Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

Резюме

Этот протокол эффективно направляет эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных окончательное энтодермы для зрелых эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта методика дифференциации использует 3-мерные decellularized каркасы легких направить спецификации клонов легких, в определенной, не содержащей сыворотки настройки культуры.

Аннотация

Lung родословная дифференциация требует интеграции сложных экологических сигналов, которые включают в себя передачу сигналов фактора роста, межклеточных взаимодействий и клетка-матрица взаимодействий. Из - за этой сложности, рекапитуляцию развития легких в пробирке способствовать дифференциации стволовых клеток в легких эпителиальных клеток было сложной задачей. В этом протоколе decellularized подмости легочные используются для имитации 3-мерную среду легкого и генерировать полученной из культур клеток эпителиальных клеток дыхательных путей стволовых клеток. Эмбриональных стволовых клеток мыши сначала дифференцированы в энтодермы линии с использованием метода культуры эмбриоидного тела (EB) с энтодермы клетками активина A. Затем высевали на decellularized подмостей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс на срок до 21 дней. Этот метод способствует дифференциации посеянных клеток к функциональным эпителиальных клеток дыхательных путей (реснитчатые клетки, клубные клетки и базальных клеток) без дополнительного добавок фактора роста. Эта установка культуры определяется, Серум-свободный, недорогой и воспроизводимым. Хотя существует ограниченное загрязнение от не-легочных энтодермальных линий в культуре, этот протокол генерирует только в дыхательных путях эпителиальные населения и не приводят к гиперплазии эпителиальных клеток. Эпителий дыхательных путей, генерируемые с этим протоколом могут быть использованы для изучения клеточной матрицы взаимодействий во время органогенеза легких и для моделирования заболевания или наркотиков обнаружения платформ дыхательных патологий, таких как кистозный фиброз.

Введение

Направленной дифференцировки плюрипотентных клеток к линии легкого зависит от точных сигнальных событий в микросреде ^1,2. Из - за динамической природы этого процесса он был сложным , чтобы имитировать точные события органогенеза легких в лабораторных условиях . Последние отчеты использовали пошаговый стратегии ограничения родословная с фактором роста растворимы добавок двумерных культур для достижения дифференциации легких ^3-8. В ступенчатых протоколов дифференцировки, плюрипотентные клетки, то ли эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, были впервые дифференцированы к окончательному энтодермы зародышевого слоя. Энтодермальная клетки впоследствии доводятся до передней энтодермы судьбы, а затем к клеткам-предшественников легких, которые, как определено выражением гомеодоменовым содержащих фактора транскрипции NKX2-1. Эти клетки-предшественники легких были дополнительно дифференцированы проксимальных (дыхательные пути) или дистальных (альвеолярных) эпителиальных клетках легких Wiго фактора роста по-прежнему добавок. Такие 2-мерные стратегии имели некоторый успех в создании легких эпителиальных клеток, однако есть несколько ограничений, включая неясными эффективности, возможного загрязнения от других энтодермальных линий, отсутствие 3-мерного (3D) структуры, а в некоторых случаях использование неопределенных культур с добавками сыворотки. Культура плюрипотентные или дифференцированных клеток на decellularized каркасах легких все чаще используется в качестве анализа для оценки регенеративный потенциал посеянных клеток в формировании легочных эпителиальных структур ^3,5,6,8,9. Такие отчеты культуры высевали клетки на каркасах с продолжающимся фактором роста или сыворотки добавок.

Развитие легкого включает в себя разделение, миграцию, экспрессию генов и дифференцировки отдельных клеток в ответ на сигналы окружающей среды. Внеклеточного матрикса (ЕСМ) является решетчатой ​​гликопротеинов, которые в дополнение к обеспечению структурной поддержки, направляет Tissuе формообразование путем интеграции и регулирования этих процессов ^10,11. При использовании ECM легких строительных лесов в качестве естественной платформой для энтодермы культуры , чтобы лучше имитировать в естественных условиях легких среду развития, мы сгенерировали стволовых клеток , полученных эпителиальных клеток дыхательных путей в определенной 3D-культуры настройки с высокой эффективностью и воспроизводимостью.

Крыса легких ECM каркасы были сгенерированы decellularization, а также мышь ESC-полученных энтодермальных клеток были получены и впоследствии высевали на этих каркасах. Двойное выражение CXCR4 & C-KIT белков указывает на окончательную идентичность клеток энтодермы и клеток положительный результат как для SOX2 и экспрессии NKX2-1 идентифицированы как клетки в дыхательных путях (проксимальная легких) предшественниках. Definitive энтодермальные клетки культивировали при воздушной жидкости интерфейс (ALI) на срок до трех недель для создания функциональной эпителиальных клеток дыхательных путей в пробирке.

Этот протокол способствует легких клонов дифференциации опреденый энтодерма уже 7 дней, наблюдаемые с появлением NKX2-1 ⁺ / ⁺ SOX2 ранние проксимальных клеток - предшественников легких. На 14 -й день и 21 культуры популяций зрелых клеток в дыхательных путях эпителиальных появляются , в том числе ресничного (TUBB4A ^+), клуб (SCGB1A1 ⁺⁾ и базальных (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ клеток с морфологической и функциональной схожести с носителями дыхательных путей мыши. Этот протокол демонстрирует важность 3D-матрицы микросреды для достижения надежной дифференциации для эпителиальных клеток дыхательных путей.

протокол

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для животных комитета по охране госпиталя для больных детей Научно-исследовательского института.

1. Подготовка Эшафот

1. Decellularization легких
   1. Эвтаназии взрослых крыс линии Вистар с использованием СО ₂ камеры. Поместите животное в камеру и начать воздействия 100% СО ₂ при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту.
      1. Заметим, животное для бессознательности; это произойдет после того, как приблизительно 2-3 мин. Если потеря сознания не происходит в этот период времени, проверьте скорость и камеры уплотнения заполнения. После потери сознания, наблюдать за животное выцветшие глаза и отсутствие дыхания. Если оба наблюдаются, поддерживать наполнение СО ₂ в течение 1-2 мин , а затем удалить животное из камеры для процедуры.
   2. Закрепить животное рассекает поверхность, фиксируя передними лапами и задними ногами, и брызги вниз грудь и область живота с 70% этанола. Доступ к сердцу и луNGS путем открытия грудной полости с использованием вертикальный разрез вдоль грудины.
   3. Сделать небольшие надрезы через диафрагму сначала вызвать легкие втягиваться, уменьшая вероятность прокола легких. Лигирования нижней полой вены с швом и поместите небольшой разрез в левом предсердии с небольшими рассекающих ножницами.
   4. Используя приготовленный шприц объемом 10 мл с 25 G иглой, заполненную сбалансированным солевым раствором гепаринизированной Хэнкса (HBSS) (10 ед / мл гепарина в HBSS), начинают перфузию легких, вставив иглу в правый желудочек, чтобы толкать буфер через легочный кровоток (скорость 2 мл / мин). Продолжайте эту процедуру, пока легкие не белеют и жидкость течет из левого предсердия чистой.
   5. После перфузии, разоблачить трахеи и иглу с пластиковым катетером возле щитовидного хряща и зафиксировать на месте с помощью шовного материала.
   6. Настройка силы тяжести системы перфузии с помощью фиксации 10 мл шприц к штативу и зажимом. Удалить и discard поршень шприца. Закрепите точку максимума наполнения на цилиндра шприца на 20 см выше легких. Приложить двусторонний запорный кран к концу шприца и длинной пластиковой трубки к другому концу запорного крана для подачи decellularization раствора в канюлированного трахеи. Налейте раствор в шприц и дайте раствор для заполнения комплектных пластиковых трубок и катетера.
      1. Лаважа легкие, заполняя к общей емкости легких (приблизительно 12 мл) в течение 1 мин и снять пластиковый катетер из трахеи, чтобы позволить жидкости вытекать из легких. Не заполняйте шприц более 10 мл , когда lavaging легкие , чтобы держать давление ниже 20 см H ₂ O.
   7. Повторите промывание легких восемь раз с decellularization раствором, а затем 10 промывок фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
   8. Рассеките трахею и легкие, свободной от полости шеи и груди и удалить из животного. Держите ткань в холодной PBS при 4 ° С до подготовки к vibratome SEctioning.
2. поколение толстый раздел
   1. Приготовьте приблизительно 15 мл 2% и 4% (вес / объем) агарозном, и достаточно 6% (вес / объем) агарозном для встраивания всех лепестка в небольшие прямоугольные блоки. Растворите с низкой температурой плавления порошка агарозы в PBS микроволновке. Передача агарозы в 50 мл пробирки на тепловом блоке и поддерживать температуру выше 40 ° C, чтобы избежать гелеобразования.
   2. Рассеките decellularized легких в конце каждого долевой бронх, чтобы отделить каждую лопасть (черепную, средний, аксессуар и каудальной правой долей и левой доли), используя маленькие ножницы. Пат сухой каждый лепесток с помощью абсорбирующими прокладками, чтобы удалить избыток PBS и поместить внутрь 2% (вес / объем) агарозы в то время как на нагревательном блоке.
   3. Удалите каждую лопасть через 5 мин покрытия в агарозе, поместить в чашку Петри и дайте поверхности геля в течение 1 мин на холодную пластину.
   4. Аккуратно мочки обратно в 4% (вес / объем) агарозном, остудить через 5 мин, и повторить покрытие еще раз с 6% (вес / объем) агарозы.
   5. После последовательного сотрудничестватем создания каждого лепестка, встраивать каждую лопасть по отдельности в 6% (вес / объем) агарозном геле с использованием Металлическое основание пресс-формы, по меньшей мере, 3 мм, агарозы, окружающей ткани от краев. Orient каждая лопасть с помощью щипцов, расположив большой плоский край лепестка в на поверхности металлической формы, обращенной к экспериментатору. Этот край будет стороной крепится к пластине образца для vibratome секционирования.
   6. Разрешить блоки гель на холодной плите в течение по крайней мере за 30 мин до секционирования с vibratome. Хранить блоки в увлажненной камере в течение 12 ч при температуре 4 ° С до vibratome секционирования.
   7. Настройте vibratome путем заполнения секционирования камеру с холодным PBS ^12. Поддержание холодной температуры во секционирования с ванной окружающего льда. Удалить блоки из металлических пресс-форм и использовать лезвие бритвы, чтобы урезать избыток агарозы окружающих лепестка, сохраняя при этом приблизительно 3 мм от края ткани.
   8. Закрепить ткань к центру образца пластины с помощью клея и погрузить пластины в тон PBS заполненные секционирования камеру. Настройка секционирования границ на vibratome, выбрав следующие значения скорости, амплитуды и толщины соответственно: 0,2 мм / сек, 1,85 мм, и 350 мкм.
      Примечание: Обе продольные и поперечные сечения ориентации лепестка являются приемлемыми.
   9. Раздел каждая лопасть полностью. Вручную срезанные участки бесплатно с помощью небольших ножниц, если участок не полностью отделены друг от лопатки в конце последовательности секции. Сбор секций строительных лесов осторожно и не держать в PBS на льду до следующего шага.
      Примечание: Секции, сгенерированные будет включать как проксимальных и дистальных легких областей и могут быть использованы для recellularization обоих источников; Тем не менее, большая часть поверхности будет включать в себя дистальный легких.
3. Обеззараживание секций строительных лесов
   1. Передачи, в 350 микрон толстые секции строительных лесов от PBS для микропробирок (до 30 секций / трубки) и обрабатывают нуклеазой (90 ед / мл в PBS) (см перечень материалов) в течение 12 - 24 ч при комнатной температуре, наротатор.
   2. После нуклеазная обработки, секции передачи с помощью щипцов для новых микропробирок и обрабатывают противомикробным раствором (200 ед / мл пенициллина и стрептомицина 25 мкг / мл амфотерицина В в PBS) в стерильных условиях в течение 6 ч при комнатной температуре, на ротатора.
      Примечание: Каркасы могут быть сохранены в антимикробным раствором в течение одной недели при температуре 4 ° С перед использованием.
   3. После стадии дезактивации с антимикробным раствором, полоскать подмости дважды PBS в стерильных условиях и переносят в свободной от сыворотки среде для дифференцировки (SFDM) перед посевом клеток.

2. энтодермальная Cell Подготовка

1. Definitive энтодермы Индукционная
   1. Поддержание мыши ESC линии под фидера свободной, свободной от сыворотки культуры с использованием 2i условий ^13. Начало индукции энтодермы путем удаления клеток из клейкого плюрипотентных культуры трипсинизацией.
   2. Ресуспендируют клетки в SFDM и семян при плотности 20000клеток / мл в низких прилипших планшетах в течение трех дней без замены среды, чтобы обеспечить формирование EB.
   3. Через три дня аккуратно перенести ЭТ в 50 мл конические пробирки с помощью 10 мл пипетки и дать им возможность собирать на дне в течение 3 мин при комнатной температуре.
   4. Тщательно аспирата средств массовой информации и добавить свежие SFDM, дополненной 50 нг / мл активина A.
   5. Семенной клетки обратно на низких прилипших планшеты при 1: 2 плотности и культуры в течение трех дополнительных дней для достижения окончательной дифференциации энтодермы.
2. Окончательное обогащение эндодермы
   1. Собирают день 6 ЭТ, диссоциируют с трипсином и маркировать для с-KIT и экспрессии CXCR4 с использованием конъюгированных флуоресцентных антител ^14.
   2. Сортировка меченые клетки с помощью флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) для экспрессии обоих маркеров , чтобы получить обогащенную окончательное энтодермы население ^15.

3. Установка Recellularization

1. Воздух-жидкость интерфейснастройка культуры
   1. Передача каждого decellularized раздел эшафот (этап 1.2.9) из SFDM на гидрофобной плавающей мембраной (размер пор 8 мкм) с использованием стерильного пинцета. Обеспечение строительных лесов участки распределены равномерно по мембране.
   2. Подготовка 6- или 12-луночные планшеты с заполнением лунки с 1 или 0,5 мл SFDM соответственно. Аккуратно поместите мембраны в лунки, позволяя мембране плавать на поверхности носителя, создавая установки культуры воздух-жидкость.
2. Посев 3D подмостей
   1. После FACS для окончательных маркеров энтодермы (этап 2.2.2) подсчет отсортированных клеток с использованием гемоцитометра, спином вниз при 400 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в SFDM. Ресуспендируют клетки, чтобы получить объем, содержащий приблизительно 100000 клеток / 10 мкл / эшафот.
   2. Для recellularize каркасы, пипетка 10 мкл клеток непосредственно на каждую подготовленную секцию со стадии 3.1.2.
   3. Заменить SFDM СМИ в культурах каждые 48 ч. Аспирируйте старые средства массовой информации, держа пластину под небольшим наклономчтобы избежать нарушения культуры. Медленно добавить свежий SFDM к культуре вдоль боковой стороны скважины с целью предотвращения затопления плавучего мембраны.
   4. Поддерживать воздух-жидкость культур до 21 дней, чтобы достичь дифференциации посеянных клеток для зрелой воздушной трассы эпителии.
      Примечание: Recellularized секции могут быть обработаны для окрашивания тканей и иммунофлюоресценции (IF) микроскопии в любой момент времени , в течение культивирования клеток ^16.

Результаты

Как указано в этом протоколе, надежная дифференциация окончательного энтодермы созревать дыхательные пути эпителиальные клетки могут быть достигнуты с использованием расширенной культуры посеяны клеток на decellularized секций строительных лесов легких. Рекомендуется, ?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, генерирует зрелый эпителий ESC полученные в дыхательных путях, используя только каркасы природного легкого направлять дифференцировку без других добавок. Эта установка культура определяется, не содержащей сыворотки, недорогой и воспроизводимым. Ни один факт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive