Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Resumo

Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.

Resumo

Pulmão diferenciação linhagem requer integração de sinais ambientais complexos que incluem o factor de crescimento de sinalização, as interacções célula-célula e as interacções célula-matriz. Devido a esta complexidade, recapitulação de desenvolvimento do pulmão in vitro para promover a diferenciação de células estaminais para as células epiteliais do pulmão tem sido um desafio. Neste protocolo, andaimes pulmonares descelularizados são utilizados para imitar o ambiente de 3-dimensional do pulmão e gerar células epiteliais das vias aéreas derivadas de células estaminais. células-tronco embrionárias de rato são primeiro diferenciado à linhagem endoderme usando um método de cultura corporal embryoid (EB) com células da endoderme activina A. são então semeadas em andaimes descelularizados e cultivadas a interface ar-líquido por até 21 dias. Esta técnica promove a diferenciação de células semeadas para as células epiteliais das vias aéreas funcional (células ciliadas, células do clube, e células basais) sem suplementação adicional de fator de crescimento. Esta configuração cultura é definida, seru-M livre, barato e reprodutível. Embora não haja contaminação limitado de linhagens endoderme não-pulmonares na cultura, este protocolo só gera populações epiteliais das vias aéreas e não dá origem a células epiteliais alveolares. epitélios das vias aéreas gerados com este protocolo pode ser utilizado para estudar as interacções célula-matriz durante a organogénese de pulmão e para modelar doenças ou plataformas de drogas de descoberta de patologias relacionadas com o das vias respiratórias, tais como a fibrose cística.

Introdução

Dirigido a diferenciação de células pluripotentes para a linhagem de pulmão é dependente de eventos de sinalização precisos no microambiente ^1,2. Devido à natureza dinâmica deste processo tem sido um desafio para mimetizar os acontecimentos precisos de organogénese do pulmão in vitro. Relatórios recentes têm utilizado estratégias de restrição de linhagem passo a passo com a suplementação de culturas bidimensionais factor de crescimento solúvel para alcançar a diferenciação pulmonar ^3-8. Nos protocolos de diferenciação passo a passo, as células pluripotentes, se as células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas, foram pela primeira vez diferenciado para a camada endoderme germe definitiva. As células da endoderme foram subsequentemente empurrado para um destino endoderme anterior e posteriormente para as células progenitoras de pulmão, como identificado pela expressão do factor de transcrição contendo homeodom�io NKX2-1. Estes progenitores pulmão foram ainda mais diferenciado para proximal (via aérea) ou de células epiteliais do pulmão distais (alveolares) with continuou a suplementação de fator de crescimento. Tais estratégias 2-dimensionais têm tido algum sucesso na geração de células epiteliais do pulmão, no entanto, existem várias limitações, incluindo a eficiência pouco claras, a possível contaminação de outras linhagens endoderme, a falta de uma estrutura 3-dimensional (3D), e, em alguns casos, usar de culturas indefinidas com a suplementação do soro. Cultura de pluripotentes ou células diferenciadas em andaimes pulmonares descelularizados é cada vez mais utilizado como um ensaio para avaliar o potencial de regeneração de células semeadas na formação de estruturas epiteliais pulmonares ^3,5,6,8,9. Tais relatórios cultura células semeadas em andaimes com fator de crescimento contínuo ou suplementação de soro.

desenvolvimento pulmonar envolve a divisão, migração, a expressão do gene e a diferenciação de células individuais em resposta a estímulos ambientais. A matriz extracelular (ECM) é uma treliça de glicoproteínas que, além de fornecer apoio estrutural, dirige tissue morfogênese, integrando e regular esses processos ^10,11. Ao utilizar o andaime ECM pulmão como uma plataforma natural para a cultura endoderme para melhor imitar o pulmão meio de desenvolvimento in vivo, que são geradas as células estaminais epiteliais das vias aéreas derivadas de células em uma cultura 3D-ajuste definido com alta eficiência e reprodutibilidade.

Rato andaimes ECM pulmonares foram gerados pela descelularização, bem como células da endoderme rato ESC-derivados foram gerados e subsequentemente semeadas em andaimes estes. expressão dual de CXCR4 e proteínas c-kit indica uma identidade de células endoderme definitivo e células positivas para ambos SOX2 & expressão NKX2-1 são identificadas como células das vias respiratórias (pulmonar proximal) progenitoras. As células da endoderme definitivas foram cultivadas na interface ar-líquido (ALI) durante até três semanas para gerar células epiteliais das vias respiratórias in vitro funcional.

Este protocolo promove a diferenciação de pulmão linhagem Definitiva endoderme tão cedo quanto 7 dias, observadas com o surgimento de NKX2-1 ⁺ / SOX2 ⁺ progenitoras pulmonares proximais início. Por volta do dia 14 e 21 de populações de células de cultura maduros epiteliais das vias aéreas emergirão, inclusive ciliadas (TUBB4A ^+), clube (SCGB1A1 ⁺⁾ e basal (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ células com semelhança morfológica e funcional de vias aéreas nativas do mouse. Este protocolo demonstra a importância do microambiente-matriz 3D para atingir a diferenciação forte para células epiteliais das vias respiratórias.

Protocolo

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Animal Care do Hospital para Crianças Doentes Research Institute.

1. Andaime Preparação

1. Decelularização dos pulmões
   1. Euthanize ratos Wistar adultos usando CO ₂ câmara. Coloque o animal na câmara e começar a 100% de exposição de CO ₂ a uma velocidade de enchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto.
      1. Observe animal para a inconsciência; isto irá ocorrer após cerca de 2-3 min. Se inconsciência não ocorre neste período de tempo, verificar a taxa e vedação da câmara preencher. Na sequência de inconsciência, observe animal para a cor dos olhos desapareceu e falta de respiração. Se ambos forem observadas, manter CO ₂ enchimento para 1-2 min e em seguida, remover animais da câmara para o procedimento.
   2. Fixe animal para dissecar superfície fixando patas dianteiras e as patas traseiras, e spray para baixo do peito e abdômen com etanol 70%. Acesse o coração e luNGS por abertura da cavidade torácica através de uma incisão vertical ao longo do esterno.
   3. Fazer pequenas incisões através do diafragma primeiro para fazer com que os pulmões se retraia, reduzindo a possibilidade de perfurar os pulmões. Ligadura da veia cava inferior com uma sutura e colocar uma pequena incisão no átrio esquerdo com pequenas tesouras de dissecação.
   4. Usando um preparado seringa de 10 ml com uma agulha de 25 L preenchido com uma solução de sal equilibrada heparinizado de Hank (HBSS) (10 U / ml de heparina em HBSS), começar a perfusão pulmonar através da inserção da agulha para dentro do ventrículo direito para empurrar o tampão através da circulação pulmonar (taxa de 2 ml / min). Continue esse procedimento até que os pulmões ficam brancos e do fluido que flui do átrio esquerdo corre claro.
   5. Na sequência de perfusão, expor a traqueia e canular com um cateter de plástico perto da cartilagem tireóide e fixe no lugar com uma sutura.
   6. Instalação de um sistema de perfusão gravidade através da fixação de uma seringa de 10 ml a um stand retorta e grampo. Remover e discard êmbolo da seringa. Segurança do ponto de enchimento máximo no corpo da seringa a 20 cm acima dos pulmões. Adaptar uma torneira de duas vias para a extremidade da seringa, e um tubo de plástico de comprimento até à outra extremidade da torneira para o fornecimento de solução de descelularização para a traqueia canulada. Despeje solução na seringa e permita que a solução para preencher tubos de plástico anexado e cateter.
      1. A lavagem dos pulmões por enchimento a capacidade pulmonar total (cerca de 12 ml) durante 1 min e remover o cateter de plástico a partir da traqueia para permitir que o fluido se escoe para fora dos pulmões. Não encha seringa mais de 10 ml quando lavaging pulmões para manter a pressão abaixo de 20 cm de H ₂ O.
   7. Repetir a lavagem dos pulmões oito vezes com solução de descelularização, seguido de 10 lavagens com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   8. Dissecar a traqueia e os pulmões livre da cavidade pescoço e peito e retire do animal. Manter o tecido em PBS frio a 4 ° C até à preparação para vibratome SEctioning.
2. geração seção de espessura
   1. Prepare a cerca de 15 ml de 2% e 4% (w / v) de agarose, e suficientemente 6% (w / v) de agarose para a incorporação de todos os lobos em pequenos blocos retangulares. Dissolver baixo pó de agarose ponto de fusão em PBS por microondas. Transferir a agarose para tubos de 50 ml em um bloco de aquecimento e manter a temperatura acima de 40 ° C para evitar a gelificação.
   2. Dissecar pulmonar descelularizado no final de cada brônquio lobar para separar cada lóbulo (craniana, médio, acessório, e lobos caudal direito e do lobo esquerdo) usando uma tesoura pequena. Seque cada lóbulo utilizando folhas absorventes para remover o excesso de PBS e colocar dentro de 2% (w / v) de agarose, enquanto no bloco de aquecimento.
   3. Remover cada lobo após 5 min de revestimento em agarose, coloque em um prato de Petri e deixe a superfície gel durante 1 min em uma placa fria.
   4. Suavemente colocar lóbulos de volta em 4% (w / v) de agarose, fresco, após 5 min, e repetir revestimento mais uma vez com a 6% (w / v) de agarose.
   5. Após co sequencialating de cada lóbulo, incorporar cada lóbulo separadamente em 6% (w / v) de agarose utilizando moldes de metal de base com pelo menos 3 mm de agarose em torno do tecido a partir das bordas. Orient cada lóbulo utilizando uma pinça posicionando a borda plana maior do lóbulo na superfície do molde de metal virada para o experimentador. Esta vantagem é o lado fixo à placa de amostra para vibratome seccionamento.
   6. Permitir blocos de gel na placa fria durante pelo menos 30 minutos antes do corte com vibratome. Armazenar blocos numa câmara humidificada durante até 12 h a 4 ° C antes de seccionamento vibratome.
   7. Configuração do vibratome, preenchendo a câmara de seccionamento com PBS frio ^12. Manter a temperatura fria durante todo o corte com o banho de gelo circundante. Remover os blocos a partir de moldes de metal e usar uma lâmina de barbear para cortar para baixo excesso de agarose em torno lóbulos, enquanto mantém a cerca de 3 mm a partir da borda do tecido.
   8. Fix tecido para o centro da placa de amostras utilizando adesivo, e submergir placa em Tele PBS-cheia câmara de corte. Setup seccionamento limites sobre vibratome, selecionando os seguintes valores de velocidade, amplitude, e espessura, respectivamente: 0,2 mm / seg, 1,85 mm e 350 mm.
      Nota: as secções longitudinais e transversais do lobo orientação são aceitáveis.
   9. Seção cada lóbulo completamente. Manualmente secções de corte livre usando uma tesoura pequena se uma secção não é totalmente separados por lâmina na extremidade da sequência de secção. Recolhe secções de andaime suavemente e manter em PBS em gelo até ao próximo passo.
      Nota: Secções gerados incluirá ambas as zonas proximal e distai do pulmão e ambas as fontes podem ser utilizadas para recelularização; No entanto, a maior parte da superfície irá abranger pulmão distai.
3. Descontaminação de secções de andaime
   1. Transfira a 350 mícrons seções de andaime grossas de PBS para microtubos (até 30 seções / tubo) e tratar com nuclease (90 U / ml em PBS) (veja Lista de Materiais) para 12-24 horas à temperatura ambiente, emum rotor.
   2. A seguir ao tratamento por nucleases, as secções de transferência usando uma pinça para tubos de microcentrífuga novos e tratar com uma solução antimicrobiana (200 U / ml de estreptomicina penicilina e 25 ug / ml de anfotericina B, em PBS), sob condições estéreis, durante 6 h à TA, num agitador rotativo.
      Nota: Os andaimes pode ser armazenado em solução antimicrobiana para até uma semana a 4 ° C antes da utilização.
   3. A seguir ao passo de descontaminação com solução antimicrobiana, lavar duas vezes com PBS andaimes sob condições estéreis e transferir ao soro meios diferenciação livre (SFDM) antes da inoculação com células.

2. endodérmico celular Preparação

1. Definitive Endoderma Indução
   1. Manter linhas de rato ESC sob, a cultura livre de soro livre de alimentador usando condições 2i ^13. Comece indução endoderme, removendo as células de cultura pluripotentes aderente por tripsinização.
   2. Ressuspender as células em SFDM e sementes a uma densidade de 20.000células / ml em baixas placas aderentes por três dias sem alteração de mídia para permitir a formação de EB.
   3. Depois de três dias suavemente transferir os CEs em tubos de 50 mL cónico, utilizando uma pipeta de 10 ml e permitir que eles se acumulem na parte inferior por 3 min a RT.
   4. Cuidadosa da mídia aspirado e adicionar mídia SFDM fresco suplementado com 50 ng / ml activina A.
   5. Semear as células de volta para a baixa placas aderentes na proporção de 1: 2 a densidade ea cultura durante três dias adicionais para atingir a diferenciação endoderme definitiva.
2. enriquecimento endoderme definitiva
   1. Recolha dia 6 EBS, dissociar com tripsina e rotular para c-KIT e expressão CXCR4 utilizando anticorpos fluorescentes conjugados ^14.
   2. Ordenar as células marcadas utilizando separação de células activada por fluorescência (FACS) para a expressão de ambos os marcadores para obter uma população enriquecida endoderme definitiva ^15.

3. Configuração Recellularization

1. interface ar-líquidoconfiguração cultura
   1. Transfira cada seção andaime decelularizado (passo 1.2.9) da SFDM para uma membrana flutuante hidrofóbico (8 tamanho de poro) usando uma pinça estéril. Garantir andaime seções estão distribuídos uniformemente sobre a membrana.
   2. Prepare 6 ou 12 poços placas por enchimento dos poços com 1 ou 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Suavemente colocar membranas nos poços, permitindo que a membrana flutue na parte superior dos meios de comunicação, a criação de uma instalação de cultura ao ar-líquido.
2. Semeadura de scaffolds 3D
   1. Seguintes FACS para marcadores endoderme definitivas (passo 2.2.2) contagem de células classificados usando um hemocitômetro, girar a 400 xg durante 5 min e ressuspender em SFDM. Ressuspender as células para se obter um volume contendo cerca de 100.000 células / 10 ul / andaime.
   2. Para recellularize andaimes, pipeta de 10 ml de células diretamente em cada seção preparado a partir do passo 3.1.2.
   3. Substituir mídia SFDM em culturas a cada 48 horas. Aspirar a velha mídia, segurando a placa a uma ligeira inclinaçãopara evitar prejudicar a cultura. Lentamente, adicionar SFDM fresco à cultura ao longo do lado do poço para evitar afundamento da membrana flutuante.
   4. Manter culturas de ar-líquido para até 21 dias para alcançar a diferenciação de células semeadas no epitélio das vias aéreas maduro.
      Nota: repovoados secções pode ser processado para a coloração de tecidos e de imunofluorescência microscopia (IF), em qualquer ponto de tempo durante a cultura de células de ^16.

Resultados

Conforme descrito neste protocolo, a diferenciação robusto de endoderme definitiva para amadurecer das vias aéreas células epiteliais podem ser alcançados com a cultura prolongada de células semeadas em seções de andaime de pulmão descelularizados. Recomenda-se que andaimes descelularizados ser caracterizado para garantir (1) células hospedeiras são completamente removidos, e (2) as proteínas da matriz extracelular são preservadas antes de utilizar andaimes para a diferencia...

Discussão

O protocolo aqui descrito gera epitélio das vias aéreas ESC-derivado maduros usando apenas andaimes naturais pulmonares à diferenciação com nenhuma outra suplementação dirigir. Esta configuração é definida cultura,, barato e reprodutível isento de soro. Nenhuma suplementação do factor de crescimento dos meios de diferenciação base é necessária. Métodos publicados anteriormente para a geração de células epiteliais do pulmão derivadas de células-tronco têm usado estratégias de 2-dimensional com a ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive