Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Zusammenfassung

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Zusammenfassung

Lung lineage Differenzierung erfordert Integration komplexer Umweltreize, die Wachstumsfaktor-Signalgebung umfassen Zell-Zell-Wechselwirkungen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Aufgrund dieser Komplexität ist herausfordernd Rekapitulation der Lungenentwicklung in vitro Differenzierung von Stammzellen zu Lungenepithelzellen zu fördern. In diesem Protokoll werden dezellularisierte Lungengerüste verwendet, um die 3-dimensional Umgebung der Lunge zu imitieren und Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege zu erzeugen. embryonalen Stammzellen der Maus werden zunächst in die endoderm Linie differenziert, um eine Embryoidkörperbildung (EB) Kulturverfahren unter Verwendung von mit Activin A. Endoderm Zellen werden dann auf dezellularisiert Gerüste und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche für bis zu 21 Tage. Diese Technik fördert die Differenzierung von ausgesäten Zellen zu funktionellen Epithelzellen der Atemwege (Zilienzellen, Club-Zellen, und basalen Zellen) ohne zusätzliche Wachstumsfaktor Ergänzung. Diese Kultur Setup definiert ist, serum frei, kostengünstig und reproduzierbar ist. Obwohl es nur begrenzte Kontamination von nicht-Lungen-endoderm Abstammungslinien in Kultur ist, erzeugt dieses Protokoll nur epithelialen Populationen Atemwegs und führt nicht zu Alveolarepithelzellen geben. Airway Epithelien mit diesem Protokoll erzeugt wird, kann verwendet werden, Zell-Matrix-Interaktionen während Lunge Organogenese und für Krankheitsmodelle oder Drogen-Entdeckung Plattformen der Atemwegsbedingten Krankheiten wie Mukoviszidose zu studieren.

Einleitung

Regie Differenzierung von pluripotenten Zellen in die Lunge Linie ist abhängig von präzisen Signalereignisse in der Mikroumgebung ^1,2. Aufgrund der dynamischen Natur dieses Prozesses schwierig es ist , die genauen Vorgänge von Lungen Organogenese in vitro nachzuahmen. Jüngste Berichte haben schrittweise lineage Beschränkungsstrategien mit löslichen Wachstumsfaktor Supplementierung von zweidimensionalen Kulturen verwendet , um Lungendifferenzierung ^3-8 erzielen. In schrittweise Differenzierung Protokolle, pluripotente Zellen, ob embryonale Stammzellen (ESC) oder induzierte pluripotente Stammzellen wurden zuerst auf die endgültige Endoderm Keimschicht unterschieden. Endodermalen Zellen wurden anschließend in einer anterioren Endoderm Schicksal geschoben und danach Lungen Progenitorzellen, wie durch die Expression von homeodomain enthaltenden Transkriptionsfaktor NKX2-1 identifiziert. Diese Lungen Vorläufern wurden weiter nach proximal differenzierten (Atemweg) oder distalen (alveolären) Lungenepithelzellen with weiterhin Wachstumsfaktor Ergänzung. Solchen 2-dimensional Strategien gewissen Erfolg gehabt haben Lungenepithelzellen bei der Erzeugung sind jedoch mehrere Einschränkungen, einschließlich unklar Wirkungsgrade, eine mögliche Kontamination von anderen endodermalen Abstammungslinien, das Fehlen eines 3-dimensionalen (3D) Struktur, und in einigen Fällen verwenden undefinierter Kulturen mit Serumergänzung. Kultur pluripotenter oder differenzierten Zellen auf dezellularisierten Lungengerüste wird zunehmend als ein Assay verwendet , um das Regenerationspotential gesäten Zellen in Bilden Lungenepithelzellen Strukturen ^3,5,6,8,9 zu beurteilen. Solche Berichte Kulturzellen auf Gerüsten mit anhaltendem Wachstumsfaktor oder Serum-Supplementierung ausgesät.

Lungenentwicklung beinhaltet die Division, die Migration, die Genexpression und Differenzierung von einzelnen Zellen als Reaktion auf Umweltreize. Die extrazelluläre Matrix (ECM) ein Gitterwerk von Glykoproteinen, die zusätzlich zur strukturellen Unterstützung, lenkt tissue Morphogenese durch die Integration und diese Prozesse ^10,11 regulieren. Durch die Verwendung von Kultur die Lunge ECM Gerüst als natürliche Plattform für Endoderm um besser auf die in vivo - Lungenentwicklungs milieu nachahmen, haben wir Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege in einem definierten 3D-Kultur erzeugt mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit einstellen.

Rattenlunge ECM Gerüste wurden von Dezellularisierung erzeugt sowie Maus ESC-derived Entodermzellen wurden erzeugt und anschließend ausgesät auf diese Gerüste. Dual-Expression von CXCR4 und c-KIT-Proteine ​​zeigt eine definitive endoderm Zellidentität und Zellen, die positiv für beide SOX2 & NKX2-1 Ausdruck als Atemweg (proximal Lunge) Vorläuferzellen identifiziert. Definitive Entodermzellen wurden bei Luft Flüssigkeit - Grenzfläche (ALI) für bis zu drei Wochen funktionelle Epithelzellen der Atemwege in vitro zu erzeugen.

Dieses Protokoll fördert Lungen lineage Differenzierung von definitive endoderm so früh wie 7 Tage mit der Entstehung von NKX2-1 beobachtet ⁺ / SOX2 ⁺ frühen proximalen Lungen Vorläufern. Am Tag 14 und 21 der Kultur reifen Atemwegsepithelzellen Zellpopulationen emerge einschließlich bewimpert (TUBB4A ^+), Club (SCGB1A1 ⁺⁾ und basalen (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ Zellen mit morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit nativem Maus Atemwege. Dieses Protokoll zeigt die Bedeutung der 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Erzielung robust Differenzierung Epithelzellen Atemwege.

Protokoll

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Animal Care Committee Richtlinien des Hospital for Sick Children Research Institute durchgeführt.

1. Scaffold Vorbereitung

1. Dezellularisierung der Lunge
   1. Euthanize erwachsenen Wistar - Ratten mit CO ₂ Kammer. Platzieren Tier in der Kammer und starten 100% CO ₂ Exposition bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute.
      1. Beobachten Tier für Bewusstlosigkeit; Dies wird nach ca. 2-3 min auftreten. Wenn Bewusstlosigkeit in dieser Zeit nicht auftritt, überprüfen Rate und Kammerdichtung zu füllen. Nach Bewusstlosigkeit, beobachten Tier für verblasste Augenfarbe und mangelnde Atmung. Wenn beide beobachtet werden, halten CO ₂ Füllung für 1-2 min und dann Tier für das Verfahren aus der Kammer zu entfernen.
   2. Sichere Tier Oberfläche Sezieren von forepaws und Hinterbeine Fixierung und sprühen Sie die Brust und Bauchbereich mit 70% Ethanol. Besuchen Sie das Herz und die luNGS durch die Brusthöhle mit einem vertikalen Schnitt entlang des Brustbeins zu öffnen.
   3. Machen Sie zuerst kleine Schnitte durch Zwerchfell die Lunge verursachen zurückzuziehen, wodurch die Chance auf die Lunge Punktierung. Ligieren die untere Hohlvene mit einer Naht und legen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Vorhof mit kleinen Dissektionsscheren.
   4. Verwendung einer vorbereiteten 10 ml-Spritze mit einer Nadel 25 G gefüllt mit heparinisierter Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) (10 U / ml Heparin in HBSS), Lungenperfusion starten, indem die Nadel in den rechten Ventrikel Einführen des Puffers durch den Lungenkreislauf zu drücken, (Rate von 2 ml / min). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Lungen weiß und die Flüssigkeit aus dem linken Vorhof fließt klar ist.
   5. Im Anschluss an die Perfusion, setzen die Trachea und kanülieren mit einem Kunststoff-Katheter in der Nähe des Schildknorpels und befestigen Sie sie mit einer Naht.
   6. Richten Sie eine Schwere Perfusionssystem durch einen 10-ml-Spritze an ein Stativ und Klemmbefestigung. Entfernen und discard Spritzenkolben. Sichern Sie die maximale Füllung Punkt auf Spritzenzylinder bei 20 cm über der Lunge. Befestigen einen Zweiwegehahn bis zum Ende der Spritze, und einem langen Kunststoffschlauch mit dem anderen Ende des Absperrventils zur Dezellularisierung Lösung des kanülierten Trachea zu liefern. Gießen Lösung in die Spritze und lassen Lösung beigelegten Kunststoffschlauch und Katheter zu füllen.
      1. Lavage die Lunge durch bis zur Gesamtlungenkapazität Füllung (ca. 12 ml) für 1 min und entfernen Sie die Kunststoff-Katheter aus der Trachea der Flüssigkeit zu ermöglichen, aus der Lunge fließen zu lassen. Nicht Spritze mehr als 10 ml füllen , wenn die Lunge lavaging Druck zu halten , unter 20 cm H ₂ O
   7. Wiederholen Lavage von Lungen achtmal mit Dezellularisierungslösung, gefolgt von 10 Spülungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   8. Präparieren Sie die Luftröhre und Lunge frei von Hals und Brusthöhle, und entfernen Sie aus dem Tier. Halten Gewebe in kaltem PBS bei 4 ° C bis zur Vorbereitung für Vibratom sectioning.
2. Thick Abschnitt Generation
   1. Bereiten ca. 15 ml 2% und 4% (w / v) Agarose und genug 6% (w / v) Agarose für alle Ausbuchtungen in kleine rechteckige Blöcke eingebettet werden. Löse mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Pulver in PBS durch Erhitzen in der Mikrowelle. Übertragen, um die Agarose zu 50 ml Röhrchen auf einem Heizblock und aufrechtzuerhalten Temperatur über 40 ° C ein Gelieren zu vermeiden.
   2. Präparieren dezellularisierter Lunge am Ende jedes lobar Bronchus jeder Lappen (Schädel-, Mitte, Zubehör und Schwanz rechten Lappen und der linke Lappen) mit einer kleinen Schere zu lösen. Pat trocknen jeder Lappen Absorptionslagen unter Verwendung von überschüssigem PBS zu entfernen und innerhalb 2% (w / v) Agarose, während auf dem Heizblock schalten.
   3. Entfernen Sie jede Lappen nach 5 min von Beschichtung in Agarose, in einer Petrischale und lassen Sie die Oberfläche für 1 min auf eine kalte Platte zu gelieren.
   4. Sanft Lappen in 4% Platz zurück (w / v) Agarose, cool nach 5 min und Beschichtung wiederholen noch einmal mit dem 6% (w / v) Agarose.
   5. Nach aufeinanderfolgenden Cotriebs jedes Lappens, einzubetten jeder Lappen separat in 6% (w / v) Agarose unter Verwendung von Metallgrundformen mit zumindest 3 mm aus Agarose, das Gewebe von den Kanten umgeben. Orient jeder Lappen mit einer Pinzette durch die größte flache Kante des Lappens Positionierung an der Oberfläche der Metallform der Experimentator gegenüber. Diese Kante wird die Seite für Vibratom Schnitte zur Probenplatte befestigt sein.
   6. Lassen Sie Blöcke für mindestens 30 min auf kalte Platte zu gelieren, bevor sie mit Vibratom dem Schneiden. Store Blöcke in einer befeuchteten Kammer für bis zu 12 Stunden bei 4 ° C vor sectioning zu Vibratom.
   7. Richten Sie die Vibratom durch die Schneidekammer mit kaltem PBS ¹² zu füllen. Pflegen kalten Temperaturen mit dem umgebenden Eisbad ganzen sectioning. Entfernen Sie Blöcke aus Metallformen und die Verwendung einer Rasierklinge überschüssige Agarose umgebende Lappen zu trimmen, während etwa 3 mm vom Rand des Gewebes zu halten.
   8. Fix Gewebe in die Mitte der Probenplatte Kleber und versenken Platte in ter PBS gefüllten Schneideraum. Setup-sectioning Grenzen auf Vibratom indem Sie die folgenden Geschwindigkeit, Amplitude und Dickenwerte jeweils: 0,2 mm / sec, 1,85 mm, und 350 & mgr; m.
      Hinweis: Die beiden Längs- und Querschnitte des Lappens Orientierung akzeptabel sind.
   9. Abschnitt jeder Lappen vollständig. Manuell geschnittenen Abschnitte kleine Schere kostenlos mit, wenn ein Abschnitt nicht vollständig durch das Blatt am Ende des Abschnitts Sequenz getrennt ist. Sammeln Sie Gerüstabschnitte sanft und halten in PBS auf Eis bis zum nächsten Schritt.
      Hinweis: generierte Abschnitte wird sowohl die proximalen und distalen Lungenbereiche und beide Quellen können für Rezellularisierung verwendet werden; Allerdings werden die meisten von der Oberfläche distal Lunge umfassen.
3. Dekontamination von Gerüstteile
   1. Übertragen Sie die 350 Mikrometer dicke Gerüstabschnitte von PBS zu Mikrozentrifugenröhrchen (bis zu 30 Abschnitte / Röhrchen) und Behandlung mit Nuklease (90 U / ml in PBS) (siehe Liste der Materialien) für 12 bis 24 h bei RT, aufeinen Rotator.
   2. Folgende Nuclease-Behandlung, Übertragungsabschnitte Pinzetten in neue Mikrozentrifugenröhrchen und behandle mit antimikrobielle Lösung (200 U / ml Penicillin-Streptomycin und 25 & mgr; g / ml Amphotericin B in PBS) unter sterilen Bedingungen für 6 h bei RT, auf einem Rotator verwenden.
      Hinweis: Scaffolds kann vor der Verwendung bei 4 ° C für bis zu einer Woche in antimikrobiellen Lösung gelagert werden.
   3. Im Anschluss an die Dekontaminationsschritt mit antimikrobiellen Lösung gründlich Gerüste zweimal mit PBS unter sterilen Bedingungen und Transfer zum freien Differenzierung Medien (SFDM) vor dem Impfen mit Zellen Serum.

2. Endodermal Zellpräparation

1. Definitive Endoderm Induction
   1. Pflegen Maus ESC Linien unter Feeder frei, Serum freie Kultur mit 2i Bedingungen ^13. Starten Sie endoderm Induktion von Zellen aus adhärenten pluripotenten Kultur durch Trypsinisierung entfernt.
   2. Die Zellen in SFDM und Samen bei einer Dichte von 20.000Zellen / ml in niedrig anhaftende Platten für drei Tage ohne Medienwechsel für EB Bildung zu ermöglichen.
   3. Nach drei Tagen sanft die EBs in 50 ml konische Röhrchen übertragen Sie eine 10 ml-Pipette und lassen Sie sie für 3 min bei RT am Boden zu sammeln.
   4. Sorgfältig absaugen Medien und frische SFDM Medien hinzufügen, mit 50 ng / ml Activin A. ergänzt
   5. Samenzellen wieder auf den niedrigen anhaftenden Platten bei einer 1: 2-Dichte und die Kultur für drei weitere Tage definitive Endoderm Differenzierung zu erreichen.
2. Definitive endoderm Anreicherung
   1. Sammeln Tag 6 EBs, distanziere mit Trypsin und beschriften für c-KIT und CXCR4 - Expression konjugierten fluoreszierenden Antikörpern ¹⁴ verwendet wird .
   2. Sortier markierten Zellen fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zur Expression beider Marker unter Verwendung von ¹⁵ eine angereicherte Population definitive Endoderm zu erhalten.

3. Rezellularisierung-Setup

1. Luft-Flüssigkeits-GrenzflächeKultur-Setup
   1. Übertragen jedes dezellularisierter Gerüstabschnitt (Schritt 1.2.9) von SFDM auf eine hydrophobe schwebenden Membran (8 & mgr; m Porengröße) mit einer sterilen Pinzette. Stellen Sie sicher, Gerüstteile sind gleichmäßig auf der Membran verteilt.
   2. Bereiten 6- oder 12-Well-Platten mit Vertiefungen mit 1 oder 0,5 ml SFDM bzw. Füllung. Sanft legen Sie Membranen in die Vertiefungen, so dass die Membran auf der Oberseite der Medien zu schweben, eine Luft-Flüssigkeit-Kultur Einrichtung zu schaffen.
2. Seeding von 3D-Gerüste
   1. Nach FACS für die endgültige Endoderm Marker (Schritt 2.2.2) sortierten Zellen zählen ein Hämozytometer, Spin-down bei 400 xg für 5 min und resuspendieren in SFDM verwenden. Die Zellen mit einem Volumen, das etwa 100.000 Zellen / 10 & mgr; l / Gerüst zu erhalten.
   2. Um recellularize Gerüste, Pipette 10 ul Zellen direkt auf jedem vorbereiteten Abschnitt aus Schritt 3.1.2.
   3. Ersetzen SFDM Medien in Kulturen alle 48 Stunden. Absaugen die alten Medien durch die Platte mit einem leichten Gefälle hältAufbrechen der Kultur zu vermeiden. Langsam frische SFDM zu Kultur entlang der Seite des Brunnenbau von schwimmenden Membran zu verhindern.
   4. Pflegen Luft-Flüssigkulturen für bis zu 21 Tage Differenzierung von ausgesäten Zellen in zu reifen Atemwegsepithelien zu erreichen.
      Hinweis: rezellularisiertes Abschnitte können zur Gewebefärbung und Immunofluoreszenz (IF) Mikroskopie zu jedem Zeitpunkt während der Zellkultur ¹⁶ verarbeitet werden.

Ergebnisse

Wie in diesem Protokoll skizzierten robust Differenzierung definitive Endoderm zu reifen Atemwegsepithelzellen unter Verwendung von erweiterten Kultur beimpft Zellen auf dezellularisierten Gerüsts Lungenabschnitte erreicht werden kann. Es wird empfohlen, dezellularisierte Gerüste (1) Wirtszellen vollständig entfernt, um sicherzustellen, charakterisiert sind, und (2) extrazelluläre Matrix-Proteine ​​werden vor der Verwendung von Gerüsten für die Differenzierung erhalten. Dezellu...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll erzeugt reifen ESC-derived Atemwegsepithelien nur natürliche Lungengerüste mit Differenzierung keine andere Ergänzung zu lenken. Diese Kultur Aufbau ist, serumfrei, kostengünstig und reproduzierbar definiert ist. Keine Wachstumsfaktor Ergänzung der Basis Differenzierung Medien erforderlich ist. Vorveröffentlichten Verfahren zur Erzeugung von Stammzellen abgeleiteten Lungenepithelzellen haben 2-dimensionale Strategien mit Wachstumsfaktor - Supplementierung verwendet ^{3,4,8,18,19<...}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive