Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Özet

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Özet

Akciğer soy farklılaşma büyüme faktörü sinyalizasyon, hücre-hücre etkileşimleri ve hücre-matriks etkileşimleri içeren karmaşık çevresel ipuçları entegrasyonunu gerektirir. Bu nedenle karmaşıklığı nedeniyle, in vitro olarak akciğer gelişiminin tekrarlama zorlu olan akciğer epitelyal hücrelerine kök hücrelerin farklılaşmasını teşvik etmek. Bu protokol, hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kök hücre türevli yolu epitel hücreleri akciğer, 3 boyutlu bir ortam taklit eden ve üretmek için kullanılır. Fare embriyonik kök hücre ilk önce decellularized iskelelerinin üzerine ekilir aktivin A Endoderm hücreleri ile bir embriyoid gövde (EB) kültür yöntemi kullanılarak endoderm soyuna farklılaşmış ve en fazla 21 gün süreyle hava-sıvı arayüzü kültüre edilir. Bu teknik, ek büyüme faktörü takviyesi olmadan fonksiyonel hava yolu epitel hücrelerine seribaşı hücreler (kirpikli hücreler, kulüp hücreleri ve bazal hücreler) farklılaşmasını teşvik eder. Bu kültür kurulum tanımlanır, serum-ücretsiz, ucuz ve tekrarlanabilir. Sınırlı kirlenme kültüründe olmayan akciğer endoderm soydan gelen olmamasına rağmen, bu protokol sadece hava yolu epitel popülasyonları üretir ve alveol epitel hücrelerinin neden vermez. Bu protokol ile oluşan hava yolu epitelial akciğer organojenez esnasında ve hastalık modelleme ya da sistik fibroz gibi hava yolu ilgili patolojilerin ilaç keşfi platformları için hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Akciğer soy pluripotent hücrelerin Yönetmen farklılaşma ^mikro-1,2 hassas sinyal olayları bağlıdır. Bu nedenle sürecin dinamik doğası in vitro akciğer organogenez kesin olayları taklit etmek zor olmuştur. Son raporlar akciğer farklılaşma ^3-8 ulaşmak için iki boyutlu kültürlerin çözünür büyüme faktörü takviyesi ile adım adım soy kısıtlama stratejilerini kullanmışlardır. adım adım farklılaşma protokollerde, pluripotent hücreler, embriyonik kök hücreleri (ESC) veya uyarılmış pluripotent kök hücreler olup, ilk kesin endoderm germ tabakasına ayırt edildi. homeodomen içeren transkripsiyon faktörü NKX2-1 ifadesi ile tanımlanan endodermal hücreler daha sonra, akciğer progenitör hücrelere daha sonra bir ön endoderm kaderine itti ve bulundu. Bu akciğer atalarıdır daha proksimal (havayolu) veya uzak (alveolar) akciğer epitel hücrelerinin wi için ayırt edildiinci büyüme faktörü takviyesi devam etti. Böyle 2 boyutlu stratejiler akciğer epitel hücreleri üreten bazı başarı vardı, ancak orada belirsiz verimlilik, diğer Endodermal soy mümkün kirlenme, 3 boyutlu (3D) yapı eksikliği gibi çeşitli sınırlamalar vardır ve bazı durumlarda tanımlanmamış kültürlerin kullanımı serum takviyesi ile. Hücresizleştirilmiş akciğer iskeleler üzerine pluripotent veya farklılaşmış hücrelerin kültürü artan akciğer epitelyal yapılar ^3,5,6,8,9 oluşturan Serpilen hücreleri, rejeneratif potansiyelini değerlendirmek için bir tahlil olarak kullanılır. Bu tür raporlar kültür sürekli büyüme faktörü veya serum takviyesi ile İskele üzerinde hücreleri ekildi.

Akciğer gelişimi çevresel işaretlere yanıt olarak bölünmesi, göç, gen ekspresyonu ve tek tek hücrelerin farklılaşmasını içermektedir. hücre dışı matrisi (ECM) yapısal destek sağlamanın yanı sıra, tissu yönlendiren glikoproteinlerin bir kafes olanentegre ve bu süreçleri ^10,11 düzenleyerek e morfolojilerinden. Daha iyi in vivo akciğer gelişim ortamını taklit etmek endoderm kültürü için doğal bir platform olarak akciğer ECM iskele kullanarak, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirlik ile ayar tanımlanmış 3D-kültürde hücre kökenli havayolu epitel hücrelerini kök yarattı.

Fare, akciğer ECM iskeleleri oluşturulan Decellularization hem de fare ESC türetilmiş endodermal hücreler tarafından üretilen ve daha sonra, bu iskeleler üzerine ekilmiştir. CXCR4 ve c-KIT proteinlerinin Çift ifade havayolu (proksimal akciğer) progenitör hücreler olarak tanımlanır Sox2 & NKX2-1 ifade hem pozitif kesin bir endoderm hücre kimliğini ve hücreleri gösterir. Kesin endoderm hücreleri in vitro fonksiyonel hava yolu epitel hücreleri üretmek için üç hafta kadar hava sıvı arayüzü (ALI) de kültüre edildi.

Bu protokol tanımdan akciğer soy farklılaşmasını teşvikgibi erken NKX2-1 ⁺ / Sox2 ⁺ erken proksimal akciğer ataları ortaya çıkması ile gözlenen 7 gün olarak tive endoderm. 14. günde ve kirpikli de ortaya kültür olgun hava yolu epitel hücre popülasyonlarının 21 (TUBB4A ^+), kulüp (SCGB1A1 ⁺⁾ ve bazal (TRP63 ⁺ KRT5 ⁺⁾ yerel fare solunum yollarında morfolojik ve fonksiyonel benzerlik ile hücreleri tarafından. Bu protokol epitel hücreleri hava yolu sağlam farklılaşma elde etmek için 3D-matris mikroçevresinin önemini ortaya koymaktadır.

Protokol

Hayvan deneyleri Sick Children Araştırma Enstitüsü Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. İskele Hazırlık

1. akciğer Decellularization
   1. CO ₂ odasının kullanılarak yetişkin Wistar sıçan Euthanize. Odasında hayvan koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO ₂ pozlama başlar.
      1. bilinçsizlik için hayvan gözlemlemek; Bu yaklaşık 2-3 dakika sonra ortaya çıkar. bilinçsizlik Bu süre içinde oluşmazsa, hızı ve oda mühür doldurmak kontrol edin. bilinçsizlik ardından, soluk göz rengi ve solunum olmaması için hayvan gözlemleyin. Her iki gözlenmesi halinde, 1-2 dakika boyunca _CO2 doldurma korumak ve daha sonra prosedür için odasından gelen hayvan çıkarın.
   2. forepaws ve arka ayakları sabitleyerek yüzey diseksiyon hayvan Güvenli ve% 70 etanol ile göğüs ve karın bölgeyi sprey. kalp ve lu girişsternum boyunca dikey bir kesi kullanılarak göğüs boşluğu açılarak NGS.
   3. diyafram üzerinden küçük kesiler yapmak ilk akciğerleri delinmesiyle şansını azaltmak, akciğerler geri çekmek için neden. Bir dikiş ile inferior vena kava bağlanır ve küçük diseksiyon makas ile sol atrium küçük bir kesi yerleştirin.
   4. Heparinize Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (HBSS, 10 U / ml heparin) ile dolu bir 25 G iğne ile hazırlanmış bir 10 ml şırınga kullanarak, akciğer dolaşımı sayesinde tampon itmek için sağ ventrikül içine iğne sokarak akciğer perfüzyon başlatmak (2 ml / dakika oranı). Akciğerler beyaz çevirmek ve sol atrium akan sıvı berrak bitene kadar bu işleme devam edin.
   5. perfüzyon ardından, tiroid kıkırdak yakın plastik bir kateter ile trakea ve cannulate ortaya çıkarmak ve bir dikişle yerine sabitleyin.
   6. Kur bir imbik standı ve kelepçe bir 10 ml şırınga sabitleyerek bir yerçekimi perfüzyon sistemi. Kaldır discard şırınga pistonu. akciğerler üzerinde 20 cm şırınga varil üzerinde maksimum doldurma noktasını sabitleyin. şırınga sonuna ve kanüle trakeaya decellularization çözümü sunmak için vana diğer ucuna uzun bir plastik boru için iki yönlü stopcock takın. şırıngaya çözüm dökün ve çözüm ekli plastik boru ve kateter doldurmak için izin verir.
      1. 1 dakika boyunca total akciğer kapasitesi (yaklaşık 12 ml) doldurarak akciğerleri lavaj ve sıvı akciğerlerin dışarı akmasına izin vermek için trakea plastik kateter çıkarın. H ₂ O 20 cm altına basınç tutmak için akciğerlere lavaging şırınga fazla 10 ml doldurmayın
   7. fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 10 kez batırıldıktan ardından sekiz kez decellularization çözeltisi ile akciğerlerin tekrar lavajı.
   8. boyun ve göğüs boşluğundan serbest trakea ve akciğerler incelemek ve hayvan kaldırmak. vibratome se hazırlık kadar 4 ° C 'de soğuk PBS doku tutunctioning.
2. Kalın bölüm nesil
   1. % 2 yaklaşık 15 ml (ağırlık / hacim) agaroz% 4 ve% 6 kadar küçük dikdörtgen bloklar halinde, tüm lobu yerleştirmek için (ağırlık / hacim) agaroz hazırlayın. mikrodalga PBS içinde düşük erime noktalı agaroz toz eritilir. Bir ısı bloğu 50 ml tüpler agaroz aktarın ve jelleşmenin önüne geçmek üzere 40 ° C 'nin üzerindeki sıcaklığı muhafaza.
   2. Küçük bir makas kullanarak her lob (kranial, orta, aksesuar ve kuyruk sağa loblar ve sol lob) ayırmak için her lober bronş sonunda decellularized akciğer teşrih. Pat aşırı PBS kaldırmak ve% 2 içine yerleştirmek için emici yaprak kullanarak her lob kurutun (w / v) agaroz ısıtma bloğu üzerinde iken.
   3. Petri kabı yerleştirmek, agaroz içinde kaplamanın 5 dakika sonra her bir lob kaldırma ve yüzey soğuk plaka üzerinde 1 dakika boyunca jel sağlar.
   4. Yavaşça 5 dakika sonra, tekrar% 4 (ağırlık / hacim) agaroz serin lobları yerleştirin ve% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ile bir kez daha kaplama tekrarlayın.
   5. ardışık co sonraHer lob ating, kenarlarından çevreleyen doku agaroz en az 3 mm olan metal taban kalıplar kullanılarak% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ayrı her lobun yerleştirin. Orient her lob deneyci bakan metal kalıbın yüzeyinde lobunun en büyük yassı kenarını konumlandırarak forseps kullanarak. Bu kenar vibratome kesit için numune plakasına sabitlenmiş taraf olacaktır.
   6. blok önceden vibratome ile kesit için en az 30 dakika süreyle soğuk plaka üzerinde jel izin verin. 4 ° C'de en çok 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada saklayın blok önce kesit vibratome.
   7. Kur soğuk PBS ¹² ile kesit odasını doldurarak vibratome. Çevre buz banyosu ile kesit boyunca soğuk sıcaklık korumak. metal kalıplar blokları kaldırmak ve doku kenarından yaklaşık 3 mm tutarken, lobu çevreleyen aşırı agaroz aşağı trim bir jilet kullanın.
   8. yapıştırıcı kullanılarak numune plakasının merkezine doku düzeltmek ve t içine plaka daldırınO kesit odasını PBS dolu. 0,2 mm / sn, 1.85 mm ve 350 um: sırasıyla aşağıdaki hız, genlik ve kalınlık değerleri seçerek vibratome sınırlarını kesit Kur.
      Not: lob yönlendirme uzunlamasına ve enine iki kısmı, kabul edilebilir.
   9. Bölüm her lob tamamen. Bir bölüm tam bölüm dizisinin sonunda bıçak ile ayrılmış değilse elle kesilmiş bölümleri küçük makas kullanarak ücretsiz. nazikçe iskele bölümleri toplayın ve bir sonraki adıma kadar buz üzerinde PBS tutmak.
      Not: Oluşturulan Bölümler proksimal ve distal akciğer alanlarına ve recellularization için kullanılabilir her iki kaynaktan içerecektir; Bununla birlikte, yüzeyin en uzak akciğer içerecektir.
3. skafold bölümlerinin atım
   1. mikrosantrifüj tüpler (30 bölüm / tüp) PBS 350 mikron kalınlığında iskele bölümleri aktarın ve nükleaz ile tedavi (PBS içinde 90 U / ml) (Malzeme listesi bakınız) 12 - üzerinde oda sıcaklığında 24 saat,Bir rotator.
   2. nükleaz işlemin ardından, yeni bir mikrosantrifüj tüplerine forseps kullanılarak bir döndürücünün üzerine, oda sıcaklığında 6 saat süre ile, steril koşullar altında (PBS içinde 200 U / ml penisilin streptomisin ve 25 ug / ml amfoterisin B), antimikrobiyal çözeltisi ile muamele transferi bölümlerinden oluşmaktadır.
      Not: iskeleleri, kullanımdan önce bir hafta kadar 4 ° C antimikrobiyal çözelti içinde saklanabilir.
   3. antimikrobiyal çözeltisi ile arındırma adımından sonra steril şartlar altında iki kez PBS ile yıkayın iskeleleri ve hücreler ile tohumlanmasından önce serbest farklılaşma ortamı (SFDM) serum aktarın.

2. Endodermal Hücre Hazırlama

1. Kesin Endoderm İndüksiyon
   1. 2i koşullar ¹³ kullanılarak besleyici içermeyen, serum serbest kültürü altında fare ESC hatları korumak. Trypsinization tarafından yapışık pluripotent kültüründen hücreleri kaldırarak endoderm indüksiyon başlayın.
   2. 20,000 bir yoğunlukta SFDM tohum hücrelerin yeniden süspanseOrtam değişikliği olmadan hücreler üç gün boyunca, düşük yapışkan tabaklar / ml EB oluşumuna imkan vermek için.
   3. Üç gün yavaşça, 10 ml bir pipet kullanarak 50 ml konik tüp EBS aktarmak ve onları oda sıcaklığında 3 dakika boyunca alt almasına izin sonra.
   4. Dikkatlice aspire medya ve eklemek taze SFDM medya 50 ng / ml aktivin A ile desteklenmiş
   5. geri 1 düşük yapışık plakalar üzerine Tohum hücreleri üç gün daha 2 yoğunluğu ve kültür kesin endoderm farklılaşma elde etmek.
2. Kesin Endoderm zenginleştirme
   1. Gün 6 EBS toplamak tripsin ile ayırmak ve konjuge floresan antikorlar ¹⁴ kullanılarak c-KIT ve CXCR4 ifade etiket.
   2. Her ikisinin de işaretleyicilerin ekspresyonu için floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanılarak Sıralama etiketli hücreler zenginleştirilmiş bir nihai endoderm popülasyonu ¹⁵ elde edildi.

3. Recellularization Kurulumu

1. Hava-sıvı arayüzükültür kurulumu
   1. Steril forseps kullanarak bir hidrofobik yüzen membran (8 mikron gözenek boyutu) üzerine SFDM her decellularized iskele bölümü (adım 1.2.9) aktarın. iskele sağlamak bölümler zar üzerinde eşit yayılır.
   2. sırasıyla SFDM 1 ya da 0.5 ml ile kuyu doldurarak 6 veya 12 oyuklu plakalar hazırlamak. Yavaşça bir hava-sıvı kültür kurulum oluşturma, zar medyanın üstünde yüzen sağlayan kuyu içine membranlar yerleştirin.
2. 3D iskelelerinin tohumlama
   1. Kesin endoderm belirteçleri (adım 2.2.2) için aşağıdaki FACS, hemasitometre kullanarak sıralanmış hücreleri saymak SFDM 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 400 xg'de aşağı doğru döndürün. Yaklaşık olarak 100,000 hücre / 10 ul / iskelet ihtiva eden bir birim elde etmek için tekrar süspansiyon hücreleri.
   2. doğrudan adım 3.1.2 her hazırlanmış bölümü üzerine pipet, hücrelerin 10 ul iskelesi recellularize için.
   3. kültürlerinde, her 48 saat SFDM ortamı değiştirin. hafif bir eğim de plaka tutarak eski medya aspirekültür bozmamak için. Yavaş yavaş dalgalı membran batan önlemek için oyuk kenarı boyunca kültüre taze SFDM ekleyin.
   4. olgun havayolu epitel numaralı seribaşı hücrelerin farklılaşmasını sağlamak kadar 21 gün boyunca hava-sıvı kültürleri korumak.
      Not: Recellularized bölümler hücre kültürü ¹⁶ boyunca herhangi bir zaman noktasında, doku boyama ve imünoflöresan (IF) mikroskopi için işlenebilir.

Sonuçlar

Bu protokolde belirtildiği gibi, kesin endoderm sağlam farklılaşma epitel hücreleri decellularized akciğer iskele bölümleri numaralı seribaşı hücrelerin uzun kültürünü kullanılarak elde edilebilir havayolunu olgun. Decellularized iskeleleri (1) konak hücreler tamamen çıkarıldığından emin olmak için karakterize, ve (2) hücre dışı matriks proteinleri farklılaşması için iskeleler kullanmadan önce korunmuş tavsiye edilir. Şekil 1A 'de ...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol başka hiçbir takviyesi ile farklılaşmayı doğrudan sadece doğal akciğer iskeleleri kullanarak olgun ESC türetilmiş havayolu epitel üretir. Bu kültür, kurulum, serumsuz, pahalı olmayan ve tekrarlanabilir tanımlanır. Baz farklılaşma medya yok büyüme faktörü takviyesi gereklidir. Kök hücre kökenli akciğer epitel hücreleri üretmek için daha önce yayınlanmış yöntemler soy kısıtlama ^3,4,8,18,19 teşvik etmek büyüme faktörü takviyesi ile 2 boyutlu st...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive