Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

Riepilogo

Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.

Abstract

Zanzare vettore infliggono sofferenze più umano di qualsiasi altro organismo - e uccidono più di un milione di persone ogni anno. I progetti genoma zanzara facilitato la ricerca in nuove sfaccettature della biologia della zanzara, inclusi studi genetici funzionali nel primario malaria vettore africano Anopheles gambiae e la dengue e la febbre gialla vettore Aedes aegypti. RNA interferenze (RNAi-) mediato silenziamento genico è stato utilizzato per colpire geni di interesse in entrambe le specie di zanzare vettori della malattia. Qui, descriviamo un procedimento per la preparazione di chitosano / interferenti nanoparticelle RNA che si combinano con il cibo e ingerite dalle larve. Questo tecnicamente semplice, ad alta velocità, e la metodologia relativamente poco costoso, che è compatibile con lunghi RNA a doppio filamento (dsRNA) o piccole interferenti RNA (siRNA) molecole, è stato utilizzato per il colpo di successo di diversi geni in A. gambiae e A. aegyptilarve. Dopo poppate larvali, atterramento, che viene verificata attraverso qRT-PCR o ibridazione in situ, possono persistere almeno fino alla fase avanzata di pupa. Questo metodo può essere applicabile ad un'ampia varietà di zanzare ed altri specie di insetti infestanti, compresi agricoli, nonché altri organismi non-modello. Oltre alla sua utilità nel laboratorio di ricerca, in futuro, chitosano, un polimero poco costoso, non tossico e biodegradabile, potrebbero essere utilizzati nel campo.

Introduzione

Zanzare sanguigni che alimentano vettore dei generi anofele e Aedine trasmettere agenti patogeni responsabili di alcuni dei peggiori flagelli dell'umanità. Si stima che 3,4 miliardi di persone sono a rischio di contrarre la malaria, che è responsabile di oltre mezzo milione di morti ogni anno in tutto il mondo. Risultati malaria da infezione da Plasmodium sp. Parassiti, che sono trasmessi alle persone attraverso le punture di zanzare infette del genere Anopheles, tra cui il principale vettore africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) ^1. Aedes aegypti è la zanzara vettore primario per il virus dengue, che causa la febbre dengue, una malattia febbrile aspecifica che è la più diffusa e significativa malattia arbovirali nel mondo. Virus dengue è attualmente una minaccia per la> 2,5 miliardi di persone ai tropici, con un inciden annualece di circa 50 milioni di casi con conseguente ~ 24.000 decessi all'anno ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. Nonostante l'impatto globale devastante di malattie trasmesse dalle zanzare sulla salute umana, mezzo efficace per prevenire e curare queste malattie sono carenti. Controllo delle zanzare è attualmente il miglior metodo di prevenzione delle malattie.

Il potenziale per il controllo delle malattie trasmesse da artropodi di manipolazione genetica degli insetti vettori è stato riconosciuto da più di quattro decenni ^3. Ceppi transgenici di A. aegypti progettato per avere un reprimibile specifico femminile di volare fenotipo hanno recentemente fatto il potenziale per l'utilizzo di strategie di controllo vettoriale transgenici una realtà ^4-6. Questi progressi hanno sfidato i ricercatori di individuare bersagli genetici nuovi per il controllo vettoriale e ulteriori mezzi di manipolare la funzione del gene in zanzare vettore. L'alterazione di espressione genica durante sviluppo, come è avvenuto in zanzare femmina-volare ^4, può favorire il chiarimento delle nuove strategie di controllo vettoriale. Tuttavia, soprattutto a causa sfide tecniche, le funzioni di pochissimi geni sono stati caratterizzati durante lo sviluppo di A. gambiae, A. aegypti, o altre specie di zanzare.

Fin dalla sua scoperta nel C. elegans ^7, interferenza RNA (RNAi), che viene conservata in animali, piante e microorganismi, è stato ampiamente utilizzato per studi genetici funzionali in un'ampia varietà di organismi, compresi gli insetti ^8,9. Il percorso RNAi è iniziata da Dicer, che scinde lungo dsRNA in brevi 20-25 siRNA nucleotidi a lungo che funzionano come specifica sequenza RNA interferenti. geni silenzio siRNA complementari in sequenza attraverso la promozione di fatturato trascrizione, scissione, e la rottura di traduzione ^9. Molecole dsRNA lunghi (in genere 300-600 bp) o siRNA targeting personalizzato una particulasequenza r può essere utilizzato in laboratorio ricerca di silenziamento qualsiasi gene di interesse. Gestendo quando interfering RNA viene consegnato, i ricercatori possono controllare il momento in cui silenziamento genico iniziati. Questo vantaggio è utile in quanto può essere utilizzato per superare sfide come letalità sviluppo o sterilità, che possono ostacolare la produzione e manutenzione di ceppi recanti mutazioni ereditarie, un processo costoso e laborioso che non è ancora disponibile in tutte le specie di insetti. Benché il grado di silenziamento genico da RNAi può variare da gene gene, tessuto a tessuto e animale all'altro, RNAi è ampiamente usato per analisi funzionale di geni in zanzare ed altri insetti ^8,9.

Tre interferenti strategie consegna RNA sono state utilizzate in zanzare: microiniezione, ammollo / applicazione topica, e l'ingestione. Per una storia dettagliata e confronto tra l'utilizzo di queste tre tecniche di insetti, consultare Yu et al ^8. We hanno utilizzato con successo la microiniezione ¹⁰ come un mezzo per trasmettere siRNA per indirizzare geni dello sviluppo in A. embrioni aegypti, larve, pupe e ^11-14. Tuttavia, questa strategia consegna intensità di lavoro richiede sia una configurazione microiniezione e una mano esperta. Inoltre, microiniezione è stressante per l'organismo, un fattore di confusione, in particolare quando saranno valutati fenotipi comportamentali. Infine, la consegna microiniezione non può essere esteso al campo per il controllo vettoriale. In alternativa, l'organismo ammollo in soluzione RNA interferente è anche diventare un mezzo popolare di indurre silenziamento genico, come è conveniente e richiede attrezzature poco o di lavoro. Ammollo è stata applicata principalmente nella linea cellulare di insetto studia ^8, ma in un recente studio, l'abbattimento è stato raggiunto in A. aegypti larve immerso in una soluzione di dsRNA ^15, che gli animali sembravano ingestione. Tuttavia, per gli studi che coinvolgono l'analisi di molteplici experimentagruppi litri o fenotipi, immersione è piuttosto costoso. Lopez-Martinez et al. ¹⁶ descritto reidratazione guidato RNAi, un nuovo approccio per la consegna interferenza RNA che coinvolge la disidratazione in soluzione salina e reidratazione con una sola goccia di acqua contenente RNA interferenti. Questo approccio non tagliare i costi associati con tutto immersione animale, ma è più costoso di microiniezione e può essere limitata nella sua applicazione alle specie che possono tollerare alte pressioni osmotiche. Inoltre, è difficile immaginare come immersione o disidratazione / reidratazione metodologia immersione potrebbero essere adattati per il controllo vettoriale nel campo. Per queste ragioni, per studi post-embrionali, la consegna di RNA interferenti con il cibo ingerito è una strategia valida alternativa.

Benché le strategie basate ingestione-non funzionano in tutte le specie di insetti, forse in particolare Drosophila melanogaster, la consegna orale di RNA interferenti mescolato al cibo ha promosso gene silencing in una varietà di insetti ^8,17, comprese A. adulti aegypti ^18. Abbiamo descritto chitosano nanoparticelle mediata RNAi in A. gambiae larve ¹⁹ e hanno applicato con successo questo approccio per la riduzione dell'espressione genica in A. aegypti larve ^20,21. Qui, metodologia per questa procedura RNAi, che comporta intrappolamento di interferire RNA dal chitosano polimero, è dettagliato. Chitosano / RNA interferenti nanoparticelle sono formate da auto-assemblaggio di policationi con interferenza RNA attraverso le forze elettrostatiche tra cariche positive dei gruppi amminici in chitosano e cariche negative portate dai gruppi fosfato sul backbone di interferire RNA ^19. La procedura descritta è compatibile con entrambe le molecole dsRNA lunghi (di seguito denominati dsRNA) o doppio filamento siRNA (di seguito denominato siRNA). A seguito di sintesi, chitosano / interferenti nanoparticelle RNA sono mescolati con il cibo larvale e consegnatilarve per ingestione. Questa metodologia è relativamente poco costoso, richiede poca attrezzatura e del lavoro ^19, e facilita l'analisi high-throughput di più fenotipi, compresa l'analisi dei comportamenti ^20,21. Questa metodologia, che può essere adattato per studi silenziamento genico in altri insetti, compresi altri vettori di malattie e parassiti agricoli insetti, potrebbe essere utilizzato per il silenziamento genico in una varietà di altre specie animali. Inoltre, chitosano, un poco costoso, non tossico e biodegradabile polimero ^22, potrebbe potenzialmente essere utilizzato nel campo del controllo della zanzara specie-specifico.

Protocollo

1. Mosquito Specie e allevamento

1. Mantenere A. gambiae G3 e A. ceppi aegypti Liverpool IB12 (utilizzati negli studi rappresentativi sotto) o da altri ceppi di interesse secondo prassi di laboratorio standard o come descritto in precedenza ^23,24.

2. dsRNA e siRNA Progettazione e Produzione

1. Primer design per costruire modelli lunghi dsRNA specifiche per il gene di interesse. Utilizzare lo strumento E-RNAi ^25. Produrre dsRNA secondo il metodo di scelta o come descritto in precedenza ^19.
   1. Per un controllo negativo, sintetizzare dsRNA ¹⁹ corrispondente alla sequenza della proteina fluorescente verde (GFP), β-galattosidasi (β-gal), o qualche altro gene non espresso in zanzare. Se lo si desidera, dsRNA ¹⁹ utilizzato per generare i risultati rappresentativi riassunte di seguito può essere utilizzato come controllo positivo. Conservare dsRNA disciolto in acqua priva di RNAse a -80 °; C fino al momento dell'uso.
2. In alternativa, il design siRNA specifici gene secondo la prassi di laboratorio standard o come descritto in precedenza ^10. Rimescolare la sequenza di un knockdown siRNA progettare siRNA controllo negativo che non corrisponde a qualsiasi gene zanzara. Acquistare i siRNA personalizzati, disponibili attraverso una serie di fornitori affidabili.
   1. Se lo si desidera, siRNA ^20,21 utilizzato per ottenere i risultati rappresentativi riassunte di seguito possono essere utilizzati come controlli positivi. Conservare siRNA disciolto in acqua RNase-free a -80 ° C fino al momento.

3. Preparare chitosano / RNA interferenti nanoparticelle

1. Raccogliere RT 100 mM sodio solfato pre-made (100 mM Na ₂ SO ₄ in H ₂ O deionizzata) e 0,1 M di acetato di sodio (0,1 M NaC ₂ H ₃ O ₂ -0.1 M acido acetico, pH 4,5 in deionizzata H ₂ O) buffer.
2. Sciogliere chitosano (≥75%deacetilato) in tampone acetato 0,1 M di sodio per rendere 0,02% (w / v) Soluzione di lavoro e mantenere la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso.
3. Sciogliere dsRNA o siRNA in 50 ml di acqua deionizzata H ₂ O e aggiungere al buffer solfato di sodio 100 mM per ottenere una soluzione a 100 ml di 32 mg di dsRNA / siRNA per 100 ml di 50 mM solfato di sodio.
4. Aggiungere 100 pl di soluzione di chitosano alla soluzione dsRNA / siRNA e poi riscaldare la miscela in un bagno di acqua a 55 ° C per 1 min. Impostare un controllo aggiungendo 100 ml di 50 mM sodio solfato a 100 ml di soluzione di chitosano e seguire la stessa procedura.
5. Mescolare le soluzioni immediatamente per 30 sec nel vortex ad alta velocità a RT per facilitare la formazione di nanoparticelle.
6. Centrifugare la miscela a 13.000 xg per 10 min a RT, dopo di che una pastiglia deve essere visibile. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Asciugare il pellet per ≈10 min a RT prima di utilizzarla per preparare il cibo zanzare.
7. Misura la concentrazione di dsRNA / siRNA nel surnatante utilizzando il surnatante dal controllo (cfr 3,5) come uno spazio vuoto per calcolare la quantità totale di dsRNA / siRNA che è rimasto nel surnatante. Utilizzare la differenza tra gli importi di base delle dsRNA / siRNA e gli importi residui nei sopranatanti per calcolare la percentuale di dsRNA / siRNA intrappolato in nanoparticelle. Questa efficienza di caricamento è normalmente superiore al 90%.
8. Ripetere la stessa procedura se sono necessari ulteriori nanoparticelle. Utilizzare immediatamente le nanoparticelle secche. L'impatto di conservazione frigorifera di particelle prima dell'uso non è stata valutata.

4. Preparazione Mosquito alimentare contenente chitosano / RNA interferenti nanoparticelle

1. Preparare 1 ml di una soluzione di agarosio al 2% (w / v) in acqua deionizzata, sciogliere l'agarosio, e conservare la soluzione di agarosio fuso in un bagno di acqua 55 C prima dell'uso.
2. Mescolare fiocchi alimentari di pesce (47% di proteine ​​gregge, min. 10% grassi greggi, max. Fibra grezza 3%) e lievito secco in unrapporto di 2: 1 (w / w). Macinare il composto a piccole particelle con un mortaio e pestello (percorribile attraverso n ° 50 USA setaccio di prova standard). Utilizzare il cibo a terra, che dovrebbe essere di colore marrone, immediatamente o conservarla in un contenitore sigillato a 4 ° C per diverse settimane.
3. In una provetta da 1,5 ml, mescolare 6 mg di cibo a terra con le nanoparticelle secche Sezione 3.7 con uno stuzzicadenti.
4. Aggiungere 30 ml di soluzione di gel di agarosio 2% pre-fusa alla miscela alimentare nanoparticelle; mescolate immediatamente e accuratamente utilizzando una punta stuzzicadenti o pipetta.
5. Utilizzare il gel contenente cibo e nanoparticelle per alimentare immediatamente le larve di zanzara. In alternativa, una volta che il gel è completamente solidificato a temperatura ambiente, memorizzare il gel a 4 ° C e utilizzare il giorno successivo, oa -80 ° C per un uso successivo.

5. Alimentazione Mosquito Larve con alimenti contenenti chitosano / RNA interferenti nanoparticelle

1. Alimentazione A. gambiae larve di zanzara:
   1. Rimuovere un single gel pellet dal tubo di 1,5 ml con uno stuzzicadenti e tagliarlo a 6 fette uguali con una lama di rasoio pulito o stuzzicadenti.
   2. Trasferimento 20 larve al terzo stadio di una piastra di Petri da 500 ml contenente 100 ml di acqua deionizzata.
   3. Feed le larve della zanzara aggiungendo una fetta di pellet gel (tritato in pezzi più piccoli) a piatto Petri una volta al giorno per quattro giorni. Assicurarsi di osservare l'alimentazione delle larve sul pellet, che dovrebbe essere ridotto significativamente in dimensioni o del tutto assente dal giorno successivo. Dopo il tempo, le zanzare si svilupperà in fine del quarto larve instar.
   4. Registrare eventuali modifiche fenotipiche visibili durante l'esperimento. Esaminate i livelli di trascrizione e altre variazioni fenotipiche come discusso nella sezione 6 alla fine del periodo di quattro giorni.
2. Alimentazione A. aegypti larve di zanzara:
   1. Tagliare il pellet di gel in 6 fette uguali con una lama di rasoio pulito o stuzzicadenti.
   2. Posizionare i 50 anni-sincronizzato 24 ore dopo la schiusa delle uova fiprima instar larve in una capsula di Petri in ≈40 ml di acqua deionizzata.
   3. Larve si nutrono una fetta per ogni capsula di Petri per 4 ore / giorno, quindi trasferire le larve di nuovo alla dieta larvale regolare di 2: 1 a terra fiocchi alimentari di pesce e di lievito secco per il resto della giornata. Ripetere quotidianamente nei quattro stadi larvali.
   4. Esaminare i livelli di trascrizione e di altri cambiamenti fenotipici come discusso nella sezione 6 nei punti di tempo di sviluppo desiderati.

6. Conferma di Gene Knockdown

1. Relativa trascrizione quantificazione da qRT-PCR in A. aegypti e A. gambiae larve.
   1. Eseguire ed analizzare saggi qRT-PCR con tre repliche biologiche su almeno il 10 pool di controllo contro le larve sperimentale riportato ^11,19,20, o secondo procedure di laboratorio standard. I risultati rappresentativi sono stati inseriti.
   2. Per l'analisi di una parte particolare tipo di tessuto / corpo (es., Il cervello o antenna), PERFOrm qRT-PCR come descritto nella seguente 6.1.1 dissezione per recuperare il tessuto di interesse (ad esempio, vedere Mysore et al. ^21).
2. Conferma della atterramento da ibridazione in situ
   1. Sintetizzare antisenso digossigenina marcato e percepire riboprobes controllo secondo le prassi di laboratorio standard o come descritto ^26.
   2. Eseguire ibridazione in situ per il protocollo Haugen et al. ²⁷ per la conferma di atterramento come descritto in precedenza ^11,20 e discusso nella sezione risultati rappresentativi di seguito.
3. La conferma di atterramento immunoistochimica
   1. Se sono disponibili anticorpi contro il prodotto proteico del gene targeting, eseguire immunoistochimica come descritto in precedenza ^28, che facilita l'identificazione dei soggetti con i maggiori livelli di knockdown per l'analisi del fenotipo ²⁰ come esemplificato nella representative la sezione risultati qui sotto.

Risultati

A. gambiae:

Nanoparticelle Chitosan / dsRNA si formano a causa della interazione elettrostatica tra i gruppi amminici del chitosano ei gruppi fosfato di dsRNA. L'efficienza di dsRNA incorporazione in nanoparticelle è generalmente superiore al 90% come misurato dalla deplezione del dsRNA dalla soluzione. Immagini microscopia a forza atomica mostrano che il chitosano-dsRNA medie dimensioni delle particelle 140 nm di diametro, che vanno 100-200 nm (F...

Discussione

Il chitosano / interferenti metodologia nanoparticelle RNA qui descritto è stato utilizzato per indirizzare efficacemente i geni durante lo sviluppo larvale in A. gambiae (figure 2, 3) e A. aegypti (figure 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Nanoparticelle chitosano possono essere preparati sia con lunghi dsRNA o siRNA, entrambi i quali sono stati utilizzati con successo in zanzare, come dimostrano i risultati rappresentativi qui descritti. Sintesi di dsRNA è meno costoso rispet...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings