Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Özet

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Özet

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

Giriş

30 üzerinde bir vücut kitle indeksi ile ABD'de nüfusun yaklaşık% 30 mevcut Obezite, yaygın dünya çapında fenomen ¹ olarak ortaya çıkmıştır. Obezite kardiyovasküler hastalıklar, tip-2 diyabet ve kanser de dahil olmak üzere ^2-4 ile ilgili komplikasyonlara yol açma eğilimindedir. Bu nedenle, obezite ile ilgili önemli bir önceliktir. Obezite adipoz dokuların büyük genişleme ile ortaya çıkar ve aşırı gıda tüketimi ve modern toplumda sedanter bir yaşam tarzı atfedilir. Bu nedenle, adipogenesis ve lipojenez transkripsiyonel regülasyonunu deşifre obezite veya diyabet ⁵ tedavisinde söz tutun olabilir.

3T3-L1, 3T3-F442A ve fare adipojenik hücre çizgileri adipoz doku gelişimi sırasında adipogenesis ya lipogenezi çalışma uygulanmıştır. Ancak, in vivo ⁶ hücre in vitro hatları ve hayvanlar arasındaki düzenleyici mekanizmaların bazı farklılıklar vardır. Birincil adipoz-deristromal-vasküler hücre fraksiyonu ved kök hücreler (ADSC) beyaz adipoz doku tarafından doğrudan izole edilmiş ve ayırt etmek için indüklenebilir. Adipositlere ADSC farklılaşması büyük olasılıkla in vivo ⁷ adipoz doku gelişiminde adipogenesis ve lipojenez sürecini tartışıldı.

Domuzlar adipoz doku gelişiminde adipogenesis ve lipogenezi çalışmak için uygun bir hayvan modeli vardır. Daha önceki çalışmalar, domuz ^8-10 sterol düzenleyici elementi bağlayan transkripsiyon faktörü 1c (SREBP1c) lipojenik yağlı asit sintaz transkripsiyonunu yeniden düzenlemek üzere bilinen önemli bir transkripsiyon faktörünün ifadesi, domuz karaciğer, çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) inhibe olduğunu göstermek ve adipoz doku. In vivo ve in vitro olarak PUFA azalmıştır domuz SREBP1c sentezlenmesi de insanlar ve fareler ^11-13 gibi diğer türlerin benzer. In vitro Bu domuz çalışmaları fark olarak öncelikledomuz ADSC (pADSC) türetilen farklılaşan adipositler. Bu nedenle, pADSC bu birincil hücre kültürü adipoz doku gelişimini ya da diğer kök hücre uygulamaları incelemek için güvenilir bir hücresel sistemi olarak hizmet etmek için kullanılabilir.

Protokol

Not: Bu yöntem kurulmuş ve araştırmalarda kullanılan daha önce bu laboratuvardan ^14-17 bildirilmiştir; zamanla metodoloji değişiklik yapıldı. Mevcut Prosedür 6-gözlü doku kültür levhaları üzerinde tohumlama ile (7 ila 9 gün) bir domuz yavrusu domuz deri altı adipoz dokuların 60 g ortalama kullanılarak gerçekleştirilmiştir. aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan deneyleri Ulusal Tayvan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Sindirim Orta hazırlayın

1. ense ve gelen cilt altı yağ dokuları elde; 40 domuz yavrusu başına 80 g (7 ila 9 gün), domuz boyutuna bağlı olarak değişebilir. Burada, bir domuz elde edilen deri altı yağ dokularının 60 gr kullanın.
2. Sindirim orta hazırlayın: (DMEM 54.000 adet olmak üzere toplam kolajenaz II toz ağırlığında ve 90 Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı mi içinde çözülür,100 ml'lik serolojik şişede 60 g yağ) (kollajenaz 900 ünite / 1.5 ml DMEM / g yağ) için.
3. Yavaşça çözülür ve daha sonra sterilizasyon için 0.22 um filtre ile sindirim orta geçmesi için en az 15 dakika süre ile bir çalkalama tablosu (100 rpm) üzerine sindirim orta ajitasyon. Kullanmadan önce 4 ° C'de saklayın.

Domuzlar 2. Dissect Subkutan Yağ Dokular

1. Kullanmadan önce 37 ° C tüm enstrümanları, cam ve plastik eşya ve sıcak tüm medya sterilize edin.
2. Elektrik sersemletme ve bunlar, kanları tümüyle ya da lokal IACUC düzenlemelerine uygun olarak bir yöntem kullanılarak domuz yavrusu Kurban. domuz kurban sonra dikkatli ve hemen diseksiyon.
3. Temiz cerrahi masaya piglet Lay (sırt ve karın aşağı yukarı bakacak şekilde). orta hatta aşağı her iki tarafta kuyruk ve boyun tüm saç çıkarma piglet geri saç traş.
4. % 7.5 povidone- ile domuz dorsal cilt fırçalayıniyot üç (üç yeni bağımsız scrubs ile) kez ve daha sonra iyot yaklaşık 10 dakika cilt yüzeyinde oturmak için izin verir.
5. % 70 etanol birden spreyler ile povidon-iyot çıkarın. gazlı bez veya povidon-iyodin belirgin bir renk görülünceye kadar tekrarlayarak, tek yönde cildi temizlemek için% 70 etanol içeren doku kağıtları kullanın.
6. yağ tutan ve cilt forseps kullanırken kaslardan ekli deri tabakası ile birlikte cilt altı yağ dokularının domuz dorsal yağ tabakası ayırmak için bir neşter kullanın.
7. Hemen serumsuz DMEM içeren bir steril şişeye (200 mi) içinde eklenmiş deri ile deri altı adipoz dokuların yağ tabakası bırakın.
8. Laminer akış hücresi kültürü kaputu% 70 etanol ve yer ile yağ tabakası içeren beher dışında püskürtün. kaputu büyük (40 cm x 30 cm) sterilize edilmiş üç katmanlı kaplama folyosunu yerleştirin. [Üçlü tabaka sürekli bütünlüğünü sağlamak için kullanılır.]
9. Yericilt kapağı folyo üzerine aşağı bakacak şekilde doku.
10. kas dokusu ile kirlenmesini önlemek için forseps ve makas kullanılarak yağ dokusunun kapalı kalan kas dokusu kesin.
11. kare parçalar halinde yağ Kes (~ 7 cm x 7 cm) bir neşter veya makasla. serumsuz DMEM içeren yeni bir steril şişeye (200 mi) içine yağ tabakasının bu parçaları.
12. Bir karbonlu çelik dilimleyici bıçak (Şekil 1) ile monte edilmiş kapak folyo üzerinde özelleştirilmiş bir dilim tutucu ayarlayın. beher dışına yağ tek parça alın ve dilimleyici (üst ve yağ tabakası altında cilt tabakasının) üzerine yerleştirin.
13. yaklaşık 1 mm kalınlığında parçalar halinde cilt altı yağ dokularının yağ tabakası dilimleyin. mümkün olduğunca yakın deri yağ tabakası dilimleyin ama cilt dilimleme kaçının.
14. Kıyma, mümkün olduğunca ince makasla yağ dokuları dilimlenmiş.
15. Kıyılmış içeren 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi veya serolojik şişeye kolajenaz ihtiva eden filtre sindirim orta ekleyinadipoz doku (kolajenaz 54.000 ünite / 90 mL DMEM / 60 g yağ).
16. Inkübe ve kolajenaz sindirimi dokuları izin 37 ° C'de 90 dakika boyunca bir yörüngesel karıştırıcıda 45 rpm'de bir Erlenmeyer şişesi girdap.
    Not: Aşırı sindirim önlemek için her 15 ila 30 dakika kontrol edin. sindirim ortamı önemli doku kümeleri olmayan bir bulamaç ise sindirim işlemi tamamlanır.
17. kolajenaz sindirimi durdurmak için% 10 cenin sığır serumu (FBS) içeren DMEM / F12 ihtiva eden kültür ortamı (sindirim ortamına eşit) eşit hacim.

Domuz dorsal deri altı yağ dokuları Şekil 1. pADSC izolasyonu için kullanılan özelleştirilmiş bir dilimleyici. Dissected adipoz dokular bağlı cilt katmanları ile yağ tabakası oluşur. Bir dilimleyici aşırı kaçınma ile yaklaşık 1 mm kalınlığında yağ tabakası dilim için gereklidirCilt katmanları içine dilimleme. dilim tutucu, dilimleyici pedi, karbon çelik dilimleme makinesi bıçak ve vidalar: Soldan sağa. Dilimleme bıçağı dilim tutucu ve montajı dilimleyici ped arasına sokulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Stromal vasküler Fraksiyondan pADSC 3. Toplama

1. Temiz steril 250 ml Erlenmeyer kabı içine şifon tek bir tabaka ya da 250 mi serolojik şişe ile dijeste adipoz dokuları ihtiva eden sindirim orta geçirin. rehberlik ve sindirimi geçişini yardımcı olmak için şifon orta bastırmak için forseps kullanabilir.
2. Drenaj ve geçişin tamamlanması için bir forseps ile şifon bükün.
3. Dört 50 ml konik santrifüj tüpleri (~ tüp başına 40 mi ortamı) sindirim orta dağıtın.
4. 10 dakika boyunca 700 xg'de santrifüj stromal vasküler hücrelerin pelet toplamak için.
5. Olgun adipositlerin içeren üst yağ tabakasının en kaldırmak için pelet bozmadan süpernatant süzün. pipetleme ve borunun hafifçe çalkalanarak pelletini, her tüpe 10 ml DMEM ilave edilerek pelet yıkayın.
6. 6 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin. süpernatant süzün.
7. 10 ml ACK lizis tamponu ekleyin ve sonra pipetleme pelletini. Bu stromal vasküler fraksiyonunda kırmızı kan hücreleri lize etmek için, oda sıcaklığında, 7 dakika (5 dakika ila 10) bekletin.
8. borunun hafifçe çalkalanarak reaksiyonu durdurun ve 10 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj DMEM (10 mi) arasında eşit bir şekilde artırmıştır.
9. Her tüp içine 10 mL DMEM ilave, süpernatant süzün 6 dakika boyunca 700 xg'de tekrar pipetleme ile pelet ve santrifüj tekrar süspansiyon. İki kez tekrarlayın.
10. Toplamak ve yeni bir 50 ml konik tüp içine 100 mikron süzgeç vasıtasıyla asılı hücreleri ile DMEM (60 gr yağ temsil 4 tüpler 40 ml DMEM toplam) geçmektedir.
11. Yavaşça pipet medium birkaç kez, yeni bir 1.5 mi Eppendorf tüpü içinde de ve kısım% 0.4 tripan mavisi solüsyonu (1:10 seyreltme) 180 ul ile karıştırılmış hücre ihtiva eden bir ortamda 20 ul karıştırın.
12. DMEM / F12,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve penisilin,% 1 antibiyotik içeren bir kültür ortamında kültür kabı veya plakanın arzu edilen boyutu üzerine 60.000 hücre / ^cm2 yoğunluğunda, bir daha sonra hemositometre ve tohum pADSC ile hücre sayımı -streptomycin-amfoterisin B çözeltisi (P / S / A). Genel olarak, adiposit ya osteosit farklılaşması için 6-çukurlu doku kültür levhaları üzerinde pADSC tohum. Kök hücreleri ya da kondrosit farklılaşması yüzey işaretleyici boyama için 10 cm'lik kaplar ile ilgili pADSC tohumu.
13. Plakalar hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere,% 5 _CO2 ile havada, 37 ° C kuluçka makinesi içinde kapların inkübe edin.

Akış Sitometrisi ile pADSC 4. Kimlik Kök hücre yüzey belirteçleri

1. 24 saat sonra tamamen orta kaldırmak, inci yıkamafosfat tamponlu salin (PBS), 37 ° C'de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml Hasat hücreleri ile iki kez E 10 cm'lik bir tabak.
2. Kültür ortamında (1 mi) eşit miktarda tripsin-EDTA nötralize yeni bir 15 ml'lik konik bir tüp içinde hücreleri toplamak, ve daha sonra, 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
3. süpernatant süzün. 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile birlikte pipetle iki kez 3 ml buz soğukluğunda FCS yıkama tamponu kullanılarak tekrar süspansiyon (PBS,% 10 FBS ihtiva eden) pelet yıkayın.
4. Tekrar süspansiyon sayısı ve buz soğukluğunda FCS yıkama tamponu içinde 10 ⁶ hücre / ml pADSC ayarlayın. Birden çok yeni 15-ml'lik konik tüpler içine yerleştirin hücreleri (100 ul / her tüp) ve her iki fikoeritrin-konjüge CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE karşı antikorlarla, 30 dakika boyunca 4 ° C 'de pADSC ihtiva eden tüpler inkübe , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE veya doğrudan boyama MHC II-PE. FCS yıkama tamponu 400 x g centrifugat ile birlikte 10 ml hücreler iki kez yıkanarak reaksiyonu durdurun7 dakika için iyon.
5. Fix ve üreticinin talimatlarına ve önceki yayın ^18'e göre akış sitometri için (% 0.01 FBS ve% 1 formaldehit ile PBS) sabitleme tampon hücreleri tekrar süspansiyon.

Adipositler, kemik ve kondrosit içine pADSC 5. Farklılaşma

1. adipositlere pADSC farklılaşması
   1. adiposit indüksiyon orta ve adiposit bakım ortamı hazırlayın
      1. (10 mg / ml HEPES tamponu, pH 8) 1 mL arasında insülin stokları, final kons =: adiposit endüksiyon ortamı, aşağıdaki ihtiva eden (% 1 antibiyotik P / S / A) ile serumsuz DMEM / F12 1 L hazırlanması 10 ug / ml; 1 ul T3 hazır (3,3 ', 5 triiodo-L-tironin, DMSO içinde 1 mM), son konsantrasyonu = 1 nM; 200 ul transferin hazır nihai konsantrasyon = 10 ug / ml (50 mg / ml iki kez damıtılmış _H2O); 100 ul deksametazon stok (etanol içinde 10 mM), final kons = 1 uM; 100 ul rosiglitazon stok (DMSO içinde 10 mM), final kons= 1 uM.
      2. indüksiyon ortamıyla aynı eklemelerle adiposit bakım ortamı hazırlayın, ama deksametazon ihmal ile.
   2. adipositler için Farklılaşma süreci
      Not: 6-yuvalı plakalar üzerinde pADSC tohumlama sonra pADSC 72 saat içinde birleşmiş edilecektir.
      1. 3 gün sonra, tam orta kaldırmak ve daha sonra her kuyuya adiposit endüksiyon ortamı 3 ilave edin. Inkübatör plakaları geri dön. Bu farklılaşma gün sıfırdır.
      2. 3 gün sonra, tam adiposit indüksiyon orta kaldırmak ve adiposit Bakım ortamının 3 ml üç günde ile değiştirin. Olgun adipositler ölümcül yaklaşık 9 gün ayırt edilecektir. adipositlerin% 90 üzerinde de bu protokolü kullanarak ayrılır. Bu adipositler yağ kırmızısı için hazırdır.
2. osteositleri içine pADSC farklılaşması
   1. osteosit endüksiyon ortamı hazırlayın: Tüm kültür Mediu'yu1 uM deksametazon, 10 mM β-gliserofosfat, 50 ug / ml askorbat-2-fosfat içeren m (% 10 FBS ve% 1 P / S / A DMEM / F12).
   2. osteositleri için Farklılaşma süreci
      Not: 6-yuvalı plakalar üzerinde pADSC tohumlama sonra pADSC 72 saat içinde birleşmiş edilecektir.
      1. 3 gün sonra, tam orta kaldırmak ve her bir kuyuya osteosit endüksiyon ortamı 3 ilave edin. 37 ° C inkübatör plakaları dönün. Bu farklılaşmanın gün sıfırdır.
      2. her üç günde bir osteosit indüksiyon ortamı ile değiştirin. Olgun osteositlerde farklılaşma 14 gün oluşturacaktır. Bu osteositlerde Alizarin Kırmızı S boyama için hazır.
3. kondrosit içine pADSC farklılaşması
   1. Kondrosit endüksiyon ortamı hazırlayın: αMEM% 1 FBS, 6.25 ug / mL arasında insülin, 50 ug / ml askorbat-2-fosfat içeren ve 10 büyüme faktörü-ß1 transforme ng / ml.
   2. kondrosit için Farklılaşma süreci
      1. 24 st için 10 cm'lik kültür tabakları üzerinde pADSC tohumlama sonra tamamen kültür ortamı çıkarın ve iki kez PBS ile bulaşıkları yıkama.
      2. daha sonra 1 5 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ve ile tripsinize pADSC 1 ml kültür ortamı ile nötralize edin. Toplama, sayısı ve tüp başına 2.5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda 15 ml konik tüplerde pADSC ayarlayın. hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
      3. 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj işleminden sonra, pelet bozmadan süpernatan atılır ve 15 ml bir tüp içinde, kondrosit endüksiyon ortamı 1 ml. Tüp, 37 ° C inkübatör döndürülür. Bu farklılaşmanın gün sıfırdır.
      4. alt hücreleri çıkarmadan kondrosit indüksiyon orta üç günde değiştirin. Olgun kondrositler yaklaşık 14 gün içinde oluşacaktır. Bu kondrositlerin Toluidin Mavi O boyama için hazır.

Farklılaştırılmış adipositlerinde, Osteocy 6. boyanmasıTES ve Kondrositler

1. farklılaşmış adipositler için Yağ Kırmızı O boyama
   1. 9. günde, farklı adipositler 6 oyuklu kültür plakaları içinde adiposit bakım ortamını çıkarın ve daha sonra PBS ile iki kez plakayı yıkayın. [Aşağıdaki adımlarda, 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna karşılamak için yeterli belirlenmiş reaktifler ilave edin.]
   2. En az 10 dakika süreyle% 10 formalin ile adiposit düzeltildi.
   3. % 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez plakayı yıkayın.
   4. İki yıkamadan sonra, kültür plakasına% 100 propilen glikol ekleyin ve 1 dakika boyunca bekletilir.
   5. % 100 propilen glikol çıkarın ve daha sonra, kültür plakasına, Yağ Kırmızı O solüsyonu (propilen glikol içinde% 0.5) ilave edilir. yumuşak çalkalama (100 rpm) ile bir rocker çalkalayıcı üzerinde en az 10 dakika boyunca bekletin.
   6. Yağ Kırmızı O solüsyonu çıkarın ve sonra% 60 propilen glikol ile değiştirin. 1 dakika boyunca bekletin.
   7. % 60 propilen glikol çıkarın ve D ile iki kez plakayı yıkayınsu ouble-damıtıldı.
   8. % 10 formalin solüsyonu ile değiştirin. adipositlerin içinde lekeli lipid damlacıkları, ışık mikroskobu ile gözlem için hazırız.
   9. Hücre içi Yağlı Kırmızı O miktarının (aşağıda opsiyonel adım): mikroskopik gözlemlerden sonra,% 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez plakayı yıkayın.
   10. tam plaka boşaltın ve 6 oyuklu plaka izopropanol 500 ul ekle.
   11. izopropanol, Yağ Kırmızı O seviyesinde boya çözündürülmesi için en az 10 dakika boyunca hafif bir külbütör çalkalayıcıda (100 rpm) 6-çukurlu plaka içindeki bekletin
   12. Oil Red O içeren izopropanol aspire ve 96 oyuklu bir plaka üzerinde dağıtır. 510 nm'de spektrofotometrik okuma kullanılarak çıkarılan Oil Red O niceliğini.
2. farklılaşmış osteositlere için Alizarin Kırmızı S boyama
   1. 14. günde, farklı osteosit 6 oyuklu plakalar ile osteosit endüksiyon orta kaldırmak ve iki kez PBS ile plakaları yıkayın. [Followi iseNG 6 oyuklu plakanın her bir karşılamak için yeterli belirlenmiş reaktifleri ekleme adımları tekrarlayın.]
   2. En az 10 dakika boyunca% 10 formalin ile osteosit düzeltildi.
   3. Her kuyudan% 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez plakayı yıkayın.
   4. İki yıkamadan sonra, 6-çukurlu plaka% 2 Alizarin kırmızı çözeltisi (= 4.1-4.3 pH) ekleyin ve yumuşak bir külbütör çalkalayıcıda (100 rpm) üzerinde en az 15 dakika boyunca bekletilir.
   5. Alizarin Kırmızı S çözüm çıkarın ve sonra çift distile su ile iki kez plaka yıkayın.
   6. % 10 formalin solüsyonu ile değiştirin. Osteositlerde, ışık mikroskobu ile gözlem için hazırız.
3. farklı Kondroitlerin Toluidin Mavi O lekeleme
   1. 14. günde, PBS ile iki kez tüp tüp alt farklılaşmış kondrositlerin tortuların çözülmesinde ve yıkama olmadan 15 ml konik tüp aspire kondrosit indüksiyon ortamı. [Aşağıdaki adımlarda, cove için yeterli belirlenen reaktif ekleyinr Tüpün veya bölüm slayt alt kondrositler.]
   2. En az 10 dakika süreyle% 10 formalin ile kondrositlerin düzeltildi.
   3. Her bir tüpten% 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez tüp yıkayın.
   4. İki yıkamadan sonra, 5 um kalınlığında bir kriyostat oct Bileşim ve kesit pelet yerleştirin.
   5. Toluidin Mavi O çözeltisi (pH 4.1,% 0.1) ile birlikte kriyostat bölümlere lamele.
   6. Toluidin Mavi O çözüm çıkarın ve sonra çift distile su ile iki kez bölümüne yıkayın.
      Not: slaytlar üzerinde Kondrositler ışık mikroskobu ile gözlem için hazırız.

Sonuçlar

Domuz dorsal deri altı yağından türetilen pADSC kültürü kapların üzerine ekildi ve Şekil 2'de gösterildi. Stromal vasküler fraksiyondan elde edilen pADSC morfolojisi fare veya insan ADSC benzer. Yirmi dört saat tohumlama sonra, alt birleşme pADSC yapıştırılmış ve bir genişletilmiş fibroblast benzeri morfolojisi (Şekil 2A) sahiptir. PADSC 72 saat içinde konfluent olmak ve adiposit veya diğer mezenkimal tipi farklılaşma (Şekil 2B) hazır olacaktır. Kimyasal indüksiyon ve olgun adipositler adipogenic farklılaşma (Şekil 2C) gösteren pADSCs% 90 üzerinde olan farklılaşma 9 gün sonra görülebilir sonra güçlü adipogenic potansiyelini sergilemek pADSC.

Bu protokolde elde edilen pADSC özelliklerini karşılamak için, pADSC yüzey belirteçleri anal flow sitometri ile değerlendirildiSalman kararı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, CD29, CD44, CD90 ve MHC I (ya da HLA I) da dahil olmak üzere mezenşimal sap hücreleri yüzey işaretleyicileri, yüksek ifade edildi. Böyle CD4a, CD31, CD45 ve MHC II (veya HLA II) negatif yüzey belirteçleri, protokolü (Şekil 3) elde edilen pADSC güçlükle saptanabilir idi. Bu sonuçlar göstermektedir ki miyeloid veya lenfoid atalarıdır dahil olmak üzere önemli endotelyal veya hematopoetik kök hücre kontaminasyonu, olmadan bu pADSC sergi mezenkimal tipi kök hücre özellikleri.

bundan başka pADSC mezenkimal kök hücreleri temsil onaylamak için pADSC ve multipotency adipositler, kemik ve kondrosit içine farklılaşma tarafından muayene edilmiştir. Bu adipositler, kemik ve kondrositler, belirli boya, Yağ Kırmızı O, Alizarin Kırmızısı S ve Toluidin Mavi O, sırasıyla, (Şekil 4) ile boyandı. Bu veriler, bu protokol mu muhafaza pADSC oluşturulan belirtmekmezenkimal tipi progenitörlerin benzeyen tam özelliklere sahip ltipotency.

Lütfen domuz yağ bölgeden pADSC Şekil 2. morfolojisi. (A) Birlikte akan pADSC yapıştırılmış ve 6 oyuklu bir kültür plakasına 24-H tohumlama sonra artmıştır. (B) pADSC 6 oyuklu bir kültür plakasına 72-H tohumlama sonra konfluent hale geldi. (C) Olgun adipositler pADSC gelen adipojenik farklılaşma 9 gün sonra gözlenmiştir. Görüntüler faz kontrast mikroskobu kullanarak 100 x büyütme alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kök hücre Şekil 3. KimlikpADSC yüzey belirteçleri. pADSC 1 x 10 ⁵ spesifik antikorlar ile reaksiyona sokuldu ve analiz akış sitometresi ile kök hücre markörleri için analiz edilmiştir. Sayılar boyanmamış kontrol ile karşılaştırıldığında nüfus (kırmızı) lekeli hücrelerin yüzdesini gösterir. x-ekseni nispi parlaklık yoğunluğu temsil etmektedir. Y-ekseni hücrelerinin popülasyonunu temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

PADSC bölgesinin pADSC. Multipotency Şekil 4. Multipotent farklılaşma (A) adipositler, (B), osteositler (C), kondrositlerin içine pADSC ayırt tarafından belirlenir ve Örnek boyalar, sırasıyla, Yağ Kırmızı O, Alizarin Kırmızısı S ve Toluidin Mavi O ile boyanmıştır . Images (A) 100 x (B) 200 x ve faz kontrast mikroskobu kullanılarak (C) 100 x büyütme alındı, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada pADSC birincil hücre kültüründe adipoz doku gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem sunuyoruz. Diğer ölümsüzleştirdi hücre hatları ile karşılaştırıldığında, bu yöntem adipositler veya in vivo hayvan gelişimi ile ilgili diğer mezenkimal soy farklılaşma süreçlerini incelemek için uygulanabilir yüksek kaliteli yetişkin mezenkimal kök hücrelerin büyük miktarlarda izole etmek kolay bir yol sağlar. Bu protokol kritik modifiye adım, başka türlerden ^19,20, verim ve pADSC arasında multipotency yaşlı domuzlarında karşılaştırıldığında küçük domuz yavrusu kullanımı kolay ve ucuz olduğu için 7 ila 9 günlük domuz yavrusu kullanılarak pADSC elde olmasıdır domuz yaşları ²¹ olarak azalır.

Potansiyel kök hücre kaynakları embriyonik kök hücreleri (ESC), uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC), ve doğum sonrası yetişkin kök hücreleri içerir. Erişkin Multipotent kök hücreler olarak sınıflandırılan ADSC bir kısıt, yetişkin kök hücrelerin bu multipotency olduğunufarklı soyları ayırt nispeten ESC veya IPSC ile karşılaştırıldığında sınırlıdır. Ancak, IPSC ESC ve onkojenik özellikleri türetme konusunda etik konular ESC ve IPSC ^22,23 uygulanmasını dizginlemek. Bu nedenle, çok sayıda araştırmacı pluripotensini geliştirmek için çabaları ile erişkin kök hücrelerin üzerine odaklanmıştır. Uzun zamandan beri çalışılmaktadır yetişkin mezenkimal kök hücrelerin (MSC), en yaygın kaynak kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler ²⁴ olduğunu. Ancak, hasat kemik iliği nispeten ağrılı işlem olarak kabul edilmektedir. Başka bir endişe kemik iliğinden kök hücrelerin verimi sonlu olmasıdır. Kemik iliği aspirasyonu ml başına 6 × 10 ⁶ çekirdekli hücrelerin ortalama verim ve MSC sadece tüm çekirdekli hücrelerin 0.001 0.01 ila% temsil etmektedir. Bu dezavantajları göz önünde sonra ADSC multipotent kök hücreleri ^25,26 elde etmek için daha az rahatsızlık verici kaynağı olarak önerilmektedir.

regenera içinde ADSC kullanımı ile ilgili sınırlamalartif ilaç hücre verimi ve kalitesi üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, bu protokolde ADSC izole etmek için domuz istihdam önemi yüksek kaliteli yetişkin kök hücrelerin büyük miktarda verim etmektir. Domuz ve türler ^27-30 arasında karşılaştırılabilir bir organ boyutu ve bir çok fizyolojik ve biyokimyasal benzerlikler insan temsil yararlı bir hayvan modelidir. ticari şirketlerden hADSC Kazanılması pahalı ve birçok durumda hücre manipüle edilmiş, geçişli ya da kriyoprezerve olduğunu. insan klinik örneklerin Kazanılması nedeniyle etik konular nispeten zordur ve ADSC üretimi sınırlıdır. Kollagenaz sindirim sonra g yağ başına yaklaşık 6 x 10 ⁵ hADSC elde. Kadın meme yağ dokusu, 100 g (ortalama numune) ile, 6 X 10 ⁷ hücre toplam hasat edilebilir. Tek bir fare kullanarak, verim daha da azdır. 1 x 10 ⁶ hücre toplam deri altı fare i 0.4 g hasat edilebilirBir yetişkin FVB fare iki bacak arasından nguinal adipoz doku (6-8 haftalık). Bununla birlikte tek bir kişi domuz (7 ila 9 gün) içinde 2 x 10 ⁸ hücrelerinin toplam; sırt yağ deposu elde edilen deri altı yağ dokusu 60 g hasat edilebilir. Bu protokolde elde edilen pADSC tam mezenkimal tipi multipotency ve uygun mezenkimal kök hücre belirteçleri var. Bu nedenle, pADSC kök hücre kalitesinden ödün vermeden, yetişkin kök hücrelerin büyük miktarlarda elde etmek için uygun bir kaynağıdır.

pADSC uygulama adipogenesis ve lipogenesis içeren adiposit farklılaşmasını deşifre ile sınırlı değildir. Son zamanlarda, ADSC rejeneratif tıp ^22,31,32 alanında kök hücre popüler bir kaynak haline gelmiştir. Diğer kök hücre kaynaklarına kıyasla, ADSC kolay erişilebilir ve bol olma bir avantaj korumak ve, sağlam multipotency kök hücre tedavisi ve doku e için umut verici bir kaynak olduğu gösterilmiştirngineering ^22,33,34. Yağ dokusunun kolay erişilebilirlik ADSC multipotent atalarıdır almak için en az müdahaleci yollarından biri yapar. Son zamanlarda, pADSC mezenkimal farklılaşması (yayınlanmamış veriler) sınırlı değildir belirten glikoz-tepkimeli ensülin salgılayan kümeler halinde pADSC ayırt. Diğerleri de ADSC gibi ya ektodermal nöron (hADSC ³⁵ veya pADSC ³⁶⁾ (hADSC ³⁷ veya pADSC ³⁸⁾ endodermal hepatositler gibi germ türetilen bir çok hücre türlerine göre edilebileceğini ispat edilmiştir. Bu nedenle, pADSC istenen soy elde etmek için farklı farklılaşma süreçleri hücreleri yönlendirerek yüksek verimli ilaç veya biyo materyal taranması için kullanılabilir. Bu nedenle, bu protokolde elde edilen pADSC rejeneratif tıp araştırmaları için kök hücre tedavisi ve doku nakli potansiyel uygulama var.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-001-1
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution	Biological Industries	03-033-1	For antibiotics and antimycotic usage
αMEM, no nucleosides	Life Technologies	12561-049
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Life Technologies	25200072
CD4a-PE	Sigma-Aldrich	SAB4700063
CD29-PE	Sigma-Aldrich	SAB4700398
CD31-PE	Sigma-Aldrich	SAB4700467
CD44-PE	Sigma-Aldrich	SAB4700183
CD45-PE	Sigma-Aldrich	SAB4700483
CD90-PE	Sigma-Aldrich	SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I)	Sigma-Aldrich	SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)	Sigma-Aldrich	SAB4700662
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	I7018
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Rosiglitazone	Cayman	71740
β-Glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422
2-Phospho-L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	49752
TGFB1 Recombinant Human Protein	R&D Systems	240-B-002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Carbon Steel Blades	Thomas Scientific	6727C18
Falcon 100 µm cell strainer	Corning	352360
Falcon 6-well plate	Corning	353046
Falcon 100 mm  dish	Corning	353003