질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

요약

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

초록

벡터 모기는 다른 생물보다 더 인간의 고통을 입힐 - 이상 백만명 매년 죽인다. 모기 게놈 프로젝트는 기본 아프리카 말라리아 벡터과 아노 펠 레스 gambiae 및 뎅기열과 황열병 벡터 Aedes aegypti의 유전학적인 연구를 포함하여 모기 생물학의 새로운 측면에서 연구를 촉진. RNA 간섭 - (RNAi-) 매개 유전자 침묵은 이러한 질병 벡터 모기 종 모두에 대한 관심의 유전자를 대상으로 사용되어왔다. 여기서는 음식 합하고 유충 섭취 RNA 간섭 나노 입자 / 키토산의 제조 과정을 설명한다. 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA에) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA의) 분자와 호환이 기술적으로 간단 높은 처리량 및 비교적 저렴한 방법은, A. 다른 유전자의 숫자의 성공적인 최저 사용되어왔다 gambiae 및 A. aegyptiQRT-PCR을 통해 또는 현장 하이브리드에 확인 유충. 애벌레의 먹이에 따라, 최저는, 적어도 후반 번데기를 유지할 수 있습니다. 이 방법론은 모기 및 농업 해충 곤충을 포함하는 다른 종의 다양한뿐만 아니라 다른 비 유기체 모델에 적용될 수있다. 연구 실험실에서 유용성 외에도 향후, 키토산, 저렴하고, 비 독성 및 생분해 성 중합체, 잠재적 분야에서 이용 될 수있다.

서문

Anopheline과 Aedine 장군의 혈액 공급 벡터 모기는 인류 최악의 재앙의 몇 가지에 대한 책임 질병을 유발하는 에이전트를 전송합니다. 추정 34억명는 매년 전 세계에 걸쳐 절반 만 죽음에 대한 책임이 말라리아, 계약에 대한 위험이 있습니다. 말라리아 특검팀에 의해 감염 말라리아 결과. 주요 아프리카 벡터과 아노 펠 레스 gambiae (를 포함하여 얼룩 날개 속의 감염된 모기의 물린 상처를 통해 사람에게 전송되는 기생충, http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) ^1. Aedes aegypti는 뎅기열, 세계에서 가장 광범위하고 중요한 arboviral 질병 비특이적 열성 질환을 일으키는 뎅기 바이러스에 대한 기본 모기 벡터이다. 뎅기열 바이러스는 매년 inciden으로, 현재 열대> 25억명에 대한 위협이다24,000 사망자 매년 ~의 결과로 약 5천만가지 경우의 CE ( http://www.cdc.gov/dengue/ 2014) ^2. 인간의 건강에 모기 매개 질병의 파괴적인 글로벌 충격에도 불구하고, 예방 및 질병 치료의 효과적인 수단이 부족하다. 모기 제어는 현재 질병 예방의 가장 좋은 방법입니다.

벡터 곤충의 유전자 조작에 의해 절지 동물 매개 질병을 제어하기위한 잠재력은 지난 4 년간 ³ 인정을 받고있다. A.의 형질 전환 균주 최근 형질 전환 벡터 제어 전략을 현실로 ^4-6를 사용하기위한 가능성을 만든 aegypti repressible 여성 고유의 날지 표현형을 가지고 설계. 이러한 발전은 벡터 및 벡터 제어 모기 유전자 기능을 조작하기위한 수단을 추가로 신규 한 유전자 표적을 식별하기 위해 연구에 도전했다. 유전자 발현 (D)의 변경을여성이 날지 모기 ^4의 경우가 있다는 uring 개발, 새로운 벡터 제어 전략의 해명을 촉진 할 수있다. 그러나, 대부분 기술적 과제를 극소수의 유전자 기능의 개발 과정 A. 특성화되었다 gambiae, A. aegypti의, 또는 다른 모기 종.

C.에서의 발견 이후 엘레 ^7은, 동물, 식물, 미생물에 보존되는 RNA 간섭 (RNAi에)는, 광범위 곤충 ^8,9 포함한 생물체의 다양한, 기능성 유전 연구에서 사용되어왔다. RNAi의 경로는 순서 특정 간섭 RNA의 기능을 짧은 20 ~ 25 염기 길이의 siRNA를로 다이 서 (Dicer), 절단 긴 dsRNA에 의해 시작됩니다. 성적 증명서 회전율, 분열, 번역 ^(9)의 중단을 촉진하여 순서에 상보적인 siRNA를 침묵 유전자. particula을 대상으로 긴 dsRNA를 분자 (일반적으로 300 ~ 600 BP) 또는 사용자 정의 된 siRNAR 열은 임의의 관심있는 유전자 사일런 싱에 대한 연구 실험실에서 사용될 수있다. RNA가 전달을 방해 할 때 관리함으로써, 연구진은 유전자에 동수를 침묵 시간을 제어 할 수 있습니다. 그것은 생산과 유전적인 돌연변이, 아직 모든 곤충 종에 존재하지 않는 비용과 노동 집약적 인 프로세스를 베어링 균주의 유지를 방해 할 수 있습니다 이러한 발달 치사 또는 불임 등의 문제를 극복하는 데 사용할 수있는 이러한 장점에 유용합니다. RNAi에 의한 유전자 침묵의 과정은 동물에게 유전자를 조직의 조직 및 동물 유전자에서 달라질 수 있지만, RNAi를 널리 모기 및 다른 곤충 ^8,9에서 유전자의 기능 분석을 위해 사용된다.

세 간섭 RNA 배달 전략은 모기에 사용되었습니다 미세 주사, 전신 / 국소 응용 프로그램 및 섭취. 자세한 역사와 곤충이 세 가지 기술의 사용의 비교를 위해, 유 등의 알 ^8을 참조하시기 바랍니다. WE 성공적 A.에서 발달 유전자를 표적으로 siRNA를 전달하는 수단으로서 마이크로 인젝션 ^10을 사용한 aegypti 배아, 유충, 번데기 ^11-14. 그러나이 노동 집약적 인 배달 전략은 미세 주사 설정 및 숙련 된 손 모두를 필요로한다. 또한, 미세 주입은 행동 표현형이 부과됩니다 특히, 생물, 교란 요인에 스트레스. 마지막으로, 마이크로 인젝션 배달 벡터 제어를위한 필드로 확장 될 수 없다. 편리하고 작은 장비 또는 노동을 필요로하는 대신, RNA 간섭을 용액에 담그는 유기체 또한, 유전자 침묵을 유도하는 인기 수단이되었다. 잠기기는 주로 곤충 세포 라인에 적용된 것은 ^8을 연구하지만, 최근의 연구에서, 최저는 A에 달성되었다 aegypti 유충 동물이 섭취하는 dsRNA 것으로 나타났다 ^(15)의 용액에 침지. 그러나, 여러 experimenta의 분석과 관련된 연구L 그룹이나 표현형은 몸을 담근 채 오히려 비용이 많이 든다. 로페즈 마르티네스 등. ^16의 RNAi, RNA 간섭을 함유하는 물을 한 방울과 식염수 탈수 재수 관련된 RNA 전달을 방해하기위한 새로운 접근 방식을 재수 구동을 설명했다. 이 접근법은 전체 동물의 침지와 관련된 비용을 절감하지만 미세 주입보다 더 비싼 높은 삼투압을 허용 할 수있는 종의 적용이 제한 될 수있다 않는다. 또한, 침지 또는 탈수 / 재수 침지 방법이 필드 벡터 제어하도록 적응 될 수있는 방법을 구상하는 것이 곤란하다. 이런 이유로, 이후의 배아 연구를 들면 음식 섭취 RNA 간섭의 배달 대안 전략이다.

섭취 기반 전략이 모든 종의 곤충, 아마도 특히 초파리에서 작동하지 않지만, 음식과 혼합 RNA 간섭의 구두 전달은 유전자의시를 승진시켰다곤충 ^8,17의 다양한 lencing 포함 A. aegypti 성인 ^18. 우리는 A에 키토산 나노 입자 매개 RNAi의 설명 gambiae 유충 ⁽¹⁹⁾ 성공적으로 A의 유전자 발현의 감소를위한이 방법을 적용했습니다 aegypti 애벌레 ^{(20, 21).} 여기서, 고분자 키토산 RNA 간섭의 포획이 포함 RNAi의 절차를위한 방법은, 상세하다. 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 키토산의 아미노기의 양전하와 RNA ¹⁹ 간섭의 백본에 인산기에 의해지지 마이너스 전하 사이의 정전기력을 통해 RNA 간섭과 폴리 양이온의 자기 조립에 의해 형성된다. 설명 된 절차는 긴 dsRNA를 분자 (이하의 siRNA로 지칭)을 가닥의 siRNA (이하 dsRNA를 라 함) 또는 이중 모두와 호환된다. 다음 합성, 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자는 애벌레 음식과 혼합에게 전달됩니다경구 섭취를 통해 유충. 이 방법론은, 비교적 저렴 작은 장비 및 인력 ^{(19)이 필요하며,} 동작 ^{(20, 21)의} 분석을 포함하는 다수의 표현형의 높은 처리량 분석을 용이하게한다. 다른 질병 벡터 및 곤충 농업 ​​해충 포함한 다른 곤충에서 유전자 침묵 과정에 대해 적응 될 수있다이 방법은, 잠재적으로 다른 동물 종의 다양한 유전자 침묵을 위해 사용될 수있다. 또한, 키토산, 저렴 무독성 생분해 성 고분자 ^(22)는 잠재적으로 종 특이 모기 제어를위한 분야에서 이용 될 수있다.

프로토콜

1. 모기 종과 양육을

1. A. 유지 gambiae의 G3와 A. aegypti 리버풀 IB12의 (아래의 대표 연구에 사용) 균주 또는 표준 실험실 연습에 또는 이전에 ^{23, 24} 설명한대로 따라 관심의 다른 균주.

2. dsRNA를하고 siRNA를 디자인 및 제작

1. 디자인 프라이머는 관심의 유전자에 특정 긴 dsRNA를 템플릿을 구성합니다. E-RNAi의 도구 ^(25)를 사용합니다. 같은 또는 선택의 방법에 따른 dsRNA를 생산 이전에 설명 ^19.
   1. 음성 대조군의 경우, 녹색 형광 단백질 (GFP), β - 갈 락토시다 제 (β-GAL), 또는 모기로 표현하지 다른 유전자의 서열에 해당하는 dsRNA ^(19)를 합성. 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 생성하기 위해 이용 된 dsRNA ^(19)은 양성 대조군으로 사용할 수있다. 스토어 dsRNA를 -80 °에서 RNAse가없는 물에 용해 된; C가 필요할 때까지.
2. 또한, 디자인 유전자 특이 적 siRNA를 표준 실험실 관행에 따라 또는 이전 ¹⁰ 설명했다. 모든 모기 유전자에 대응하지 않는 음성 대조군 siRNA의 설계를 최저의 siRNA 시퀀스를 스크램블링. 신뢰할 수있는 공급 업체의 숫자를 통해 사용할 수있는 사용자 정의 된 siRNA를 구입합니다.
   1. 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 얻기 위해 이용 된 siRNA ^{(20, 21)은} 양성 대조군으로 사용할 수있다. 필요할 때까지 보관 된 siRNA는 -80 ° C에 RNAse가없는 물에 용해시켰다.

3. R​​NA 나노 입자를 방해 / 키토산 준비

1. 미리 만들어진 RT 100 mM 염화나트륨, 황산 수집 (탈 H ₂ O 100mm의 나 ₂ SO _4), 0.1 M 아세트산 나트륨 (탈 H ₂ O 중 0.1 M NAC ₂ H ₃ O ₂ -0.1 M 아세트산, pH를 4.5) 버퍼.
2. 키토산을 용해 (≥75 %탈 아세틸) 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액 () V / w 작업 용액 0.02 %를 만들기 위해 사용하기 전에 실온에서 용액을 유지한다.
3. H ₂ O 탈 50 μL에서의 dsRNA 또는 siRNA에 용해시키고 50 mM 염화나트륨, 황산 100 ㎕ 당하는 dsRNA / siRNA를 32 μg의의 100 μL 용액을 만들기 위해 100 mM의 황산 나트륨 버퍼에 추가한다.
4. dsRNA에 / siRNA의 용액에 키토산 용액 100 μl를 첨가하고, 그 다음 1 분 동안 55 ℃에서 수욕에서 혼합물을 가열한다. 키토산 용액 100 ㎕ 50 mM 염화나트륨, 황산 100 ㎕를 첨가함으로써 제어를 설정하고 동일한 절차를 따른다.
5. 나노 입자의 형성을 촉진하기 위해 RT에서 고속 텍싱 30 초 동안 즉시 용액을 섞는다.
6. 펠릿 볼 수 있어야 그 이후 실온에서 10 분 동안 13,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 모기 음식을 준비하기 위해 그것을 사용하기 전에 실온에서 ≈10 분 펠렛을 공기 - 건조.
7. M상청액에 남아하는 dsRNA / siRNA와의 총량을 계산하는 블랭크로서 대조군 (3.5 참조)를 사용하여 상등액 상등액의 dsRNA /의 siRNA 농도를 easure. 초기의 dsRNA / siRNA의 양 및 나노 입자에 포획 된 dsRNA / siRNA의 백분율을 계산하는 상청액에 남아있는 양의 차이를 사용한다. 이 적재 효율은 일반적으로 90 % 이상이다.
8. 나노 입자가 더 필요한 경우 동일한 절차를 반복한다. 즉시 건조 된 나노 입자를 사용합니다. 사용하기 전에 입자의 저온 저장의 영향은 평가되지 않았다.

4. 모기 음식 RNA 나노 입자를 방해 / 키토산을 포함하는 시스템 준비

1. 증류수에 아가 로스를 용융 (V / w) 아가로 오스 2 % 용액 1 ㎖를 제조하고, 사용 전에 55 C 수욕에서 용융 아가로 오스 용액을 유지한다.
2. 물고기 음식 부스러기를 혼합 (47 % 조단백질, 분. 조지방 10 %, 최대. 조섬유 3 %)에서 건조 효모(w / w) 1 : 2의 비율. 박격포와 유 봉 (50 위 미국 표준 시험 체를 통해 무난)와 작은 입자의 혼합물을 갈기. 중 즉시, 색상 갈색이어야한다 분쇄 된 음식물을 사용하거나 몇 주 동안 4 ℃에서 밀봉 된 용기에 보관하십시오.
3. 1.5 ML 튜브에서, 이쑤시개와 3.7 절에서 건조 된 나노 입자로 분쇄 된 음식물의 6 mg의 혼합.
4. 식품 나노 입자 혼합물을 2 % 예비 용융 아가 로스 겔 용액 30 μL를 추가; 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 즉시 철저하게 약동하십시오.
5. 바로 모기 유충을 공급하는 음식과 나노 입자를 포함하는 겔을 사용합니다. 젤이 완전히 실온에서 응고되면 다른 방법으로, 4 ° C에서 젤을 저장하고 사용 다음날, 또는 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서.

5. 식품 RNA 나노 입자를 방해 / 키토산을 함유 모기 유충을 먹이

1. 수유 A. gambiae 모기 유충 :
   1. 시 제거이쑤시개를 사용하여 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 6 동등한 조각으로 잘라 1.5 ML 튜브에서 ngle 젤 펠릿.
   2. 100 ml의 탈 이온수를 함유하는 500 ml의 배양 접시에 20 번째 전송 령 유충.
   3. 페트리 접시에 한 번 사일을위한 하루 겔 펠렛 (미세하게 작은 조각으로 잘게) 한 조각을 추가하여 모기 유충을 먹이. 크게 크기가 감소 또는 다음날에 의해 완전히 결석해야 펠릿에 애벌레 먹이를 준수해야합니다. 시간이 지나면 모기 늦게 넷째 령 애벌레로 발전 할 것이다.
   4. 실험 기간 동안 눈에 보이는 표현형의 변화를 기록한다. 네 일의 기간이 종료 6 절에 설명 된대로 성적 수준과 다른 표현형의 변화를 검사합니다.
2. 수유 A. aegypti 모기 유충 :
   1. 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 6 동등한 조각으로 젤 펠렛을 잘라.
   2. 달걀 부화 Fi를 한 후 50 세 동기 24 시간 배치탈 이온수 ≈40 용액에 배양 접시에 첫 령 유충.
   3. 하루 중 나머지 1 접지 물고기 음식 부스러기와 건조 효모 : 다음이 정기적으로 애벌레 다이어트로 다시 유충을 전송, 4 시간 / 일에 대한 페트리 접시 당 유충 한 조각을 넣습니다. 매일 네 령 유충에 걸쳐 절차를 반복합니다.
   4. 원하는 발달 시점에서 6 절에 설명 된대로 성적 수준과 다른 표현형의 변화를 검사합니다.

유전자 넉다운 6. 확인

1. A.에 QRT-PCR에 의해 상대 성적 증명서 정량 aegypti 및 A. gambiae 애벌레.
   1. 수행하고 ^{11,19,20 설명,} 또는 표준 실험실 절차에 따라 같은 실험 유충 대 이상 10 풀링 제어 세 생물학적 복제물에 QRT-PCR 분석을 분석 할 수 있습니다. 대표 결과가 들어 있습니다.
   2. 특정 조직 유형 / 신체 일부 (예., 뇌 또는 안테나), PERFO의 분석을 위해관심있는 조직을 복구하기 위해 다음의 6.1.1에 기재된 바와 같이 절개 RM QRT-PCR은 (예를 들면, 소르 등. ^21).
2. 현장 하이브리드 화에 의한 최저의 확인
   1. digoxygenin 표지 안티센스를 합성 표준 실험실 연습에 또는 ²⁶ 설명 된대로 따라 제어 리보 프로브를 감지.
   2. 이전에 ^11,20을 설명하고 아래의 대표적인 결과 섹션에서 논의 된 바와 같이 최저의 확인을 위해 저자 Haugen 등. ⁽²⁷⁾ 프로토콜에 따라 현장 하이브리드에 실행합니다.
3. 면역 조직 화학 염색에 의한 최저의 확인
   1. 표적 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체를 사용할 수있는 경우 이전에 기술 된 바와 같이 ^28, representati에 예시 된 바와 같은 표현형 ^{분석에서 20} 녹다운의 최대 수준의 개인 식별을 용이하게, 면역 조직 화학 법을 수행아래의 결과 섹션을했습니다.

결과

A. gambiae :

키토산 / 나노 dsRNA에 의한 키토산의 아미노기와의 dsRNA의 인산기 간의 정전 상호 작용으로 형성된다. 용액으로부터의 dsRNA의 고갈에 의해 측정하는 나노 입자에 혼입하는 dsRNA의 효율은 일반적으로 90 % 이상입니다. 원자력 현미경 이미지 표시하는지 100-200 nm의 (도 1)에 이르는 직경 키토산 dsRNA에 입도 140 nm의 평균.

토론

본원에 기술 된 키토산 / RNA 간섭 나노 방법론 효과적으로 A.에서 유생 중에 유전자를 대상으로 사용되어왔다 gambiae (도 2, 3) 및 A. aegypti (도 4, 5, 6, 표 1, 2). 키토산 나노 입자는 본원에 기재된 대표적인 결과에 의해 입증되는 바와 같이 모기에서 성공적으로 사용되어왔다 둘 또는 긴 dsRNA에 siRNA를, 어느 제조 될 수있다. dsRNA에의 합성 siRNA를 구매보다 저?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings