Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall'uso di decellularized Lung Ponteggi

Riepilogo

Questo protocollo dirige in modo efficiente topo staminali embrionali derivato dalle cellule endoderma definitivo per maturare delle vie aeree cellule epiteliali. Questa tecnica utilizza differenziazione 3-dimensionale impalcature polmone decellularized di indirizzare specifiche lignaggio del polmone, in un ambiente culturale privo di siero definito.

Abstract

Lung differenziazione stirpe richiede l'integrazione di stimoli ambientali complesse che includono la crescita di segnalazione fattore, interazioni cellula-cellula e le interazioni cellula-matrice. A causa di questa complessità, la ricapitolazione di sviluppo del polmone in vitro per promuovere la differenziazione delle cellule staminali alle cellule epiteliali del polmone è stato impegnativo. In questo protocollo, ponteggi polmonari decellularized sono usati per simulare l'ambiente 3-dimensionale del polmone e generare cellule delle vie respiratorie epiteliali derivati ​​da cellule staminali. Mouse sulle cellule staminali embrionali vengono prima differenziato al lignaggio endoderma utilizzando un metodo di cultura del corpo embrioide (EB) con le cellule endoderma activin A. sono poi seminate su impalcature decellularized e colta all'interfaccia aria-liquido per un massimo di 21 giorni. Questa tecnica favorisce la differenziazione delle cellule seminate alle cellule epiteliali delle vie aeree funzionale (cellule ciliate, cellule club, e le cellule basali) senza ulteriore integrazione del fattore di crescita. Questa configurazione viene definita la cultura, Seru-M libera, poco costoso, e riproducibile. Sebbene non vi sia contaminazione limitata dalla non-polmone linee endoderma nella cultura, questo protocollo genera solo delle vie aeree popolazioni epiteliali e non dà origine a cellule epiteliali alveolari. epiteli delle vie aeree generate con questo protocollo può essere utilizzato per studiare le interazioni cellula-matrice durante l'organogenesi polmonare e per la modellazione malattie o piattaforme di droga-scoperta di patologie delle vie respiratorie legate come la fibrosi cistica.

Introduzione

Differenziazione diretta delle cellule pluripotenti al lignaggio polmone dipende da eventi di segnalazione precisi nel microambiente ^1,2. A causa della natura dinamica di questo processo è stato impegnativo per simulare gli eventi precise di organogenesi polmone in vitro. Recenti studi hanno utilizzato strategie di restrizione lignaggio graduale con fattore di crescita solubili integrazione di culture bidimensionali per raggiungere la differenziazione del polmone ^3-8. Nei protocolli di differenziazione graduale, cellule pluripotenti, se le cellule staminali embrionali (ESC) o di cellule staminali pluripotenti indotte, sono stati differenziati per lo strato di endoderma germe definitiva. cellule endodermico sono stati successivamente spinti a un destino endoderma anteriori e, successivamente, di cellule progenitrici del polmone, come identificato con l'espressione del fattore di trascrizione homeodomain contenenti NKX2-1. Questi progenitori polmonari sono stati ulteriormente differenziati a prossimale (via aerea) o distali (alveolari), le cellule epiteliali del polmone wiesimo continuato l'integrazione del fattore di crescita. Tali strategie 2-dimensionali hanno avuto un certo successo nel generare cellule epiteliali del polmone, tuttavia ci sono diverse limitazioni, tra cui l'efficienza poco chiare, la possibile contaminazione da altre stirpi endodermico, la mancanza di una struttura (3D) a 3 dimensioni, e in alcuni casi uso di colture indefiniti con l'integrazione di siero. Cultura della pluripotenti o cellule differenziate su ponteggi polmonari decellularized è sempre più utilizzato come un test per valutare il potenziale di rigenerazione delle cellule seminate nella formazione del polmone strutture epiteliali ^3,5,6,8,9. cultura Tali relazioni cellule seminate su scaffold con fattore di crescita continua o supplementazione siero.

lo sviluppo del polmone comporta la divisione, la migrazione, l'espressione genica e la differenziazione delle singole cellule in risposta a stimoli ambientali. La matrice extracellulare (ECM) è un reticolo di glicoproteine ​​che, oltre a fornire supporto strutturale, dirige tissue morfogenesi integrando e regolando questi processi ^10,11. Usando il patibolo ECM polmone come una piattaforma naturale per la cultura endoderma per simulare meglio il polmone ambiente di sviluppo in vivo, abbiamo generato staminali vie aeree cellule epiteliali cellule derivate in un 3D-cultura definita impostazione con alta efficienza e riproducibilità.

Polmone Rat ponteggi ECM sono stati generati da decellularization così come le cellule endodermico del mouse ESC-derivati ​​sono stati generati e successivamente seminate su questi ponteggi. Duplice espressione di CXCR4 e proteine ​​c-kit indica una identità delle cellule endoderma definitivo e cellule positive per entrambi SOX2 & espressione NKX2-1 sono identificati come cellule delle vie respiratorie (polmoni prossimale) progenitrici. Cellule endoderma definitive sono state coltivate a interfaccia Liquid Air (ALI) per un massimo di tre settimane per generare cellule epiteliali delle vie aeree funzionale in vitro.

Questo protocollo promuove polmone lignaggio differenziazione delle definitiva endoderma fin da 7 giorni, osservate con l'emergere di NKX2-1 ⁺ / ⁺ SOX2 primi progenitori polmonari prossimali. Entro il giorno 14 e 21 di cultura maturi popolazioni di cellule delle vie respiratorie epiteliali emergere compresi ciliato (TUBB4A ^+), club (SCGB1A1 ^+), e basale (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ cellule con somiglianza morfologica e funzionale di topo vie aeree nativi. Questo protocollo dimostra l'importanza del microambiente 3D-matrice per ottenere una differenziazione robusta Airway cellule epiteliali.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato cura degli animali del Hospital for Sick Children Research Institute.

1. Preparazione Ponteggio

1. Decellularization dei polmoni
   1. Euthanize ratti Wistar adulti utilizzando CO ₂ da camera. Mettere animali nella camera e iniziare il 100% dell'esposizione di CO ₂ ad un tasso di riempimento del 10-30% del volume della camera per minuto.
      1. Osservare animale per incoscienza; questo si verifica dopo circa 2-3 min. Se incoscienza non si verifica in questo periodo di tempo, controllare il tasso di riempimento e di tenuta della camera. A seguito di perdita di coscienza, osservare animali per il colore degli occhi sbiaditi e la mancanza di respiro. Se si osservano entrambi, mantenere la CO ₂ di riempimento per 1-2 minuti e poi rimuovere animale dalla camera per la procedura.
   2. Fissare animale superficie dissezione fissando zampe anteriori e le zampe posteriori, e spruzzare lungo il torace e la zona addominale con il 70% di etanolo. Accedi al cuore e lungs aprendo la cavità toracica mediante un'incisione verticale lungo lo sterno.
   3. Fare piccole incisioni attraverso il diaframma prima di causare i polmoni a ritrattare, riducendo la possibilità di pungere i polmoni. Legare la vena cava inferiore con una sutura e mettere una piccola incisione in atrio sinistro con piccole forbici dissezione.
   4. Utilizzando un preparato siringa da 10 ml con un ago 25 G riempito con soluzione salina bilanciata eparinizzata di Hank (HBSS) (10 U / eparina ml in HBSS), avviare perfusione polmonare inserendo l'ago nel ventricolo destro per spingere il buffer attraverso la circolazione polmonare (tasso di 2 ml / min). Continuare questa procedura fino a quando i polmoni diventano bianchi e il fluido che scorre dal dell'atrio sinistro è pulita.
   5. A seguito di perfusione, esporre la trachea e cannulate con un catetere di plastica vicino alla cartilagine tiroidea e fissarlo in posizione con una sutura.
   6. Installazione di un sistema di perfusione a gravità fissando una siringa da 10 ml di una posizione storta e morsetto. Rimuovere e discard stantuffo della siringa. Fissare il punto massimo di riempimento sulla siringa a 20 cm sopra i polmoni. Attaccare un rubinetto a due vie alla fine della siringa, e un lungo tubo di plastica per l'altra estremità del rubinetto per l'erogazione soluzione decellularization alla trachea cannulata. Versare la soluzione nella siringa e consentire la soluzione di riempire tubi di plastica attaccato e il catetere.
      1. LAVAGGIO polmoni riempiendo alla capacità polmonare totale (circa 12 ml) per 1 min e rimuovere il catetere di plastica dalla trachea per permettere il passaggio del fluido in uscita dei polmoni. Non riempire siringa più di 10 ml quando lavaging polmoni per mantenere la pressione sotto i 20 cm di H ₂ O.
   7. Ripetere il lavaggio dei polmoni otto volte con soluzione decellularization, seguito da 10 risciacqui con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   8. Sezionare la trachea e polmoni libera dalla cavità collo e al torace e rimuovere dall'animale. Mantenere il tessuto in PBS freddo a 4 ° C fino preparazione vibratome sectioning.
2. generazione sezione di spessore
   1. Preparare circa 15 ml di 2% e il 4% (w / v) di agarosio, e abbastanza 6% (w / v) di agarosio per l'incorporamento tutti lobi in piccoli blocchi rettangolari. Sciogliere punto di fusione agarosio in polvere a basso contenuto di PBS per microonde. Trasferire il agarosio a 50 ml provette su un blocco di calore e mantenere la temperatura superiore a 40 ° C per evitare la gelificazione.
   2. Dissect polmone decellularized alla fine di ogni bronco lobare staccare ogni lobo (craniale, centrale, accessorio, e lobi caudali destro e il lobo sinistro) utilizzando piccole forbici. Pat asciugare ciascun lobo utilizzando fogli assorbenti per rimuovere l'eccesso di PBS e posto interno 2% (w / v) agarosio mentre sul blocco riscaldante.
   3. Rimuovere ciascun lobo dopo 5 min di rivestimento in agarosio, posto in una piastra di Petri e lasciare che la superficie di gel per 1 minuto su un piatto freddo.
   4. Posizionare delicatamente lobi indietro nel 4% (w / v) agarosio, fresco dopo 5 minuti, e ripetere il rivestimento ancora una volta con il 6% (w / v) di agarosio.
   5. Dopo aver co sequenzialeDELL'INDICE DI di ciascun lobo, incorporare ciascun lobo separatamente 6% (w / v) di agarosio con stampi a base di metallo con almeno 3 mm di agarosio che circonda il tessuto dai bordi. Orient ciascun lobo usando pinze posizionando grande bordo piatto del lobo sulla superficie di stampo metallico rivolto sperimentatore. Questo bordo sarà il lato fissato alla piastra provino per vibratome sezionamento.
   6. Consentire blocchi di gel sulla piastra fredda per almeno 30 minuti prima di sezionamento con vibratome. blocchi Conservare in una camera umidificata per 12 ore a 4 ° C prima vibratome sezionamento.
   7. Impostazione vibratome riempiendo la camera di sezionamento con PBS freddo ^12. Mantenere la temperatura fredda per tutto il sezionamento con il bagno di ghiaccio circostante. Rimuovere isolati da stampi metallici e utilizzare una lama di rasoio per tagliare le eccesso di agarosio lobi circostante, mantenendo circa 3 mm dal bordo del tessuto.
   8. Fissare il tessuto al centro del piatto portacampione con adesivo, e sommergere piatto in tegli PBS pieno di camera di sezionamento. Setup sezionamento confini su vibratomo selezionando i seguenti valori di velocità, ampiezza e spessore rispettivamente: 0.2 mm / sec, 1,85 mm, e 350 micron.
      Nota: sezioni Sia longitudinali e trasversali del lobo orientamento sono accettabili.
   9. Sezione ciascun lobo completamente. Manualmente sezioni tagliate libera utilizzando piccole forbici se una sezione non è completamente separata dalla lama al termine della sequenza di sezione. Raccogliere sezioni impalcatura delicatamente e tenere in PBS in ghiaccio fino alla fase successiva.
      Nota: Le sezioni generati includeranno sia le aree prossimali e distali del polmone e entrambe le fonti possono essere utilizzate per Recellularization; Tuttavia, la maggior parte della superficie comprenderà polmone distale.
3. Decontaminazione delle sezioni ponteggio
   1. Trasferire i 350 micron di spessore sezioni impalcatura da PBS per provette da microcentrifuga (fino a 30 sezioni / tubo) e trattare con nucleasi (90 U / ml in PBS) (vedi elenco dei materiali) per 12 - 24 ore a temperatura ambiente, inun rotatore.
   2. Dopo il trattamento nucleasi, sezioni di trasferimento con pinze a nuove provette da microcentrifuga e trattare con la soluzione antimicrobica (200 U / ml di streptomicina penicillina e 25 mg / ml di amfotericina B in PBS) in condizioni sterili per 6 ore a temperatura ambiente, su un rotatore.
      Nota: Scaffolds possono essere memorizzati in soluzione antimicrobica fino ad una settimana a 4 ° C prima dell'uso.
   3. Dopo la fase di decontaminazione con una soluzione antimicrobica, lavare ponteggi due volte con PBS in condizioni sterili e trasferire al siero dei media differenziazione gratuito (SFDM) prima della semina con le cellule.

2. endodermico cellulare Preparazione

1. Definitiva endoderma induzione
   1. Mantenere le linee del mouse ESC sotto, cultura libera siero senza alimentatore utilizzando condizioni 2i ^13. Inizia l'induzione endoderma eliminando le cellule pluripotenti da cultura aderente da tripsinizzazione.
   2. Risospendere le cellule in SFDM e sementi ad una densità di 20.000cellule / ml a basse piastre aderenti per tre giorni senza cambiare supporto per consentire la formazione di EB.
   3. Dopo tre giorni il trasferimento delicatamente EBS in 50 ml provette coniche con una pipetta 10 ml e permettono loro di raccogliere in fondo per 3 minuti a temperatura ambiente.
   4. Attentamente i media aspirare e di mezzi aggiunga SFDM freschi integrato con 50 ng / ml activin A.
   5. cellule seme di nuovo sul basso piastre aderenti ad un 1: Densità 2 e cultura per tre giorni aggiuntivi per raggiungere la differenziazione endoderma definitivo.
2. Definitiva arricchimento endoderma
   1. Raccogliere giorno 6 EBS, dissociarsi con tripsina e l'etichetta per il c-kit e l'espressione CXCR4 utilizzando anticorpi fluorescenti coniugati ^14.
   2. Ordina cellule marcate utilizzando la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule (FACS) per l'espressione di entrambi i marcatori per ottenere un arricchito popolazione endoderma definitivo ^15.

3. Installazione Recellularization

1. interfaccia aria-liquidoinstallazione di cultura
   1. Trasferire ogni sezione impalcatura decellularized (fase 1.2.9) da SFDM su una membrana galleggiante idrofobica (8 micron dimensioni dei pori) con pinza sterile. Assicurarsi impalcatura sezioni sono distribuite in modo uniforme sulla membrana.
   2. Preparare 6 o 12 pozzetti riempiendo i pozzi con 1 o 0,5 ml di SFDM, rispettivamente. Posizionare delicatamente membrane in pozzi, permettendo la membrana di galleggiare sulla cima di supporto, creando una configurazione coltura aria-liquido.
2. Semina di ponteggi 3D
   1. A seguito di FACS per i marcatori endoderma definitivo (punto 2.2.2) contano cellule ordinati utilizzando un emocitometro, centrifugare a 400 xg per 5 minuti e risospendere in SFDM. Risospendere le cellule per ottenere un volume contenente circa 100.000 cellule / 10 microlitri / ponteggi.
   2. Per recellularize ponteggi, pipetta 10 ml di cellule direttamente su ogni sezione preparata dal punto 3.1.2.
   3. Sostituire i media SFDM culture ogni 48 ore. Aspirare i vecchi media tenendo il piatto con una leggera pendenzaper evitare di interrompere la cultura. Aggiungere lentamente SFDM fresco alla cultura lungo il lato del pozzo per impedire affondamento della membrana galleggiante.
   4. Mantenere le culture aria-liquido per un massimo di 21 giorni per raggiungere la differenziazione di cellule seminate a epiteli delle vie aeree maturo.
      Nota: Recellularized sezioni possono essere trattati per la colorazione dei tessuti e immunofluorescenza microscopia (IF) in un punto qualsiasi momento durante la coltura cellulare ^16.

Risultati

Come indicato in questo protocollo, robusto differenziazione endoderma definitivo di maturare cellule epiteliali delle vie aeree può essere realizzato utilizzando la cultura estesa di cellule seminate su sezioni impalcatura polmone decellularized. Si raccomanda di impalcature decellularized essere caratterizzati per garantire (1) cellule ospiti vengono completamente rimossi, e (2) proteine ​​della matrice extracellulare sono conservati prima di utilizzare ponteggi per la differenzia...

Discussione

Il protocollo qui descritto genera epiteli delle vie aeree ESC-derivato maturi utilizzando solo impalcature polmone naturale indirizzare la differenziazione con nessun altro supplementazione. Questa configurazione viene definita la cultura,, poco costoso, e riproducibile privo di siero. Non è richiesto alcun fattore di crescita integrazione dei media differenziazione di base. Metodi precedentemente pubblicati per la generazione di cellule epiteliali del polmone di cellule derivate da staminali hanno usato strategie 2-d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive