, ou a -80 ° C para uso posterior.

5. Alimentação larvas do mosquito com alimentos que contenham Quitosana / interferência RNA Nanopartículas

1. Alimentação A. gambiae larvas de mosquito:
   1. Retirar a sipellet gel ngle do tubo de 1,5 ml usando um palito e corte-o em 6 fatias iguais, usando uma lâmina de barbear limpa ou palito de dentes.
   2. Transferência de 20 larvas de terceiro instar de um prato Petri de 500 ml contendo 100 ml de água desionizada.
   3. Alimentar as larvas do mosquito, adicionando uma fatia do pellet gel (finamente picado em pedaços menores) por placa de Petri, uma vez por dia durante quatro dias. Certifique-se de observar a alimentação das larvas no sedimento, que deve ser significativamente reduzida ou completamente ausente no dia seguinte. Depois de um tempo, os mosquitos irá desenvolver em larvas de quarto instar tarde.
   4. Registre quaisquer alterações fenotípicas visíveis durante o experimento. Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na secção 6, no final do período de quatro dias.
2. Alimentação A. aegypti larvas de mosquito:
   1. Corte o pellet gel em 6 fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou palito.
   2. Coloque 50 sincronizado-idade de 24 horas após a eclosão do ovo filarvas primeiro numa placa de petri em ≈40 mL de água desionizada.
   3. As larvas alimentam uma fatia por placa de Petri, durante 4 h / dia, em seguida, transferir as larvas de volta para a dieta larval regular de 2: 1 Terra peixes flocos de alimentos e de fermento seco para o resto do dia. Repita o procedimento diariamente ao longo dos quatro estágios larvais.
   4. Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na seção 6 aos desejados pontos de tempo de desenvolvimento.

6. Confirmação de Gene Knockdown

1. Relativa quantificação transcrição por qRT-PCR em A. aegypti e A. larvas gambiae.
   1. Executar e analisar os ensaios de qRT-PCR com três repetições biológicos em, pelo menos, 10 vs. controlo pool larvas experimental tal como descrito ^11,19,20, ou de acordo com procedimento padrão do laboratório. Os resultados representativos estão incluídas a seguir.
   2. Para a análise de uma determinada parte do tipo de tecido / body (ie., Cérebro ou antena), perform qRT-PCR como descrito em 6.1.1 seguinte dissecção para recuperar o tecido de interesse (por exemplo, ver Mysore et ai. ^21).
2. Confirmação de knockdown por hibridação in situ
   1. Sintetizar antisense marcado com digoxigenina e sentir riboprobes de controle de acordo com a prática do laboratório padrão ou como descrito ^26.
   2. Executar a hibridação in situ por o protocolo Haugen et al. ^27, para confirmação de knockdown como descrito anteriormente e ^11,20 discutido na secção de resultados representativos abaixo.
3. Confirmação de knockdown por imuno-histoquímica
   1. Se os anticorpos contra o produto de proteína do gene alvo estão disponíveis, realizar imunohistoquímica tal como anteriormente descrito ^28, o que facilita a identificação de indivíduos com os níveis mais elevados de knockdown para análise de fenótipo ^20, como exemplificado no representative seção de resultados abaixo.

Resultados

A. gambiae:

Nanopartículas de quitosano / dsRNA são formados devido à interacção electrostática entre os grupos amino de quitosano e os grupos fosfato de ARNdc. A eficiência de incorporação em nanopartículas ARNcd é geralmente superior a 90% tal como medido pela depleção de ARNcd a partir da solução. Atomic imagens de microscopia de força mostra que as médias de tamanhos de partículas de quitosano-dsRNA de 140 nm de diâmetro, que varia 100-2...

Discussão

O quitosano / interferindo metodologia de nanopartículas ARN aqui descrita tem sido usada para identificar eficazmente genes durante o desenvolvimento das larvas em A. gambiae (Figuras 2, 3) e A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, Tabelas 1, 2). Nanopartículas de quitosano podem ser preparadas com ou longo siRNA dsRNA ou, ambos os quais têm sido utilizados com sucesso em mosquitos como evidenciado pelos resultados representativos aqui descritos. Síntese de dsRNA é menos ca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings