Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Résumé

Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves.

Résumé

moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme - et tuent plus d'un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d'intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d'un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu'à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d'autres espèces d'insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d'autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l'avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d'être utilisés dans le domaine.

Introduction

moustiques vecteurs de l'alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l'humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d'un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l'infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l'homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) ^1. Aedes aegypti est le moustique vecteur principal de virus de la dengue, qui provoque de la fièvre de la dengue, une maladie fébrile non spécifique qui est l'arbovirose la plus répandue et importante dans le monde. virus de la dengue est actuellement une menace pour> 2,5 milliards de personnes dans les tropiques, avec une façon fortuite annuelleCE d'environ 50 millions de cas résultant en ~ 24 000 décès par an ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. Malgré l'impact mondial dévastateur de maladies transmises par les moustiques sur la santé humaine, des moyens efficaces de prévention et de traitement de ces maladies font défaut. lutte contre les moustiques est actuellement la meilleure méthode de prévention de la maladie.

Le potentiel de lutte contre les maladies transmises par les arthropodes par la manipulation génétique des insectes vecteurs a été reconnue depuis plus de quatre décennies ^3. Souches transgéniques de A. aegypti conçu pour avoir un phénotype spécifique de voler-femme répressible ont récemment fait la possibilité d'utiliser des stratégies de lutte antivectorielle transgéniques une réalité ^4-6. Ces progrès ont contesté les chercheurs à identifier les cibles génétiques nouvelles pour la lutte antivectorielle et des moyens supplémentaires de manipuler la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs. Altération de l'expression des gènes ddéveloppement ors, comme ce était le cas chez les moustiques femelles de ^4-voler, peut promouvoir l'élucidation des stratégies de lutte antivectorielle nouveaux. Cependant, en grande partie en raison de problèmes techniques, les fonctions de très peu de gènes ont été caractérisées au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ou d'autres espèces de moustiques.

Depuis sa découverte en C. elegans ^7, l'ARN interférence (ARNi), qui est conservé chez les animaux, les plantes et les micro-organismes, a été largement utilisé pour des études génétiques fonctionnelles dans une grande variété d'organismes, y compris les insectes ^8,9. La voie ARNi est initiée par Dicer, qui clive à long ARN double brin en courts 20-25 siRNA nucléotidiques de long qui fonctionnent comme des ARN interférents séquence-spécifique. gènes de silence siRNA qui sont complémentaires dans l'ordre par la promotion de chiffre d'affaires de la transcription, le clivage et la perturbation de la traduction ^9. Longues molécules ARN double brin (typiquement 300-600 pb) ou personnalisés siRNA ciblant un particulièremenr séquence peut être utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire taire ne importe quel gène d'intérêt. En gérant lorsque ARN interférent est livré, les chercheurs peuvent contrôler l'heure à laquelle silençage génique initiés. Cet avantage est utile car elle peut être utilisée pour surmonter des défis tels que la létalité de développement ou de stérilité, ce qui peut entraver la production et l'entretien des souches portant des mutations héréditaires, un processus coûteux et de main-d'œuvre qui ne est pas encore disponible dans toutes les espèces d'insectes. Bien que le degré de silençage génique par ARNi peut varier de gène à gène, un tissu à tissu, et un animal à l'ARNi est largement utilisé pour l'analyse fonctionnelle des gènes dans les moustiques et autres insectes ^8,9.

Trois stratégies d'interférence de livraison d'ARN ont été utilisés dans les moustiques: micro-injection, l'application trempage / topique, et ingestion. Pour une histoire détaillée et une comparaison de l'utilisation de ces trois techniques chez les insectes, se il vous plaît se référer à Yu et al ^8. We ont utilisé avec succès la micro-injection ¹⁰ comme un moyen de fournir des siRNA pour cibler les gènes du développement chez A. aegypti embryons, larves, pupes et ^11-14. Cependant, cette stratégie de prestation de main-d'œuvre exige à la fois une installation de micro-injection et une main habile. En outre, la micro-injection est stressant pour l'organisme, un facteur de confusion, en particulier lorsque phénotypes comportementaux seront évalués. Enfin, la livraison de micro-injection ne peut pas être étendu au domaine de la lutte antivectorielle. Comme alternative, le trempage l'organisme en interférant solution d'ARN est également devenu un moyen populaire d'induire le silençage génique, car il est pratique et nécessite peu d'équipement ou la main-d'œuvre. Le trempage a surtout été appliquée dans la lignée cellulaire d'insectes étudie ^8, mais dans une étude récente, knockdown a été atteint en A. larves de aegypti immergé dans une solution de ¹⁵ l'ARN double brin, où les animaux semblaient être ingéré. Cependant, les études portant sur l'analyse de plusieurs experimentagroupes de L ou phénotypes, le trempage est assez coûteux. Lopez-Martinez et al. ¹⁶ décrit réhydratation entraîné ARNi, une nouvelle approche pour la livraison de l'ARN interférant qui implique la déshydratation dans une solution saline et la réhydratation avec une seule goutte d'eau contenant de l'ARN interférant. Cette approche ne coupe les coûts associés à l'immersion de l'animal entier, mais est plus cher que la micro-injection et peut être limitée dans son application aux espèces qui peuvent tolérer fortes pressions osmotiques. En outre, il est difficile d'imaginer comment l'immersion ou la méthode d'immersion / de réhydratation de déshydratation pourraient être adaptées pour la lutte antivectorielle dans le domaine. Pour ces raisons, pour les études post-embryonnaires, la livraison des ARN interférant avec de la nourriture ingérée est une stratégie alternative viable.

Bien que des stratégies fondées sur l'ingestion-ne fonctionnent pas chez toutes les espèces d'insectes, peut-être surtout Drosophila melanogaster, l'administration orale d'ARN interférents mélangé avec de la nourriture a favorisé si géniquelencing dans une variété d'insectes ^8,17, y compris A. aegypti adultes ^18. Nous avons décrit des nanoparticules de chitosan à médiation par ARNi dans A. gambiae larves ¹⁹ et ont appliqué avec succès cette approche pour la réduction de l'expression génique dans A. aegypti larves ^20,21. Ici, la méthodologie pour cette procédure ARNi, qui consiste à piéger des ARN interférents par le chitosane de polymère, est détaillée. Chitosan / ARN interférents nanoparticules sont formées par auto-assemblage de polycations avec des ARN interférent par les forces électrostatiques entre les charges positives des groupes amino dans le chitosane et les charges négatives portées par les groupes phosphate sur le squelette de ¹⁹ l'ARN interférent. La procédure décrite est compatible avec les molécules d'ARNdb longs (ci-après dénommée ARN double brin) ou double brin siRNA (ci-après dénommé siRNA). Après la synthèse, le chitosane / interférents nanoparticules d'ARN sont mélangés avec de la nourriture des larves et livrés àlarves à l'ingestion. Cette méthodologie est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériel et la main-d'œuvre ^19, et facilite l'analyse à haut débit de plusieurs phénotypes, incluant l'analyse des comportements ^20,21. Cette méthode, qui peut être adaptée pour les études d'inactivation de gène dans d'autres insectes, y compris d'autres vecteurs de maladies et les insectes nuisibles agricoles, pourrait être utilisée pour le silençage génique dans une variété d'autres espèces animales. En outre, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable ^22, pourrait être utilisée dans le domaine de lutte contre les moustiques spécifique de l'espèce.

Protocole

1. Mosquito espèces et l'élevage

1. Maintenir A. gambiae G3 et A. souches aegypti Liverpool IB12 (utilisés dans les études représentatives ci-dessous) ou d'autres souches d'intérêt conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment ^23,24.

2. ARNdb et siRNA Conception et production

1. Concevoir des amorces pour construire des modèles de longs ARNdb spécifiques du gène d'intérêt. Utilisez l'outil E-ARNi ^25. Produire ARNdb selon la méthode de choix ou ¹⁹ comme décrit précédemment.
   1. Pour un témoin négatif, ¹⁹ synthétiser l'ARN double brin correspondant à la séquence de la protéine fluorescente verte (GFP), la β-galactosidase (β-gal) ou un autre gène non exprimé chez les moustiques. Si on le souhaite, ¹⁹ l'ARNdb utilisé pour générer les résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peut être utilisé comme témoin positif. Magasin ARNdb dissous dans l'eau sans RNAse à -80 °; C jusqu'à utilisation.
2. Alternativement, la conception siRNA spécifique du gène selon la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment ^10. Brouiller la séquence d'un effet de choc pour concevoir siRNA siRNA contrôle négatif qui ne correspond pas à ne importe quel gène de moustique. Achetez les siRNA personnalisés, qui sont disponibles à travers un certain nombre de vendeurs de bonne réputation.
   1. Si on le souhaite, des siRNA ^20,21 utilisée pour obtenir des résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peuvent être utilisés comme témoins positifs. Magasin siRNA dissous dans l'eau sans RNase à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Préparation de chitosane / ARN interférent nanoparticules

1. Recueillir le sulfate de sodium 100 mM RT pré-fabriqué (100 mM de Na ₂ SO ₄ dans H ₂ O déminéralisée) et de l'acétate de sodium 0,1 M (0,1 M NaCl ₂ H ₃ O ₂ -0,1 M d'acide acétique, pH 4,5 dans désionisée H ₂ O) tampons.
2. Dissoudre chitosane (≥75%désacétylée) dans du tampon acétate de sodium 0,1 M pour faire 0,02% (p / v) de solution de travail et maintenir la solution à la température ambiante avant utilisation.
3. Dissoudre ARNdb ou siRNA dans 50 ul _de H ₂ O déminéralisée et l'ajouter au tampon de sulfate de sodium 100 mM pour obtenir une solution de 100 ul de 32 ug d'ARN double brin / siRNA pour 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM.
4. Ajouter 100 ul de solution de chitosane dans la solution ARNdb / siRNA, puis chauffer le mélange dans un bain d'eau à 55 ° C pendant 1 min. Mettre en place un contrôle par addition de 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM à 100 pi de solution de chitosane et suivre la même procédure.
5. Mélanger les solutions immédiatement pendant 30 secondes au vortex à grande vitesse à la température ambiante pour faciliter la formation de nanoparticules.
6. Centrifuger le mélange à 13 000 xg pendant 10 min à température ambiante, temps au bout duquel une pastille doit être visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Air-sécher le culot pour ≈10 min à température ambiante avant de l'utiliser pour préparer la nourriture de moustique.
7. Mesure la concentration de l'ARN double brin / siRNA dans le surnageant en utilisant le surnageant de la commande (voir 3.5) comme un blanc pour calculer le montant total de l'ARN double brin / siRNA qui restait dans le surnageant. Utiliser la différence entre les montants de départ de l'ARN double brin / siRNA et les montants restants dans les surnageants pour calculer le pourcentage d'ARNdb / siRNA piégé dans les nanoparticules. Cette efficacité de chargement est normalement plus de 90%.
8. Répétez la même procédure si plus de nanoparticules sont nécessaires. Utiliser immédiatement les nanoparticules séchées. L'impact de l'entreposage frigorifique des particules avant l'utilisation n'a pas été évaluée.

4. Préparation des aliments contenant du chitosane Mosquito / ARN interférent nanoparticules

1. Préparer 1 ml d'une solution d'agarose à 2% (p / v) dans de l'eau déminéralisée, faire fondre l'agarose, et de garder solution d'agarose fondu dans un bain de 55 ° C de l'eau avant utilisation.
2. Mélangez les flocons de nourriture pour les poissons (47% de protéines brutes, min. Matières grasses brutes 10%, max. Cellulose brute de 3%) et la levure sèche à unerapport de 2: 1 (p / p). Broyer le mélange à de petites particules avec un mortier et un pilon (passer à travers n ° 50 USA tamis standard). Utilisez la nourriture au sol, qui devrait être de couleur brunâtre, soit immédiatement, soit le stocker dans un récipient étanche à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
3. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 6 mg de nourriture au sol avec les nanoparticules séchées de la section 3.7 avec un cure-dent.
4. Ajouter 30 ul d'une solution à 2% de pré-gel d'agarose fondu au mélange alimentaire nanoparticules; remuer immédiatement et abondamment à l'aide d'une pointe de cure-dent ou pipette.
5. Utiliser le gel contenant de la nourriture et des nanoparticules pour alimenter les larves de moustiques immédiatement. En variante, une fois que le gel est complètement solidifié à la température ambiante, le gel stocker à 4 ° C et en utilisant le lendemain, ou à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

5. Nourrir larves de moustiques avec les aliments contenant du chitosane / ARN interférent nanoparticules

1. Alimentation A. gambiae larves de moustiques:
   1. Suppression d'un SIngle granulés de gel du tube de 1,5 ml en utilisant un cure-dent et le couper en six tranches égales en utilisant une lame de rasoir propre ou un cure-dent.
   2. 20 Transfert de troisième stade larvaire dans une boîte de Petri de 500 ml contenant 100 ml d'eau désionisée.
   3. Nourrir les larves de moustiques en ajoutant une tranche de la pastille de gel (finement haché en petits morceaux) par boîte de Pétri une fois par jour pendant quatre jours. Veillez à respecter les larves se nourrissent de la pastille, qui devrait être considérablement réduite en taille ou complètement absent le lendemain. Après un temps, les moustiques se développeront en fin de quatrième stade larvaire.
   4. Enregistrez les modifications phénotypiques visibles pendant l'expérience. Examiner les niveaux de transcription et d'autres changements phénotypiques comme indiqué dans l'article 6 à la fin de la période de quatre jours.
2. Alimentation A. aegypti larves de moustiques:
   1. Couper la pastille de gel en tranches égales 6 en utilisant une lame de rasoir propre ou cure-dent.
   2. Placez 50 ans synchronisé 24 heures après l'éclosion des œufs fipremier stade larvaire dans une boîte de Pétri en ≈40 ml d'eau déminéralisée.
   3. Les larves se nourrissent une tranche par boîte de Pétri pendant 4 heures / jour, puis de transférer les larves de retour à l'alimentation des larves régulière de 2: 1 sol flocons de nourriture pour les poissons et la levure sèche pour le reste de la journée. Répéter l'opération tous les jours pendant les quatre stades larvaires.
   4. Examiner les niveaux de transcription et d'autres changements phénotypiques comme indiqué dans l'article 6 sur les points souhaités de temps de développement.

6. Confirmation de Gene Knockdown

1. Transcription relative quantification par qRT-PCR dans A. aegypti et A. larves gambiae.
   1. Effectuer et analyser des essais qRT-PCR avec trois répétitions biologiques sur au moins 10 commande groupée vs larves expérimentale comme décrit ^11,19,20, ou selon la procédure de laboratoire standard. Les résultats représentatifs sont incluses ci-dessous.
   2. Pour l'analyse d'une partie notamment le type de tissu / corps (ie., Le cerveau ou antenne), perform qRT-PCR comme décrit dans 6.1.1 dissection suivante pour récupérer le tissu d'intérêt (par exemple, voir Mysore et al. ^21).
2. Confirmation de l'effet de choc par hybridation in situ
   1. Synthétiser antisens digoxygénine marqué et le sens ribosondes de contrôle conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit ^26.
   2. Exécuter une hybridation in situ par le protocole Haugen et al. ²⁷ pour la confirmation d'effet de choc, comme décrit précédemment dans ^11,20 et discuté dans la section des résultats représentatifs ci-dessous.
3. Confirmation de l'effet de choc par immunohistochimie
   1. Si des anticorps contre le produit protéique du gène ciblé sont disponibles, effectuer l'immunohistochimie comme décrit précédemment ^28, ce qui facilite l'identification des personnes ayant les plus grands niveaux de knock-down pour l'analyse du phénotype ²⁰ comme illustré dans la representative section des résultats ci-dessous.

Résultats

A. gambiae:

Des nanoparticules de chitosan / ARNdb sont formées grâce à l'interaction électrostatique entre les groupes amino du chitosane et les groupements phosphate de l'ARN double brin. L'efficacité de l'incorporation dans l'ARN double brin nanoparticules est généralement supérieure à 90% telle que mesurée par l'appauvrissement de l'ARN double brin à partir de la solution. Atomiques images de microscopie de force mont...

Discussion

Le / interférer méthodologie de nanoparticules d'ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings