דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Summary

פרוטוקול זה מפנה ביעילות עכבר גזע עוברי תא נגזרות האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל. טכניקת בידול זה משתמשת 3 ממדי פיגומי ריאות decellularized לכוון מפרט שושלת ריאות, באווירת התרבות מוגדרת, סרום ללא.

Abstract

בידול שושלת ריאות מחייב שילוב של רמזים סביבתיים מורכבים הכוללים איתות גורם גדילה, תאי תאי אינטראקציות ויחסי גומלין התא-מטריקס. בשל מורכבות זו, חזרה על התפתחות ריאות במבחנה לקדם התמיינות תאי גזע לתאי האפיתל ריאות כבר מאתגר. בפרוטוקול זה, פיגומים ריאות decellularized משמשים לחקות את הסביבה 3-מימדי של הריאה וליצור תאים בדרכי הנשימה אפיתל גזע תאים שמקורם. תאי גזע עוברי עכבר הם מובחנים ראשונים בשושלת endoderm באמצעות גוף embryoid (EB) שיטת תרבות עם תאי האנדודרם Activin א אז הם זורעים על פיגומי decellularized ותרבותי על ממשק אוויר נוזלי עד 21 ימים. טכניקה זו מקדמת בידול של תאים שנזרעו לתאי האפיתל בדרכי נשימה תפקודיות (תאי ריסים, תאי מועדון, ותאי הבזליים) ללא תוספת גורם צמיחה נוספת. התקנת תרבות זו מוגדרת, Seruמ 'חופשי, זול, לשחזור. למרות שיש זיהום מוגבל משורות endoderm הלא-ריאה בתרבות, פרוטוקול זה רק מייצר אוכלוסיות אפיתל דרכי הנשימה ואינו להצמיח לתאי האפיתל מכתשיים. epithelia Airway שנוצר עם פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות מטריקס התא במהלך organogenesis ריאות עבור מודלים המחלה או פלטפורמות גילוי תרופות של פתולוגיות הקשורות בדרכי הנשימה כגון סיסטיק פיברוזיס.

Introduction

בידול בימוי של תאים פלוריפוטנטיים אל שושלת ריאות תלויה אירועים איתות מדויק במיקרו-סביבה של ^1,2. בשל האופי הדינמי של תהליך זה כבר מאתגר לחקות את האירועים המדויקים של organogenesis ריאות במבחנה. הדיווחים אחרונים השתמשו באסטרטגיות הגבלת שושלת חכמת צעד עם תוספת גורם גדילה המסיסה של תרבויות דו ממדים כדי להשיג בידול ריאות ^3-8. בפרוטוקולי בידול צעד חכם, תאים פלוריפוטנטיים, אם תאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע מושרים, הובדלו ראשון שכבת ניבט האנדודרם הסופית. תאי Endodermal מכן נדחפו אל גורל endoderm קדמי ואילך כדי ובתאים ריאות, כפי שהוגדרו על ידי הביטוי של NKX2-1 גורם שעתוק המכיל homeodomain. אבות ריאות אלה הובדלו נוספים הפרוקסימלית (דרך נשימה) או דיסטלי (alveolar) לתאי האפיתל ריאות wiה המשיכה תוספת גורם גדילה. 2-ממד אסטרטגיות כאלה היו כמה הצלחה ביצירת תאי אפיתל ריאות, אולם ישנם מספר מגבלות כולל יעילות ברורה, זיהום אפשרי משורות endodermal אחרות, חוסר מבנה 3-ממדי (3D), ובחלק ממקרים להשתמש תרבויות מוגדרות עם תוספת בסרום. תרבות של pluripotent או תאים מובחנים על פיגומי ריאות decellularized משמשת יותר ויותר כמו assay כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות של תאי זרע להרכיב מבני ריאות אפיתל ^3,5,6,8,9. תרבות דוחות כאלה זורעים תאים על פיגומים עם גורם הגדילה המשך או בתוספים בסרום.

פיתוח ריאות כרוכה החלוקה, הגירה, ביטוי גנים והתמיינות של תאים בודדים בתגובה לגירויים סביבתיים. המטריצה ​​הסלולר הנוספת (ECM) היא סריג של גליקופרוטאינים כי בנוסף לספק תמיכה מבנית, מפנה tissuדואר morphogenesis ידי שילוב והסדרת תהליכים אלה ^10,11. באמצעות פיגום ECM הריאות כפלטפורמה טבעית לתרבות endoderm טוב יותר לחקות את המילייה התפתחותי in vivo הריאות, יצרנו תאי גזע אפיתל דרכי נשימת תאים שמקורם בתוך 3D-תרבות מוגדרת הגדרה ביעילות שחזור גבוהות.

פיגומי ECM עכברוש ריאות נוצרו על ידי decellularization וכן עכבר ESC שמקורם בתאי endodermal נוצרו ובהמשך זורעים על פיגומים אלה. ביטוי כפול של CXCR4 & חלבוני c-KIT מסמן זהות תא האנדודרם סופית ותאי חיובי לשני Sox2 & ביטוי NKX2-1 המזוהים דרכי נשימה (ריאות הפרוקסימלי) ובתאים. תאי האנדודרם מכריעים היו בתרבית בשעת ממשק נוזל האוויר (ALI) לתקופה של עד שלושה שבועות כדי לייצר תאי אפיתל דרכי נשימה פונקציונלית במבחנה.

פרוטוקול זה מקדם בידול שושלת ריאות של definiendoderm מופרזת מוקדם ככל 7 ימים, ציין עם הופעתה של NKX2-1 ⁺ / Sox2 ⁺ אבות ריאות הפרוקסימלי מוקדם. במשך היום 14 ו -21 של אוכלוסיות תאי אפיתל דרכי הנשימה בוגרות תרבות לצוץ כולל ריסים (TUBB4A ^+), מועדון (SCGB1A1 ^+), ואת בסיס (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ תאים עם דמיון מורפולוגית ופונקציונלי כדי איירווייז עכבר ילידים. פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של microenvironment 3D-מטריקס להשגת בידול חזק כדי Airway לתאי האפיתל.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים של החולים מכון המחקר לילדים חולים.

1. הכנת פיגום

1. Decellularization של ריאות
   1. להרדים חולדות Wistar מבוגרות באמצעות CO ₂ קאמריים. מניחים חיה בתא ולהתחיל 100% חשיפה CO ₂ בקצב המילוי של 10-30% של נפח תא לדקה.
      1. שים חיה לחוסר הכרה; זה יתרחש לאחר כ 2-3 דקות. אם חוסר הכרה אינה מתרחש בתקופה זו, לבדוק את קצב מילוי ואת החותם קאמרי. בעקבות חוסר הכרה, להתבונן בבעלי חיים עבור צבע עיניים דהויים וחוסר הנשימה. אם הן נצפות, לשמור מילוי CO ₂ למשך 1-2 דקות ולאחר מכן להסיר מן החי קאמרי עבור הליך.
   2. Secure חיה לנתח משטח ידי תיקון קדמי ואת רגליים אחוריות, ולרסס לאורך החזה באזור בטן עם אתנול 70%. גש לב luNGS ידי פתיחת חלל בית החזה באמצעות חתך אנכי לאורך עצם החזה.
   3. ודא חתכים קטנים דרך הסרעפת הראשון לגרום הריאות לחזור בו, ומפחית את הסיכוי ניקוב הריאות. ולקשור את הווריד הנבוב הנח עם תפר ומקום חתך קטן אטריום השמאל במספריים לנתח קטנים.
   4. באמצעות מזרק 10 מ"ל מוכן עם מחט 25 G מלאים תמיסת מלח מאוזנת של heparinized האנק (HBSS) (10 הפרין U / ml ב HBSS), להתחיל זלוף ריאות ידי החדרת מחט לתוך החדר הימני לדחוף למאגר דרך מחזור הדם הריאתי (בשיעור של 2 מ"ל / דקה). המשך הליך זה עד הריאות להלבין והנוזל זורם מן הפרוזדור השמאלי פועל ברור.
   5. בעקבות זלוף, לחשוף את קנה הנשימה cannulate עם קטטר פלסטיק ליד סחוס התריס ומאובטח במקום עם תפר.
   6. הגדרת מערכת זלוף הכבידה על ידי תיקון מזרק 10 מ"ל ל עמדה תשובה ו מהדק. הסר דהבוכנה במזרק iscard. אבטח את נקודת המילוי המרבית על חבית מזרק ב 20 סנטימטרים מעל הריאות. צרף שסתום דו כיווני עד הסוף של המזרק, וכן צינורות פלסטיק ארוך אל הקצה השני של ברזלים לאספקת פתרון decellularization אל קנה הנשימה cannulated. יוצקי פתרון לתוך מזרק ולאפשר פתרון למלא צינורות ו קטטר פלסטיק מצורפים.
      1. שטיפה הריאות על ידי מילוי עד אפס מקום ריאות הכולל (כ -12 מ"ל) עבור 1 דקות ולהסיר את הקטטר פלסטיק מקנה הנשימה כדי לאפשר לנוזל לזרום אל מחוץ לריאות. אין למלא מזרק יותר מ -10 מ"ל כאשר lavaging הריאות כדי לשמור על לחץ מתחת ל -20 ס"מ של H ₂ O.
   7. שטיפה חוזרת של הריאות שמונה פעמים עם פתרון decellularization, ואחריו 10 שטיפות עם בופר פוספט (PBS).
   8. מנתחים את קנה הנשימה והריאות חינם מחלל הצוואר והחזה ולהסיר מן החיה. שמור רקמות בקור PBS ב 4 ° C עד כהכנה vibratome sectioning.
2. דור סעיף עבה
   1. הכן כ 15 מיליליטר של 2% ו -4% (w / v) agarose, ומספיק 6% (w / v) agarose להטבעה כל האונות לגושים מלבניים קטנים. ממיסים אבקת נקודת התכה נמוכה agarose ב PBS על ידי במיקרוגל. מעבירים את agarose 50 מ"ל צינורות על גוש חום ולשמור הטמפרטורה מעל 40 מעלות צלזיוס, כדי למנוע gelling.
   2. לנתח ריאות decellularized בסוף כל הסמפונות אוֹנִי לנתק כל אונה (גולגולתי, באמצע, אבזר, ואת אונות תקינה זנב והאונה השמאלית) באמצעות מספריים קטנים. פט לייבש כל אונה באמצעות יריעות סופגות להסיר PBS העודף ומניח בתוך 2% (w / v) agarose תוך כדי לחסום החימום.
   3. הסר כל אונה לאחר 5 דקות של ציפוי agarose, ומניח בצלחת פטרי לאפשר למשטח ז'ל 1 דק 'על צלחת קרה.
   4. בעדינות במקום אונות בחזרה ל -4% (w / v) agarose, מגניב אחרי 5 דקות, וחזור ציפוי פעם נוספת עם 6% (w / v) agarose.
   5. לאחר שיתוף רציףating של כל אונה, להטביע כל אונה בנפרד 6% (w / v) agarose באמצעות תבניות בסיס מתכת עם לפחות 3 מ"מ של agarose סביב הרקמות מן הקצוות. אוריינט כל אונה באמצעות מלקחיים על ידי צבת הקצה השטוח הגדול האונה על פני השטח של עובש מתכת מול הנסיין. קצה זה יהיה בצד קבוע לצלחת הדגימה עבור חתך vibratome.
   6. אפשר גושי ג'ל על צלחת קרה לפחות 30 דקות לפני חתך עם vibratome. בלוקים חנות בתא humidified עד 12 שעות ב 4 ° C לפני חתך vibratome.
   7. הגדר את vibratome ידי מילוי תא חתך עם קר PBS ^12. לשמור על טמפרטורה קרה לאורך חתך עם אמבט הקרח שמסביב. הסר בלוקים מתבניות מתכת ולהשתמש בסכין גילוח כדי לקצץ agarose עודף סביב אונות, תוך שמירה על כ 3 מ"מ מהקצה של הרקמה.
   8. תקן רקמות במרכז צלחת הדגימה באמצעות דבק, לצלול לתוך צלחת tהוא PBS מלא קאמרי חתך. הגדרת חתך גבולות על vibratome ידי בחירת מהירות, משרעת הבאים, וערכי עובי בהתאמה: 0.2 מ"מ / sec, 1.85 מ"מ, ו -350 מיקרומטר.
      הערה: שני סעיפים אורכים ואת הרוחבי של אורינטצית אונת כשרים.
   9. סעיף כל אונה לחלוטין. ידני לחתוך קטעים בחינם באמצעות מספריים קטנים אם קטע אינו מופרדים באופן מלא על ידי להב בסוף רצף הסעיף. אסוף סעיפי פיגום בעדינות ולשמור ב PBS על קרח עד לשלב הבא.
      הערה: ייתכן שחלקים שנוצרו תכלול הוא הריאה הפרוקסימלי דיסטלי באזורים והמקורות שניהם יכולים לשמש recellularization; עם זאת, רוב השטח יקיפו ריאות דיסטלי.
3. טיהור סעיפי פיגום
   1. מעבירים את 350 מיקרון סעיפים פיגום עבה מ PBS על צינורות microcentrifuge (עד 30 סעיפים / צינור) ולטפל עם nuclease (90 U / ml ב PBS) (ראה רשימה של חומרים) במשך 12 - 24 שעות ב RT, עלהכתף.
   2. בעקבות הטיפול nuclease, סעיפים העברה באמצעות מלקחיים כדי צינורות microcentrifuge חדש ולטפל עם פתרון מיקרוביאלית (200 U / סטרפטומיצין פניצילין מ"ל ו -25 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B ב PBS) בתנאים סטריליים עבור 6 שעות ב RT, על הכתף.
      הערה: ניתן לאחסן פיגומים בתמיסה נגד חיידקים לשימוש עד שבוע ב 4 ° C לפני השימוש.
   3. בעקבות צעד הטיהור עם פתרון מיקרוביאלית, לשטוף פיגומי פעמים עם PBS בתנאים סטריליים ולהעביר סרום תקשורת בידול חינם (SFDM) לפני זריעה עם תאים.

2. תא Endodermal כן

1. Endoderm אינדוקציה Definitive
   1. לשמור על קווי ESC העכבר תחת תרבות חופשית מזין ללא, סרום באמצעות תנאים 2i ^13. התחל אינדוקצית האנדודרם ידי הסרת תאי מתרבות פלוריפוטנטיים חסידות ידי trypsinization.
   2. Resuspend התאים SFDM וזרעי בצפיפות של 20,000תאים / מיליליטר צלחות חסידות נמוכות במשך שלושה ימים ללא שינוי תקשורת כדי לאפשר היווצרות EB.
   3. אחרי שלושה ימים להעביר את EBS בעדינות לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטים בעזרת פיפטה 10 מ"ל ולאפשר להם לאסוף בתחתית 3 דקות ב RT.
   4. בזהירות תקשורת לשאוב ולהוסיף תקשורת SFDM טריה בתוספת 50 א Activin ng / ml
   5. תאי זרע חזרה לצלחות החסיד הנמוכות ביחס של 1: צפיפות 2 והתרבות במשך שלושה ימים נוספים כדי להשיג בידול האנדודרם סופי.
2. עשרת האנדודרם מכריעים
   1. אסוף יום 6 EBS, לנתק עם טריפסין תווית עבור c-kit וביטוי CXCR4 באמצעות נוגדנים ניאון מצומדות ^14.
   2. מיין תאים שכותרתו באמצעות מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) לביטוי של שני הסמנים כדי להשיג אוכלוסייה האנדודרם סופית מועשרת ^15.

3. הגדרת Recellularization

1. ממשק אוויר נוזליהתקנת התרבות
   1. העבר כל סעיף פיגום decellularized (שלב 1.2.9) מ SFDM על קרום צף הידרופובי (8 מיקרומטר גודל נקבובי) באמצעות מלקחיים סטרילית. ודאו סעיפי פיגום מפוזרים באופן שווה על הממברנה.
   2. כן 6- או 12-גם צלחות ידי מילוי בארות עם 1 או 0.5 מיליליטר של SFDM, בהתאמה. בעדינות במקום ממברנות לתוך בארות, המאפשר הממברנה לצוף על גבי מדיה, יצירת התקנת תרבות אוויר נוזלית.
2. זריעה של פיגומי 3D
   1. בעקבות FACS עבור סמנים האנדודרם סופי (שלב 2.2.2) לספור תאים ממוינים באמצעות hemocytometer, ספין למטה ב 400 XG במשך 5 דקות ו resuspend ב SFDM. Resuspend תאים להשיג נפח המכיל כ 100,000 תאים / 10 μl / הפיגום.
   2. כדי recellularize פיגומים, פיפטה 10 μl של תאים ישירות על כל מקטע מוכן משלב 3.1.2.
   3. חלף תקשורת SFDM בתרבויות כל 48 שעות. לשאוב את המדיה הישנה ידי החזיק את הצלחת ב בשיפוע קלכדי למנוע שיבוש התרבות. לאט לאט מוסיף SFDM טרי לתרבות לאורך דופן הבאר כדי למנוע שקיעה של קרום צף.
   4. לשמור על תרבויות נוזלי אוויר לתקופה של עד 21 יום כדי להשיג בידול של תאי זרע כדי epithelia דרכי נשימה הבוגרת.
      הערה: Recellularized ניתן לזהות קטעים מעובדים עבור מכתים רקמות immunofluorescent (IF) מיקרוסקופיה בכל נקודת זמן במהלך תרבית תאים ^16.

תוצאות

כפי שמתואר בפרוטוקול זה, בידול חזק של האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל יכול להיות מושגת באמצעות תרבות המורחבת של תאים שנזרעו על סעיפי decellularized פיגום ריאות. מומלץ פיגומי decellularized להתאפיין על מנת להבטיח (1) תאי מארחים יוסרו לחלוטין, ו (2) חלבונים ת...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מייצר epithelia דרכי נשימת ESC נגזרת בוגר באמצעות פיגומי ריאות טבעיות רק כדי לכוון בידול ללא השלמה אחרת. התקנת תרבות זו מוגדרת, סרום ללא, זול, לשחזור. ללא השלמה גורמת גדילה של תקשורת בידול הבסיס נדרשת. בעבר שיטות שפורסמו להפקת תאי אפיתל ריאות תאים שמקור?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive