Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Özet

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Özet

Tüm yeni nesil dizileme (NGS) prosedürleri biyoinformatik boru hatları ( "kuru tezgah") kullanılarak gerçekleştirilmiştir analizleri ( "ıslak tezgah") ve veri laboratuar tezgah yapılan tahliller yer alıyor. Her iki element klinik laboratuvarlar için özellikle kritik olan doğru ve güvenilir sonuçlar üretmek için gereklidir. Hedeflenen NGS teknolojileri giderek önceden hassas ilaç hedeflerine ulaşmasına yardımcı olmak için onkoloji uygulamalarında lehine bulduk, ama yöntemler genellikle kesilir ve ıslak ve kuru tezgah iş akışları ve koordinasyonsuzluk reaktif setleri değişkendir barındırır. Bu yazıda, dizi kapsamlı hedef NGS sisteminin bir örnek olarak, 21 gen paneli olan kanser örnekleri zorlu için bir yöntem tarif eder. Sistem bağımsız biyoinformatik paketi ile analitik-doğrulanmış, tek kaynaklı reaktifler kullanılarak fonksiyonel DNA miktarının ve yeterlilik, tek tüp mültipleksli PCR zenginleşme ve kütüphane arınma ve normalleşme bütünleştirir.Sonuç olarak, doğru varyantı aramalar düşük kaliteli ve düşük miktar formalin ile fikse, parafine gömülü (FFPE) ve ince iğne aspirasyon (FNA) tümör biyopsileri elde edilebilir. yöntem rutin 400 çoğaltılabilir DNA kopyası bir girişten kanserle ilişkili varyantları değerlendirmek ve yeni gen içeriğine uygun olarak tasarım modüler olduğunu. analitik tanımlanmış kontroller iki farklı türde klinik olarak ilgili örnekleri ile kalite güvencesi ve yardım koruma çağrısı doğruluğunu sağlamak. Esnek "etiket" PCR adımı ortak tezgah NGS enstrümanları ile örnek barkod ve uyumluluk sağlamak için platforma özel adaptörler ve endeks kodlarını gömer. Önemlisi, protokol aerodinamik ve tek bir gün içinde 24 dizi hazır kütüphaneleri üretebilir. Son olarak, yaklaşım mutasyon tespit doğruluğunu geliştirmek ve yalancı negatif ve indeterm ayırt etmek için algoritmalar çağıran varyantı doğrudan pre-analitik numune kalite kontrol sonuçları birleştirerek ıslak ve kuru tezgah süreçlerini bağlantılarrafinat aramalar. Bu hedef NGS yöntemi wetware ve yüksek derinlik, çoklanmış sıralama ve teşhis uygulamaları için heterojen kanser örneklerinin hassas analiz elde etmek yazılım hem de gelişmeleri kullanmaktadır.

Giriş

Hassas tıp hastaları için tanı ve tedavi seçenekleri bireyselleştirilmesi dayanır. özel tedavilerin söz moleküler tanı ve hedefli tedavilerin bağlantıyı bilgilendirebilir hastalık yollarının daha iyi anlaşılması doğrudan bir sonucudur. Örneğin, moleküler hedefli tedavilerin kullanılması 2013 ¹ 2003 den% 46% 11 yükselmiştir ve vemurafenib ve krizotinib gibi anti-kanser ilaçları arkadaşı tanısal testler ile FDA silinir. doğru son derece çoklanmış örnek setleri arasında düşük bolluk dizisi hedefleri kurtarmak için onun yeteneği ile yeni nesil dizileme (NGS) kanseri ile ilişkili genetik anormallikleri değerlendirmek ve hassas tıp moleküler hedeflerin belirlenmesi için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır.

Moleküler test için en yaygın solid tümör biyopsileri formalin ile fikse dahil, parafine gömülü (FFPE) ve ince iğne aspirasyon (FNA) specimens. Bu örnekler, düşük miktar ve / veya düşük kaliteli doğru NGS ^2-5 kıymetlendirmeler meydan nükleik asitler ile doludur. Bu örneklerin analizi için günümüzde piyasada NGS yöntemleri farklı reaktifler, protokoller ve sürekli iyileştirmeler hareketli hedefleri temsil bilişim araçları patchwork dayanmaktadır. Örneğin, tahlil kimyaları ve / veya yazılım değişiklikleri en sık kullanılan hedef NGS kitleri ⁶ her 1-2 ayda bir meydana geldi. Bu istikrarsızlık oluşturmak ve özellikle kanser testi için, zorlu örnek türleri için bir birleşik NGS sistemi doğrulamada tutarlılık eksikliği yansıtır ve örnek-to-sonuçlarından optimize edilmiştir yapışkan protokolleri geliştirmek için laboratuvarlar üzerine aşırı yük koyar. Nitekim, NGS kullanıcılarından biri son anket kurulan tıbbi dava içerik, kemikleşmiş biyoinformatik uzmanlığı, bir solidifi için gereksinimleri ile birlikte, bu "hızlı değişen" teknolojileri zorluklar vurgulananişbaşı eğitim ⁷ kolaylaştıran ed ve hızla uygulanabilir entegre prosedür ve aerodinamik iş akışları ve basitleştirilmiş protokolleri. Bu makalede, hedeflenen NGS için kapsamlı bir sistem bu boşlukları giderir tarif edilmektedir.

sunulan metodoloji klinik ile ilgili kanser geni loci NGS için hedef ölçümü ve algılama doğruluğu, duyarlılığı ve güvenilirliğini artırmak için ıslak ve kuru hem banklar pre-analitik post-analitik tüm prosedürel adımlar bütünleştirir. Bu yaklaşım, DNA kalitesini değerlendirmek çok düşük şablon kopya sorgulama kaynaklanabilecek yanlış pozitif çağrılarına karşı PCR zenginleştirme aşamasında girdi ve bekçi rehberlik "işlevsel" DNA ⁴ miktarının ile başlar. Tek tüp multipleks PCR sonra NGS usin için platforma özel dizilerinin katılmasıyla ardından, sadece 400 çoğaltılabilir DNA kopyalarını kullanarak 46 lokus 21 kanser genleri için zenginleştiriyorg ortak bir masaüstü sıralama aletleri. Kütüphaneler basit bir manyetik boncuk prosedür kullanılarak saflaştırılmış ve bir roman, kalibrasyon gerektirmeyen qPCR testi ile ölçülür. Çağrı performansını artırmak için örnek DNA QC sonuçları haberdar Bir bağımsız biyoinformatik paketi, NGS aşağıdaki dizisi analiz sağlar. Biz baz ikame mutasyonlar, ekleme / silmeler (indeller) ortaya çıkarmak için hedeflenen NGS için bu sistem yaklaşımı kullanarak verileri sunmak ve sayısı, FFPE ve İİA örneklerinde ve çalışma gibi düşük kaliteli ve düşük miktar tümör biyopsilerinde (CNVs) varyantları kopyalama kontrol eder.

Protokol

Not: Bu protokol, MiSeq NGS Sistemi kullanılarak numune eş zamanlı olarak işleme tarif etmektedir, ancak kişisel Genom makinesi (PGM) enstrüman için uyarlanabilir. 400 amplifiye şablonu kopya tavsiye edilen minimum DNA girişi için, deney 318 çip üzerinde PGM kullanılarak 24 numune için NGS çalışma başına 96 örneğin her biri için en az 3000X defa ortalama kapsamı ve eşdeğer kapsamı derinliği üretebilmektedir. Yöntem aynı zamanda, gerçek zamanlı bir PCR cihazı kullanılmasını gerektirir.

1. DNA Fonksiyonel sayısallaştırılması ve Kalite Kontrol (QC)

1. Çözülme reaktifler: 2x ana karışım, Primer prob karışımı, önlenmesi Primer prob karışımı, 6-karboksi-X-rodamin (ROX), seyreltici ve dört insan genomik DNA 'kalibrasyon eğrisi standartları (DNA'sı, standart (50 ng / | il), DNA standart (10 ng / | il), DNA standart (2 ng / | il) ve DNA, standart (0.4 ng / ml)) (Tablo 1). 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için tüm reaktifler içeriğini toplamak için Vortex.buz üzerinde 2x ana karışımı tutun.
2. Test edilecek numune sayısı için ana karışımı yeterli miktarda hazırlayın ve pipetleme nedeniyle kıtlığı önlemek için% 10 daha fazla hacim bulunmaktadır. numune başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak mikrosantrifüj tüp içinde master karışımı hazırlayın: 5 ul 2x Master Mix, 0.5 ul Primer Probe Mix, 0.5 ul İnhibisyon Astar Probe Mix, 0.05 ul ROX ve 2.95 ul Seyreltici. 10 sn içeriğini toplamak için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için vorteks.
3. 96 çukurlu bir plaka gözlerine 9 ul ana karışımı ekleyin.
4. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için iki kez DNA standartları 1 ul ekle. yukarı-aşağı 5 kez pipetleme karıştırın.
5. nükleik asit örnek Kullanmadan önce iyice karışmış olduğundan emin olun. Ve aşağı yukarı 5 kez ana karışımı 1 ul örnek ekleyin ve pipetleme karıştırın.
6. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için plaka, vorteks Seal.
7. PCR Sistemine plaka koyun. FAM (Fonksiyonel miktar) ve VIC (Fonksiyonel inhibisyon), üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bir numune için bir detektör de atama. (95 ° C, 60 ° C de 1 dakika 15 saniye), 95 ° C'de 10 dakika PCR döngüleri gerçekleştirin ve 40 döngü.
8. yazılım protokolleri kullanarak yinelenen DNA standartlarının her biri için bir lineer regresyon arsa üreterek qPCR verileri analiz edin.
9. X-ekseni üzerinde, her bir DNA standart ve y-ekseni üzerinde karşılık gelen FAM Cı _Q değeri kopya sayısının ₁₀ günlük çizilir.
10. daha sonra DNA Standartları kalibrasyon eğrisinin dinamik aralığında nükleik asit örnek sonbaharda sonuçları ve referans standart eğrisi üzerinde karşılık gelen konumundan ul başına "işlevsel" veya büyütülebilir kopya sayısında bilinmeyen DNA konsantrasyonu hesaplamak onaylayın. Şekil 1 geçti ve başarısız kalibrasyon eğrileri örneklerini göstermektedir.
11. Amplifikasyon VIC kanal, insan olmayan bir hedef amplikonun olmadığını kontrol ederek, her bir reaksiyon oluştu, belirler.
    Not: Bir pozitif kontrol olarak, inhibisyon Primer prob karışımı, insan dışı bir ekzojen hedef ve karşılık gelen şablon için spesifik primerler içerir. İnhibisyon Primer prob karışımı hedef içermeyen kontrol (NTC) de dahil olmak üzere, her bir reaksiyonun ilave edilir ana karışımı bir bileşenidir. inhibitörünün yokluğunda, insan olmayan bir hedef için PCR ürünü, her zaman VIC kanalında tespit edilmelidir. VIC kanal için bir örnek bir "tespit edilmemiş" Cı _q işleme devam etmeden önce numunesinin daha sonraki temizlik çalışmaları yararlanabilir PCR inhibitörlerinin varlığını gösterir.

2. Kütüphane Hazırlık: Gen-spesifik (GS) PCR

1. Test edilecek numune sayısı için ana karışımı yeterli miktarda hazırlayın ve% 10 pipett nedeniyle kıtlığı önlemek için daha fazla hacim dahiling. Numune başına aşağıdaki birimleri kullanarak bir mikrosantrifüj tüp GS PCR master karışımı hazırlayın: 5 ul 2x Amplifikasyon Master Mix (Tablo 1) ve 1 ul Pan Kanser Astar Paneli (Tablo 1). içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için yukarı ve aşağı, girdap pipet ile karıştırın.
2. 96 çukurlu bir plaka gözlerine 6 ul GS PCR ana karışımı kısım. bireysel çukurlar halinde her bir nükleik asit örneği 4 ul ekle. Diğer kuyulara, FFPE Kontrol 4 ul (Tablo 1), birden fazla varyasyon kontrolü (Tablo 1) 4 ul ve usul NTC için nükleaz içermeyen su 4 ul ekle. Her ek için, ve aşağı yukarı 5 kez pipetleme karıştırın.
3. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için plaka, vorteks Seal.
4. Aşağıdaki PCR döngü boyunca PCR plakayı: 5 dak 95 ° C,2 devir (95 ° C'de 15 saniye, 60 ° C'de 4 dakika), 23 devir (95 ° C, 72 ° C de 4 dakika 15 saniye) ve 72 ° C'de 10 dakikalık son bir uzatma. 4 ° C'de tutun.
   Not: Aşama 2.4 tamamlanmasından sonra, plaka GS PCR plaka şu şekilde de ifade edilecektir.

3. kütüphane preparasyonu: Etiket PCR

1. Çözülme reaktifler: 2x Endeksi Master Mix (Tablo 1) ve Dizin Kodları (Tablo 1). 10 sn içeriğini toplamak için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için vorteks.
   Not: Endeks Kodları her numune için eşli endeksleri (barkod) eşsiz bir dizi sağlamak için önceden karıştırılır.
2. Ve aşağı yukarı 5 kez 96-plaka, iyi belirlenmiş bir 2x Endeksi Master Mix 7.5 ul ve Dizin Kanunu'nun 5.5 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın.
3. Dikkatle GS PCR plakasını açın ve ana karışımı ile yeni plaka 2 uL GS PCR ürünü ekleyin. yukarı-aşağı 5 kez pipetleme karıştırın. Her numune için, Numune Kimliği ve ilgili ikili Endeks Kodları kaydedin. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için plaka, vorteks Seal.
4. Ve 72 ° C'de 10 dakikalık son bir uzatma (95 ° C, 30 55 ° C, 72 ° C de 1 dk sn 30 saniye), 95 ° C, 10 çevrim 5 dakika boyunca ısıl ve PCR plakasını ° C. 4 ° C'de tutun.
   Not: Aşama 3.4 tamamlanmasından sonra, levha Etiket PCR plaka şu şekilde de ifade edilecektir.

4. Kütüphane Arıtma ve Boyut Seçimi

1. 2-8 ° C Kütüphane Saf Hazırlık manyetik boncuk (Tablo 1) ve elüsyon tamponu (Tablo 1) kaldırmak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmeye gelmeye bırakın. Yıkama Tamponu (Tablo 1) konteyner, kap 9.6 ml% 100 etanol ilave edin ve şişeyi, birkaç kez baş aşağı çevirerek kanştınn.
2. Vortex manyetik 10 saniye boyunca boncuk ve 9 ayrı kuyu içine 11 ul6-çukurlu plaka.
3. Etiket PCR plakasını açın ve boncuk ve pipet karışımı 5 kez Etiket PCR ürünü 10 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dakika süreyle inkübe karışımı.
4. 4 dakika için manyetik stand (Tablo 1) 96 oyuklu plaka koyun. stand de 96 gözlü plaka, çıkarın ve pipet ile süpernatant atılır.
5. Ve aşağı yukarı 5 kez manyetik stand 96-plaka çıkarın ve her kuyuya 100 ul etanol içeren Yıkama Buffer ekleyin ve pipetleme karıştırın. 2 dakika süreyle inkübe edin.
6. 2 dakika süreyle manyetik stand 96-plaka koyun sonra çıkarın ve bir pipet ile süpernatant atın.
7. İkinci yıkamadan sonra mümkün olduğunca yıkama solüsyonu çıkarma 2 etanol yıkar toplam adımı yineleyin 4.5,.
8. Manyetik stand 96 oyuklu plaka, daha sonra, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca boncuk kuru standından plakasını çıkarın.
9. Her wel 20 ul elüsyon tamponu eklenerek boncuk tekrarl ve pipet 5 kez ve aşağı yukarı.
10. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir.
11. geri 4 dakika süreyle manyetik stand 96-plaka yerleştirin ve dikkatlice çıkarın ve iyi bir yeni açık süpernatant 18 ul aktarın.
    Not: Prosedür güvenli -15 -30 ° C'de saklanır, bu aşamada ve örnekler de durdurulabilir. , Yeniden devam etmeden önce buz üzerinde donmuş örnekleri Çözülme.

5. Kütüphane Niceleme

1. Çözülme Kütüphane Quant (LQ) reaktifler: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Prob Mix, LQ Standart LQ Pozitif Kontrol, LQ Diluent ve LQ ROX (Tablo 1). 10 sn içeriğini toplamak için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için vorteks.
2. saflaştınldı kütüphanesi ürünleri kullanılarak, LQ Seyreltici içinde her bir numunenin bir seri seyreltme yerine getirir.
   1. 198 ul LQ Diluent 2 ul (kütüphane saflaştırılmış ürün) ekleyin ve yukarı ve aşağı bir pipet ile 10 kez karıştırın.
   2. 1: (100 seyreltme 1) 2 ul ekle98 ul LQ Dilüent ve bir pipet 10 kez ile yukarı ve aşağı karıştırın.
3. Test edilecek numune sayısı için LQ ana karışımı yeterli miktarda hazırlayın ve pipetleme nedeniyle kıtlığı önlemek için% 10 daha fazla hacim bulunmaktadır. numune başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak mikrosantrifüj tüp içinde LQ Master Mix hazırlayın: 5 ul 2X LQ Master Mix, 2 ul LQ Primer / Prob Mix, 0.5 ul LQ Standart ve 0.5 ul LQ ROX. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için yukarı ve aşağı, girdap pipet ile karıştırın.
4. Optik 96 oyuklu plaka iyi 8 ul LQ ana karışımı ekleyin.
5. Ayrı kuyu, 2 ul seyreltilmiş kitaplık, 2 ul LQ Pozitif Kontrol ve 2 ul LQ Sulandırıcısı (NTC) ekleyin ve-ve-aşağı yukarı 5 kez pipetleme karıştırın. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca 400 x g'de 10 saniye ve santrifüj için optik yapışkan film, vorteks ile plaka mühür.
6. FAM ve VIC Detecto iki atamaHer numune için rs. (95 ° C, 60 ° C de 1 dakika 15 saniye), 95 ° C de 5 dakika bisiklet koşulları kullanılarak PCR büyütmesi gerçekleştirmek ve 40 döngü.
7. Karşılaştırmalı C _q yöntemi kullanılarak her bir örnek (nM) konsantrasyonunu belirler. Bilinmeyen kitaplığı (C _q FAM) karşı bilinen LQ Standardı (C _q VIC) farkını hesaplayın. Seyreltilmiş örnek (pM) konsantrasyonu, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
   [Konsan _{lib] nM} = 12.5 x 2 ^{Δ Cq}
   10.000 dışındaki bir seyreltme faktörü kullanıyorsanız, 10.000 hedef seyreltme faktörü oranını hesaplamak ve 5.7 denklemin sonucu bu faktör çarpın.

6. Kütüphane Normalleştirme ve Numune havuzu

1. tüm örnekleri arasında medyan konsantrasyonunu (nM) (her biri benzersiz bir ikili indeksi içeren) toplanmış olması belirleyin.
2. Bireysel örnek volum belirleyine (ul) bireysel konsantrasyon (nM) bölünmesiyle sonra, 5 ile tüm örnekleri arasında medyan konsantrasyonunu çarpılarak havuza. en yakın tam sayıya ortaya çıkan değer yuvarlak. Yuvarlak değerleri ile hacimleri <2 ul 2 ul ve hacimleri> 15 ul 15 ul.
3. Örnek havuzu oluşturmak için tek bir mikrosantrifüj tüpüne her bir örnek için normalize hacmi (ul) eklenir.
4. yuvarlak tamsayı değerlerini kullanarak her bir örnek için yeni konsantrasyonu hesaplayın ve sonuçları kaydedin.
5. Örnek havuzu konsantrasyonunu belirlemek için, her bireysel konsantrasyonlarının toplamı hesaplanır ve elde edilen değer (nM) kaydedin.
6. Sıralama Dilüent (Tablo 1) kullanılarak 1.25 nM örnek havuzu sulandırmak.
   Not: Prosedür güvenli -15 -30 ° C'de saklanır, bu aşamada ve örnekler de durdurulabilir. , Yeniden devam etmeden önce buz üzerinde donmuş örnekleri Çözülme.

7. Sıralama

1. DenatURE Aşağıdaki ekleyerek phix kontrol V3 (Tablo 1) varlığında Örnek havuzu: 1.25 nM Örnek havuzu, 0.5 nM phix 3 ul 1 N NaOH 2 ul 15 ul. Vortex kısa kısa bir santrifüj, ardından ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
2. buz üzerinde denatüre örnek havuzu yerleştirin.
3. Bir mikrosantrifüj tüp önceden soğutulmuş HT1-HYB tampon 992 ul denatüre kütüphane 8 ul ekleyin. Vortex kısa toplanmasını kısa bir santrifüj, ardından karıştırın. buz üzerinde tutun.
4. reaktif kartuşunun 17. konumlandırmak için denatüre ve seyreltilmiş kütüphane 600 ul ekleyin.
5. Çözülme 1 ile sıralama primerleri (Tablo 1), Dizin Gör sıralama primerleri (Tablo 1) ve oku 2 sıralama primerleri (Tablo 1). mikrosantrifüj tüpleri içinde, ayrı ayrı 636 ul HT1-Hyb tamponu ile 4 ul sıralama primerleri seyreltin. Not: HT1-HYB tampon sağlanan zekâh sıralama reaktif kiti (Tablo 1).
6. toplanmasını 10 sn için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj girdap oluşturarak karıştırın. sıralama reaktif kartuşunun 18. konumlandırmak için seyreltilmiş Oku 1 Sıralama Astar 600 ul ekleyin, seyreltilmiş Endeks Okuma Astar 600 ul 20. konumlandırmak için 19. ve seyreltilmiş Oku 2 Sıralama astar 600 ul konumlandırmak için.
7. Üreticinin talimatlarına uygun olarak NGS cihazı (Tablo 1) ve sırası ile reaktifler yükleyin. eşleştirilmiş uç 2 x 150 devir sıralama çalıştırması yapın.

8. Veri Analizi

Not: NGS enstrüman yazılımı, her numune için (.fastq.gz *) dosyalarını baz çağrıları ve kalite puanları küme görüntüleri dönüştürür ve bireysel gzip sıkıştırılmış fastq oluşturmak için ikili endeksleri ayrıştırır. Çoklaması dosyalarını analiz öncesinde, okuyucu (Tablo indirmek ve ilişkili biyoinformatik yazılımı yüklemeniz gerekir1). Yazılım tüketici sınıf, Windows PC üzerinde monte edilebilir ve uzman bilgisayar donanım veya veri analizini gerçekleştirmek için bir internet bağlantısı gerektirmez.

1. yazılım masaüstü simgesini çift tıklatın.
2. Yazılım kılavuzunda verilen kullanıcı adı ve şifreyi kullanarak sisteme giriş yapabilirsiniz.
3. Proje panosunu açın ve "New Project" i tıklayın.
   1. proje adı ve isteğe bağlı proje açıklamasını. Hedeflenen NGS paneli tipi ve NGS enstrüman türünü seçin. "Kaydet ve devam" tıklayın.
   2. ileri sıkıştırılmış fastq dosyaları yükleyin ve okur ters. Bu Demultiplex başarısız okur içeriyor "atanmamış" FASTQs, yüklemeyin. "Kaydet ve devam" tıklayın.
   3. Giriş DNA, fonksiyonel miktar deneyi (yukarıda Adım 1 e bakınız) ile tespit edildiği üzere, her bir kütüphane hazırlanması için kullanılan fonksiyonel giriş kopya sayısı. El ile bir yayılma değerleri veya kopyalama ve yapıştırma değerleri ekleyinaçıklama tabloya levha. "Kaydet ve devam" i tıklayın.
   4. analiz için yüklendi açıklamalı kütüphaneleri inceleyin ve analiz başlatmak için "analizi Gönder" i tıklayın.
4. Proje gösterge tablosu üzerinden görüntülenen analiz ilerlemeyi izlemek.
   Not: Sonuçlar incelenmek üzere hazır olduğunda bir analiz tam durum göstergesi sunulmuştur.
5. Yüzdesini kütüphanesinde başına toplam kapsama dahil örnek QC ölçümleri için analiz sonuçları gözden geçirerek filtreleri, amplikon kapsama derinliğini ve tekdüzelik okur. varyant dbSNP Kozmik, 1000 genomları ve fonksiyonel ve nüfus düzeyi açıklama diğer kaynakları ile her sıralı kitaplık için çağrıda inceleyin.
6. tamamlayıcı bilişim araçları ile uzun süreli depolama veya alt analizler için özet tablo tablolar, * .bam dosyaları ve * .vcf dosyaları gibi çiğ sonuçları ihracat.

Sonuçlar

Pozitif ve negatif kontrolleri, daha önceden, özelliği hücre çizgileri ve artık klinik FFPE tümör biyopsileri gösteren 90 numune (74 benzersiz) toplam sekansı adaptörleri, barkod ile etiketlenmiş amplifikasyona tabi tutulabilen DNA, multipleks PCR zenginleşmeyi girişi için değerlendirildi ve tek analiz edildi 19.1 M üretilen masa üstü NGS enstrüman çalıştırmak (Şekil 2) filtreyi geçen okur. Eşmolar Örnek havuzu yüksek derinliği sekanslama (3,692x okuma) ve düzgün içerisinde (ortalama okuma derinliği 5 kat içinde bulundurulması amplikonların% 97.8) ile sonuçlanmıştır. Aykırı hiçbir şablon kontrolleri, büyük bir kopya sayısı büyütmesi ile bir hücre hattı DNA ve pre-analitik QC deneyi ile PCR inhibisyonu için işaretlendi bir FFPE DNA (Şekil 3) oluşur. 46 amplikonlarının bir şekilde kapsama homojenliği (üç farklı operatörler (Şekil 4A) ve farklı düşük kaliteli FFPE DNA örnekleri kullanılarak muhafaza edilmiştir Şekil 4B). artık klinik örneklerden karışımından formüle bir FFPE tümör DNA kontrolü, 3.9, 5.3 bollukları hedef BRAF mutasyon bildirilmiştir (damlacık dijital PCR ile ölçülebilir)% 5 BRAF V600E ulaşmak ve üç operatör tarafından% 6,5 kullanarak 400 amplifiye kopya (ve dolayısıyla sadece 20 mutant kopya) (Şekil 4B ve ilave tablosunun "FFPE3") bir giriş. % 17 ortalama allel frekansı (Tablo 2) - Dahası, her bilinen bir "sürücü" baz ikame mutasyonu temsil 12 sentetik DNA şablonları bir karışımı 9 amaçlanan aralığında beklenen mutasyonlar saptandı. Kopyalama sayılı büyütmeleri hücre-hattı ve FFPE DNA örnekleri seyreltilmesi EGFR ve Kras sırasıyla (Şekil 5) varyantları için doz-bağımlılığı göstermiştir. Önemlisi, FFPE DNA girişi yalancı pozitif olmadan birkaç 50 büyütülebilir kopya veya toplu DNA 1.2 ng bilinen mutasyonların tespiti koruyarak düşürüldü olabiliraramalar (Şekil 6). DNA girişleri en az 50.000 çoğaltılabilir kopya (Tablo 3) 100 kat aralığında kadar üzerinde ağırladı. Bu ve benzeri deneylerde, varyant 22 FFPE çağırır ve 20 FNA örnekleri paylaşılan mutasyon kapsama (Tablo 4) ile bağımsız yöntemleri ile anlaşma bildirilmiştir.

tahlil için duyarlılık ve pozitif öngörü değeri taze dondurulmuş FFPE, FNA, ve hücre-line DNA ve 195 sıralama sonuçları olmak üzere toplam 97 örneklerinin, bir analizinden belirlendi. % 99.7 ve pozitif prediktif değer (PPD) (% 95 CI: Sonuçlar 365 gerçek pozitif varyant aramaları, 4 yanlış negatif aramaları ve% 98.9 duyarlılık (97,1-99,7%% 95 CI) için 1 yanlış pozitif çağrı ortaya : 98,2-99,99%). indellerin analizleri 93.9% bir hassasiyet gösteren, 33 numune ishal iki ortak EGFR varyantlar (p.E746_A750delELREA ve p.V769_D770insASV) için yapılmıştır (% 95 CI: 78,4-98,9%) ve% 100 (% 95 CI bir PPV: 86,3-100%) varyantlarıyla 2,4-84,8% aralıklarında tespit edildi.

Şekil 1:. Geçiş ve Fail QC Kriterleri (A) geçen standart eğri DNA Niceleme Kalibrasyon Eğrisi Bir ​​Örnek. (B) başarısız standart eğri. Bu durumda, başarısızlık düşük giriş DNA standardının yinelenen pipetleme neden oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Onkoloji Uygulamaları için Hedefli Kapsamlı NGS Sistemi Genel Bakış Ön analitik entegrediğerleri, Analitik ve Post-analitik iş akışları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Okuma Kapsamı ve tekdüzeliği Bozulmamış Hücre-line DNA ve Kontroller ile karşılaştırıldığında düşük kaliteli FFPE DNA Kanser Genler Hedefli NGS için artık klinik FFPE (kapalı daireler), hücre satırı dahil 90 numunelerin toplam (açık daireler. ) ve sentetik kalıp DNA (artı semboller), tek tüp içinde, 21 gen multipleks PCR zenginleştirme kullanılarak işlendi. Her bir amplikon kütüphanesi 2.5 nM'lik bir konsantrasyonda bir tat çift göstergesi miktarı, arıtılmış, kod ve normalize edilmiş olan barkodlanmaktadır NGS alet için adaptör dizileri ile etiketlendi. DNA kütüphanesi tamamlayıcı biyoinformatik yazılımı tarafından sıralandı ve analiz edilmiştir. örnek devikus büyük EGFR kopya sayısı amplifikasyonu (üst, noktalı daire içindeki açık dikdörtgenler) kayda değer bir sayı üretmek için başarısız kapsamı bütünlüğü ve bir melanom FFPE örnek bozuk bağlı okuma açısı, MDA-MB-468 hücre hattı DNA bir seyreltme serisi dahil DNA ekstraksiyon PCR inhibitörlerinin yıkanmaya. melanom örnek yetmezliği (alt, noktalı daire) pre-analitik qPCR DNA QC testi ile tahmin edilmiştir. NTC, no-şablon kontrolü (x semboller). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Amplikon-by-Amplikon Oku Kapsama, Düzgünlüğü ve Kalıntı Klinik FFPE Tümör DNA'daki Varyant Algılama. (A) ölçülen temsili FFPE DNA örneğinde tüm zenginleştirilmiş loci genelinde kapsama OkuÜç farklı operatörler arasında. Operatör 1, Op1 (mavi bar); Operatör 2, Op2 (yeşil çubuklar); Operatör 3, OP3 (siyah çubuklar). Bilinen% 5 BRAF c.1799T> A mutasyonu oluşan bir kontrol karışımı (FFPE3, gri barlar ve metin dahil) üç FFPE tümör örnekleri kullanılarak değerlendirildi (B) Kapsam düzgünlüğü ve varyant aramaları. FFPE1 (mavi bar ve metin), FFPE2 (turuncu bar ve metin). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5:. Da iyi karakterize edilmiş EGFR kopya sayısı amplifikasyonu olan hücre hattı ve FFPE DNA, MDA-MB-468 hücre hattı DNA kopya sayısı Türevler doza bağımlı algılama kademeli referans mutasyona uğramamış hücrenin arka içinde seyreltilmiştir line DNA kopya sayısı değişikliği düşüşü göstermek içinseyreltme işlevi. Her bir hücre hattı DNA örneği yüzdesi bir tat hattı (0, 12.5, 25, 50 ve% 100) gösterilmektedir. Bilinen bir KRAS büyütmesi ile bir yumurtalık tümörü FFPE numunesinin seyreltilmesi aynı titrasyon serilerini kullanarak benzer bir profil ortaya ama iki üst hatlar için% 100 FFPE DNA çoğaltır ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6: doğru mutasyon saptanması ve nicelenmesine Dökme 50 ng DNA Amplifiye FFPE DNA kopyası ya da 1.2 FFPE DNA qPCR tabanlı QC analizi ile belirlenen bir kolon kanseri büyütülebilir kopya sayısı, ve AS 25 kopya 400 seyreltilmiştir. sekanslama önce çoklu PCR zenginleşmeyi girişi. biyoinformatik boru hattı doğru bilinen Varian hem deniraşağı 50 kopya ya da ~ 10 mutant şablonları eşdeğer ts. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Malzeme / Malzeme Adı	şirket	Katalog numarası
2x Quantidex Master Mix	Asuragen	145.345
Quant Astar Probe Mix	Asuragen	145.336
İnhibisyon Astar Probe Mix	Asuragen	145.344
ROX	Asuragen	145.346
Seyreltici	Asuragen	145.339
DNA Standart (50)	Asuragen	145.340
DNA, standart (10)	Asuragen	145.341
DNA, standart (2)	Asuragen	145.342
DNA Standart (0.4)	Asuragen	145.343
2x Amplifikasyon Master Mix	Asuragen	145.348
Pan Kanser Astar Paneli	Asuragen	145.347
Pan Kanser FFPE Kontrolü	Asuragen	145.349
Pan Kanser Multi-Varyant Kontrolü	Asuragen	145.350
Kütüphane Saf Hazırlık Boncuk	Asuragen	145.351
yıkama Tamponu	Asuragen	145.352
Elüsyon Tamponu	Asuragen	145.353
2x LQ Master Mix	Asuragen	145.358
LQ Seyreltici	Asuragen	145.354
LQ PozitifKontrol	Asuragen	145.355
LQ Standart	Asuragen	145.356
LQ Primer / Prob Mix (ILMN)	Asuragen	145.357
LQ ROX	Asuragen	145.359
Endeks Kodları (ILMN) - Set A	Asuragen	150.004
AIL001 - AIL048 (48)
Endeks Kodları (ILMN) - Set B	Asuragen	150.005
AIL049 - AIL096 (48)
2x Endeksi Master Mix	Asuragen	145.361
1 sıralama primerleri oku	Asuragen	150001
Indeksi okunur sıralama primerleri	Asuragen	150.002
2 sıralama primerleri oku	Asuragen	150.003
Ardışık Seyreltici	Asuragen	145.365
Illumina MiSeq	Illumina
MiSeq Reaktif Kiti v3 (600 döngü)	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reaktif Nano Kiti v2 (300 döngüsü)	Illumina	MS-103-1001
Phix Kontrol v3	Illumina	FC-110-3001
Manyetik Stand-96 (Ya eşdeğer cihaz)	Ambion	AM10027
Quantidex Reporter Yazılım	Asuragen

Tablo 1:. Reaktifler ve Setleri ROX ilk kullanımı üzerine 2-8 ° C'de flakon saklayın. dondurursam etmeyin. Yazılım www.asuragen.com adresinden indirilebilir.

Gene	KOZMİK varyant	KOZMIK amino asit	% Varyant
NRAS	c.182A> G	p.Q61R	13.3
NRAS	c.35G> A	p.G12D	15.2
HRAS	c.182A> G	p.Q61R	17.8
HRAS	c.35G> A	p.G12D	9.2
KRAS	c.182A> G	p.Q61R	13.5
KRAS	c.35G> A	p.G12D	19.1
PIK3CA	c.1633G> A	p.E545K	9.3
PIK3CA	c.3140A> G	p.H1047R	9.1
KIT	c.2447A> T	p.D816V	14.6
EGFR	c.2369C> T	p.T790M	11.3
EGFR	c.2573T> G	p.L858R	14.9
BRAF	c.1799T> A	p.V600E	17.3

Tablo 2: Bir Toplanmış Sentetik Kontrol 9-17% Bolluk de nicel olan 12 "Sürücü" Kanser Gen Varyantı oluşur 12 farklı mutasyonları taşıyan 12 farklı çift sarmallı sentetik şablonlar bir karışımı sıralama aşağıdaki değerlendirildi.. Tüm varyantlar doğru hiçbir yanlış pozitif ile çağrıldı.

>% Varyant

numune No	fonksiyonel cps	Gen	KOZMİK varyant	KOZMIK amino asit	Medyan okuma derinliği	Medyan 5x içinde%
BCPAP	400	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.5	3289	% 96
BCPAP	10.000	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.7	4040	% 98
BCPAP	25.000	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.4	3687	% 96
BCPAP	50.000	BRAF	c.1799T> A	p.V600E	99.7	4611	% 93

Tablo 3: Kapsama ve Varyant Arama DNA Girdi a> 100 kat Range fazla korunmuş olan. bir BCPAP hücre hattından Amplifiye DNA 400 50.000 kopya ve sıralı de multipleks PCR zenginleştirme girdi oldu. Oku derinliği, kapsama düzgünlüğü, mutasyon belirleme ve mutasyon doğruluğu giriş aralığında korundu.

Tablo 4: Varyant 22 FFPE ve 20 FNA Tümör Biyopsilerinde Aramalarının Bağımsız Mutasyon Tahliller gelen Sonuçlar katılıyorum önceden dik hedeflenen NGS deneyleri tarafından belirlenen mutasyon statüsüne sahip 22 FFPE tümör DNA kümesi PCR zenginleşmeyi 400 2928 için çoğaltılabilir kopya olarak giriş oldu. adım ve 21-gen Pan Kanser panelini kullanarak sıralandı. Buna ek olarak, 20 FNA DNA örnekleri bir kohort önceden ⁸ PCR 156 36080 giriş çoğaltılabilir kopyaları ve sıralı kullanılarak amplifiye bir sıvı boncuk dizisi mutasyon deneyi kullanılarak karakterize edilmiştir. Pan Kanser NGS paneli ve refere arasındaki tüm çakışan çağrılarnce yöntemleri anlaşmaya vardı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

NGS teknolojileri klinik ortamlarda ⁹ tümör biyopsisi moleküler profillerini sorgulamak için beklentileri yeniden tanımlamıştır. Hedeflenen NGS panellerin bir dizi klinik örneklerden ^3,5,10-15 çok tip değerlendirmek için araştırma teknolojileri, laboratuvar geliştirilen testler ve piyasada bulunan ürünler ve özel panelleri gibi geliştirilmiştir. Birden fazla çalışmaların raporları genomik değişikler ^3,10-12,14 saptanması için hassas ve özgün bir klinik bir araç gibi NGS değeri göstermiştir. Oysa çalışmalar aynı zamanda FFPE ^2-5,12,14 örneklerinde olduğu gibi zorlu kanser biyopsilerinden yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir eserler riskini göstermiştir. Buna ek olarak, yeni yayınlar düşük giriş DNA ¹² kullanımı ile ağırlaştırılmış ticari hedeflenen NGS panelleri ile ¹⁶ ve yalancı pozitif aramalar onkoloji kullanarak NGS için yüksek başarısızlık oranları numuneler sermiştir. Bunun bir sonucu olarak, bazı laboraMuhafazakârlar ya değiştirilmiş ya da ticari olarak temin hedeflenen NGS teknolojileri doğruluğunu sağlamak veya biyoinformatik ^5,10,11 analizleri bulguları doğrulamak için sık sık, performansını artırmak için ek kontroller ve dengeler ekledik.

21-gen paneli (Şekil 2) gibi FFPE ve FNA tümör biyopsisi gibi zorlu örnek türlerinde kanıta dayalı, eyleme mutasyonlar sorgulamak için kapsamlı bir NGS sistemi için hedeflenen içerik olarak geliştirilmiştir. Iş akışı bir dizi fayda vardır: üniforma amplikon kapsama (Şekil 3 ve 4, Tablo 3) sağlayarak 1) tutarlılık; 2) kolaylığı kullanımı sağlayarak, optimize edilmiş reaktif setleri önceden formüle ve biyoinformatik gereksinimleri basitleştirilmesi; iş akışını kolaylaştırarak ve diğer ticari NGS yöntemlere kıyasla pipetle çalışma aşamasına sayısını azaltarak 3) verim; Amplifi değerlendirmek için bir DNA QC tahlil birleştirerek ve 4) doğruluğumümkün DNA kopya sayısı kabul edilebilir şablon çeşitliliği sağlamak ve varyant tespiti ⁴ stokastik dalgalanmaları önlemek için. biyoinformatik analizi ile pre-analitik QC verilerinin entegrasyonu FFPE DNA'nın düşük girişler için izin verir. Bu gerçeğin bağımsız önlemlerle 400 FFPE örneklerinin arasında DNA girişi farklı işlevsel kopyalarını kullanarak bir karar ağacı algoritması eğitim ve biyoinformatik yazılımı içine bu algoritmayı katarak elde edildi. Bunun bir sonucu olarak, FFPE DNA ~ 5-20 ng tipik olarak eşdeğer 400 amplifiye kopyalarının önerilen girişi, FFPE DNA ~ 250 ng ^17,18 önerilir melezleştirme tabanlı zenginleştirme dahil olmak üzere diğer yöntemler ^10-12 ile karşılaştırıldığında olumlu . teknik MiSeq platformu üzerinde kullanım için tarif edilmiş olmasına rağmen, diğer NGS platformlarda dizi analizi sağlamak için cihaza özel bağdaştırıcılar etiketleyin PCR primerleri kullanılarak modifiye edilebilir.

Birkaç adım başarı sağlamak için kritik öneme sahiptirusul. pre-analitik QC tahlil DNA ve raporlar fonksiyonel inhibisyonu büyütülebilir kopya sayısını belirler. 400'den az amplifikasyona tabi tutulabilen DNA kopyası PCR zenginleştirme aşamasında kullanılan, ancak, düşük yoğunluklu mutasyonlar ile numune bir yalancı negatif çağrısı (Şekil 6) bir artış riski vardır. Buna ek olarak, bakım yıkama veya yıkama aşamaları sırasında manyetik boncuk aşırı kurumasını önlemek için kütüphane saflaştırma sırasında alınmalıdır. Bundan başka, başarılı bir kütüphane miktar kütüphane DNA doğru seyreltme oldukça bağımlıdır. En iyi sonuç için, qPCR farkı ≤3.3 Cq olmalıdır örnek kütüphane LQ Standardı (Cq VIC) ile karşılaştırıldığında (Cq FAM) için sonuçları. farklılık daha büyük 3.3 Cq yeniden seyreltme ve numunenin test ise tavsiye edilir. mükemmel bir ilişki, bu rekabetçi qPCR yöntem ve ticari kitler ile gözlenmiştir, ancak bir standart eğri kullanılarak, mutlak kantifikasyon sunanDiğer yöntemler, klonal amplifikasyon aşaması, nispeten kitaplık giriş ofset optimal tohum yoğunluğu elde etmek için gerekli olabilir.

Bazı kanser örnekleri, özellikle çünkü DNA izolasyonu sonra devam inhibitörlerinin sıralamak için zorlamaktadır. Kütüphane hazırlık öncesinde bu örnekleri belirlemek için, qPCR QC deneyi de bir iç kontrol ve fonksiyonel inhibisyonu için bir nöbetçi hem de hizmet veren bir eksojen şablonu dahil ederek amplifikasyon inhibe algılar. Sözgelimi, bir melanom, DNA örneği mt önceden sekanslama QC inhibisyonu geçemediğini ve daha sonra dizisi çıkarıldı edilebilir bir kitaplık oluşturmak için başarısız olan Şekil 3'te gösterilmektedir. arıza olasılığı FFPE DNA izolasyon aşamasından taşınan melanin kirlenme, bilinen bir PCR inhibitörü, bir sonucudur. QC tahlili ile tespit numuneler ekstra temizlik adım t yoluyla kurtarılabileceği edilebilir amplifikasyon yetmezliği riski altında olduğuo potansiyel inhibitörleri kaldırın.

Hedeflenen 21-gen paneli kanıta dayalı gen noktaları üzerinde duruluyor ve DNA QC, pre-analitik "işlevsel" DNA miktar sonuçları tarafından bilgilendirilir NGS ve biyoinformatik yazılımı için optimize edilmiş reaktifler ve kontrolleri ile komple bir sistem sağlar. yöntem doğru düşük giriş DNA'dan baz ikame mutasyonlar ve indellerin algılar ve bu CNVs gibi ek türevlerini algılamak için ve hedeflenen RNA sıralaması için adapte edilebilir, panel içeriği genişletmek için seçeneği ile bir NGS sisteminin bir örnek sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x Quantidex Master Mix	Asuragen	145345
Quant Primer Probe Mix	Asuragen	145336
Inhibition Primer Probe Mix	Asuragen	145344
ROX	Asuragen	145346
Diluent	Asuragen	145339
DNA Standard (50)	Asuragen	145340
DNA Standard (10)	Asuragen	145341
DNA Standard (2)	Asuragen	145342
DNA Standard (0.4)	Asuragen	145343
2X Amplification Master Mix	Asuragen	145348
Pan Cancer Primer Panel	Asuragen	145347
Pan Cancer FFPE Control	Asuragen	145349
Pan Cancer Multi-Variant Control	Asuragen	145350
Library Pure Prep Beads	Asuragen	145351
Wash Buffer	Asuragen	145352
Elution Buffer	Asuragen	145353
2X LQ Master Mix	Asuragen	145358
LQ Diluent	Asuragen	145354
LQ Positive Control	Asuragen	145355
LQ Standard	Asuragen	145356
LQ Primer/Probe Mix (ILMN)	Asuragen	145357
LQ ROX	Asuragen	145359
Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48)	Asuragen	150004
Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48)	Asuragen	150005
2x Index Master Mix	Asuragen	145361
Read 1 Sequencing Primers	Asuragen	150001
Index Read Sequencing Primers	Asuragen	150002
Read 2 Sequencing Primers	Asuragen	150003
Sequencing Diluent	Asuragen	145365
Illumina MiSeq	Illumina
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle)	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle)	Illumina	MS-103-1001
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device)	Ambion	AM10027
Quantidex Reporter Software	Asuragen