Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

Özet

Endokrin Bozucu Bileşikler (EDC) Akuatik çevre için önemli bir risk oluşturmaktadır. Belediye atıksu arıtma tesisleri yüzey sularının östrojenik etki gücüne önemli katkıda bulunmaktadır. Bu yazıda verilen metodoloji EDC kaldırılması ile ilgili etkinlik ve atıksu arıtma süreçlerinin uygunluğunun değerlendirilmesi için izin verir.

Özet

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

Giriş

Yaban hayatı üreme sağlığı konusunda endokrin bozan bileşiklerinin olumsuz etkileri ile ilgili endişeler Su Çerçeve Direktifi (SÇD) altında "watch list" iki östrojenik maddeler (östradiol ve etinilestradiol) yerleştirmek için Avrupa Birliği'ne yol açmıştır. EDC doğal ve sentetik steroid östrojenler, uyuşturucu, böcek ilaçları ve endüstriyel kimyasallar ve yaban hayatı üzerinde bilinen olumsuz etkileri ile tüketici ürünlerinin bileşenleri de dahil olmak üzere kimyasal sınıfların, çeşitli kapsamaktadır. Bu bileşiklerin bazıları, potansiyel olarak insan sağlığını ¹ etkileyebilir.

Araştırma AAT gelen çıkış maddeleri halinde ² balık östrojenik olduğunu göstermiştir ve bir sonucu olarak, birçok alıcı suların balık ³ östrojenik bulunmaktadır. Bu, ilk yabani erkek balıkların kanı ve yüksek öncesi (kadın özel sarısı protein habercisi ⁴⁾ artarak vitellogeninin konsantrasyonlarını gösterdi Birleşik Krallık ulusal anketler aracılığıyla gösterilmiştirdeğerlik interseks normalde gonochoristic balık türlerinin ^5,6 (erkek balık testislerde yumurta ve / veya kadın üreme kanalları geliştirerek).

Geleneksel atık su arıtma tipik haliyle çözündürüldü ve organik madde atılır ve birincil ve ikincil muamele edilir, bir ön tarama oluşan üç aşamalı bir işlemdir. Bireysel EDC çıkarılması etkinliği maddelerin fiziko-kimyasal özelliklerine ve uygulanan muamele işleminin etkililiğinin bağlıdır. adsorpsiyon ve biyolojik bozulma yoluyla birçok EDC çıkarılması için önemli ama eksik olabilir. Üçüncül arıtma, kum filtrasyonu gibi (örneğin ozon için) ileri oksidasyon kullanarak gelişmiş tedavi ise EDC kaldırılmasını ⁷ arttırılmasında etkili olabilir ya da aktif karbon komple kaldırma ⁷ yakın ulaşmada etkili olabilir.

Atıksu arıtma nee için herhangi bir yeni teknoloji değerlendirmesiDS EDC çıkarılması önerilen işlemin etkinliğini belirlemek için. Hedeflenen kimyasal ekotoksikolojisi test birlikte analiz, in vivo ve in vitro biyo-deneylerde kullanılarak dahil testlerin, bir pil, bu amaç için kapsamlı bir veri sağlar. düzenleyici amaçlar için çok yararlı olmasına rağmen, hedeflenen kimyasal analiz sadece izlenir bileşikler (ve spesifik metabolitler) hakkında veri sağlayabilir. Biyolojik tayinler ayrıca aksi halde ^8,9 tespit edilmemiş olacaktır yan ürünleri metabolitleri ve tedavi oluşturulan atık su dönüşümün olumsuz etkileri "algılama" izin verir. Bu yazıda ham östrojenik etkiye ve tedavi kanalizasyon kaldırılması ve alıcı su ortamlarında gelişmiş ve gelişmekte olan atıksu arıtma süreçlerinin bir dizi etkinliğini değerlendirmek için kimyasal ve ekotoksisitesi laboratuvar deneyleri bir pil kullanımını açıklamaktadır.

Protokol

Etik bildirimi: balık kimyasallar / karışımların aktivitesini bozarak endokrin değerlendirmek için protokoller Brunel University Londra'nın Hayvan Refahı tarafından tescil edildi Hayvanlar altında Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986.

1. Su Numune Toplama, Muhafaza ve Ekstraksiyon

1. Örnek toplama ve koruma
   1. uygun bir yüzey aktif temizleme maddesi ile şişe kullanmak temizlemek için önce. Temizlikten sonra, su, drenaj ve kuru şişeleri durulayın.
   2. bakır (II) nitrat 0.5 g, 6 ml 3.6 M hidroklorik asit çözeltisi arasında oluşan bir koruyucu ihtiva eden 2-L kapasiteli cam şişe örnekleri toplamak. 10 ° C altında muhafaza örnekleri. Özü ve olası aşağıdaki toplama ve korunması en kısa sürede analiz.
2. Örnek çıkarma ve (steroid östrojen analizi için) temizlik ¹⁰
   1. Katı Faz Ekstraksiyon (SPE)
      1. ekstraksiyon öncesinde, 1 mikron gözenek boyutu filtre kağıdı kullanılarak askıda katı madde, filtre su numuneleri azaltmak için.
         1. _2,4,16,16-d4 -17β-östradiol (E2): Bir kere d 2,4,16,16 ₄ -estron içeren döteryumlu iç standart stok solüsyonu spike 100 ul ekleyerek iç standart ile, başak örnekleri süzülmüş : ve _2,4,16,16-d4 -17α-etinilestradiol (EE2) (40 ug metanol / L) 1000 mi çıkışındaki (ya da 100 mi akan) kanalizasyon 2 ng / L iç başak sonuçlanan atık numuneleri ve kanalizasyon içeri giren örnekleri için 20 ng / L.
      2. SPE aparatına atılabilir valf gömlekleri, stiren divinil benzen SPE kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. ekipmanı test etmek için vakum pompası açın yeterince mühürlenir.
      3. Pipet Her hazne içine etil asetat 5 ml kartuş koşulu. Vakum pompası (10 inHg dakikada en az 10 ml'lik bir akış oranı izin vermek için, aşağıda) geçişve sıvı üzerinden çekin. SPE kartuşları kurumasına izin vermeyin. 5 ml su ve ardından, 5 ml metanol ile tekrarlayın.
      4. su ile her bir kartuş haznesi doldurun ve kartuş rezervuar ve cam numune şişeler arasındaki 1/8 "PTFE tüpleri bağlamak. dakikada en az 10 ml'lik bir akış hızında vakum açma ve bütün örnek kartuşu içinden geçmesine izin verir. atık şişesi olarak gerekli boşaltın.
      5. İyice (örneğin, koyu kahverengiden açık kahverengi) rengini değiştirmek vakum altında kartuş içeriğinin kadar (hava veya nitrojen kullanarak veya) SPE kartuşları kurutun.
      6. Ekstraksiyon manifoldu içindeki raf ve yerine temiz, kuru 10 ml'lik cam toplama şişeleri koyun. Her astar bir şişeye üstünde olduğundan emin olun. Pipet 8 vakum pompası (dakika başına yaklaşık 10 ml akış oranı) ile ilgili her bir örnek rezervuara diklorometan anahtarın ml toplanmasını şişelere sıvı çekin.
      7. SPE manifoldundan 10 ml flakon kaldır1 ml hacim azaltmak için yoğunlaştırıcı kullanın. oto-ömekleyici şişesine her bir örnek aktarın ve daha fazla azot blöf ekipmanı kullanılarak 100 ul için konsantre edilir.
   2. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) temizleme
      1. . Tablo 1'de tarif edilen koşullar kullanılarak GPC donanımlı HPLC içine akıtılan örnek ekstresinin 95 ul enjekte GPC bir yoğunlaştırıcı ve azot aparatı aşağı darbe ve ardından hekzan ile 2.0 ml makyaj kullanarak 200 ul aşağı ayıklamak Konsantre.
   3. SPE temizlik
      1. SPE manifolduna atılabilir valf gömlekleri, aminopropil kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. Ekstraksiyon manifoldu içindeki raf ve yerine temiz, kuru 10 ml'lik cam toplama şişeleri koyun. Pipet Her hazne içine heksan 2 mi, kartuş koşulu. Sıvı kartuşları geçmesine izin verin.
      2. rezervuar içine GPC örnek özü Pipet ve tekrar sıvı izinKartuşun içinden geçmektedir. flakon örnek eluat toplayın ve manifold kaldırmak. eluat atmayın.
      3. rafın içine yeni bir temiz kuru 10 ml toplama flakon koyun ve çıkarma manifoldu içine yerleştirin. Kartuşu yıkama haznesine heksan (% 30 h / h) etil asetat 2 ml ilave edilir ve kartuşu içinden sıvı çekin. Tüm yıkama atarak, heksan etil asetat bir başka 2 ml ile tekrarlayın.
      4. geri çıkarma manifoldu içindeki rafa orijinal 10 ml toplama flakon (adım 1.2.3.2) yerleştirin. Pipet aseton, etil asetat 'ın 2 ml (% 50 h / h), rezervuar içine, vakum pompası üzerinde anahtarı ve şişenin içine sıvı haldeki çekme (2 inHg dakikada en az 2 ml' lik bir akış hızı sağlamak için, aşağıda) . etil asetat başka bir 2 ml işlemi tekrarlayın.
      5. Numune şişe çıkarın ve 1 ml özü hacmini azaltmak için bir yoğunlaştırıcı kullanın. t buharlaşmasına, ekipman aşağı darbe daha küçük bir cam şişenin içine örnek aktarmak ve azot kullanımıO yeni başlayan kuruyana kadar ayıklayın.
      6. metanol, 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. (0.3 mi insert ile) bir otomatik ömekleyici şişesine özü aktarın ve şişe kapağı. LCMS / MS kullanılarak numunelerin analiz (bakınız bölüm 2).

Kolon:	PL jel, 50 A, 300 x 7.5 mm, 5 um
Guard Kolon:	PL jel, 50 x 7,5 mm, 5 um
Mobil aşama:	diklorometan
Akış hızı:	ve dakika başına 1 mi
Kolon sıcaklığı:	25 ° C
UV detektörü:	210 nm
Enjeksiyon hacmi:	95 ul
Enjeksiyon modu:	durmakard
Çekme hızı:	dakika başına 500 mi
Hız Çıkar:	dakika başına 500 mi
Pozisyon çizmek:	3mm
Fraksiyon toplanır:	3 mi fraksiyon (7-10 dk), 10 ml şişelerde

Tablo 1. ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile ekstre atık su örneklerinin temizlenmesi için parametreleri. Tablo GPC sütunu, mobil faz, sıcaklık, enjeksiyon hacmi, ve detektör dalga boyu detayları.

3. (Maya Östrojen Ekranı için) örnek çıkarma
   1. bölüm 1.2.1.1 olarak detaylı filtre örnekleri. SPE aparatına atılabilir valf gömlekleri, C18 SPE kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. ekipmanı test etmek için vakum pompası açın yeterince mühürlenir.
   2. Her hazne içine pipetle 5 ml metanol, C koşullandırılması için18 kartuşları. 1 dak yarım için duraklatma (dakika başına 5 ml'lik bir akış sağlamak için yaklaşık 5 inHg kadar) ve içinden sıvı çalışmasına izin vakum açın. kartuşları kuru çalışmasına izin vermeyin. HPLC notu veya çift distile su ile ya işlemi tekrarlayın (GKD ₂ O). Yine kuru çalıştırmayın.
   3. bölüm 1.2.1.4 açıklandığı gibi su numuneleri ayıklayın. İyice kartuşları kuru için en az 30 dakika boyunca vakum devam edin.
   4. Ekstraksiyon manifoldunda bir rafa temiz, kuru 10 ml toplama şişeleri yerleştirin. Her astar bir şişeye üstünde olduğundan emin olun. Her bir hazneye 5 ml metanol ekleyin. Vakum (5 ml / dak maksimum debi) açın ve sıvı yoluyla 2 dakika yarım için duraklatma, bir şişenin içine kartuşun geçmesine izin verir.
   5. Önceki EVET ekranını kullanarak analiz, azot kullanılarak başlangıç ​​kuruyana kadar özü azaltmak ve 500-1,000 ul etanol ile sulandırın. buharlaşmasını önlemek için numune şişeleri kapakları Seal ve (4 ° C'de tutmak bir kıvılcım ücretsizbuzdolabı).

LCMS / MS Kullanma 2. Kimyasal Analiz

1. Üreticinin talimatlarını kullanarak LCMS / MS sisteminin çalışma koşullarını optimize edin.
2. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi koşulları kullanılarak kalibrasyon standart çözümler, örnek özleri, boş ve analitik kalite kontrol (AQC) numunelerin analiz ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak iyon geçişleri izlemek. İç kullanarak örnek özü steroid östrojenlerin konsantrasyonunu belirleyin standartlar ^10.

LCMS
Sıvı Kromatografisi
Kolon:	C18 (2) 150 x 4.6 mm, 5 um.
Enjeksiyon hacmi:	20 ul
debi:	dakikada 0.5 mi.
MObile aşaması:	Çözücü A:% 0.1 amonyak içeren su.
	Çözücü B: asetonitril.
Gradyan programı:
Süresi (dak)	0	10	18	24	28
A: B çözücü oranı	90:10:00	50:50:00	0.479167	0.479167	90:10:00
Kütle spektrometrisi
Kaynak:	Elektrosprey (negatif iyon)
Gaz ve kaynak:	KKO: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi
	TEM: 600 ° C, CAD gazı, 5 ve IonSpray gerilimi -900
MRM geçişleri:
E1:		269/145 ve 269/143
E2:		271/145 ve 271/143
EE2:		295/145 ve 295/143
E1-D4:		273/147
E2-D4:		275/147
EE2-D4:		299/145

Tablo 2. Ayrıntılar parametreleri ve atık su özleri steroid estrojenlerin LCMS / MS analizi için koşullar. Tablo hızı, mobil faz koşulları örnek enjeksiyon hacmi verir ve akışnd degrade.

Vitro Maya Östrojen Ekranda Kullanılması 3. östrojenik aktivite (EVET) Tahlili ⁸

1. Hazırlayın ve (a) ve (g) Tablo 3 gereğince asgari orta ve orta bileşenlerini saklayın.

(a) En az Orta (pH 7.1):

Fe 2 (SO4), iki kez damıtılmış su 3-50 ml (GKD 2 O), 40 mg ekleyerek Fe 2 (SO4) 3 solüsyonu hazırlayın

Ekle 1 L GKD 2 O 2 L'lik bir cam behere

behere aşağıdaki bileşenleri ekleyin:

13.61 gr KH 2 PO 4

1.98 g (NH4) 2 SO4

4.2 g KOH

0.2 gr MgSO 4

Fe 2 (SO 4) 1 ml 3 çözüm

50 mg L-lösin

50 mg L-histidin

50 mg adenin

20 mg L-arginin-HCl

20 mg L-metionin

30 mg L-tirosin

30 mg L-izolösin

30 mg L-lisin-HCl

25 mg L-fenilalanin

100 mg L-glutamik asit

150 mg L-valin

375 mg L-serin

manyetik bir pire ile ısıtılan karıştırıcı Beher koymak ve tüm çözülene kadar karıştırın

pH 7.1 olduğunu kontrol edin ve gerekirse ayarlayın

50 ml'lik steril bir şırınga metal vida En kapaklı cam şişelere 45 ml lik kısımlar halinde tevzi kullanılması

bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de minimal ortam sterilize

oda sıcaklığında saklayın

(b) D - (+) - glikoz:

GKD 2 O% 20 ağırlık / hacim solüsyonu hazırlayın

metal vida üst kapaklı cam şişe için 20 ml alikotları dağıtın

bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C de glukoz çözeltisi sterilize

oda sıcaklığında saklayın

(c) L-aspartik asit:

GKD 2 O 4 mg / ml stok çözeltisi oluşturunuz

metal vida üst kapaklı cam şişe için 20 ml alikotları dağıtın

bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de, L-Aspartik asit çözeltisi sterilize

oda sıcaklığında saklayın

(d) Vitamin Çözüm:

GKD 2 O 100 ml biyotin 2 mg eklenerek bir biyotin çözeltisi hazırlayın

8 mg tiamin, 8 mg piridoksin, 8 mg pantotenik asit, 40 mg inositol tartılır. 180 mi GKD 2 O tüm kuru bileşenleri ve biyotin çözeltisi 20 ml ekleyin

levhalı bir hava akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu atılabilir filtre içinden filtre edilerek, 10 ml steril alikotları yapmak

Mağaza 4 ° C

(e) L-treonin:

GKD 2 O 24 mg / ml L-treonin 100 ml hazırlanması

metal vida üst kapaklı cam şişe için 10 ml alikotları dağıtın

bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de, L-treonin solüsyonu sterilize

oda sıcaklığında saklayın

(f) bakır (II) sülfat:

GKD 2 O 20 mm bakır (II) sülfat çözeltisi 25 ml hazırlamak

Laminer akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilerek, 5 ml steril alikotları yapmak

oda sıcaklığında saklayın

(g) Klorofenol Kırmızı-β-D-galaktopiranosid (CPRG):

GKD 2 O CPRG bir 10 mg / ml çözeltisinin 25 ml hazırlamak

Laminer akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilerek, 5 ml steril alikotları yapmak

Mağaza 4 ° C

Tablo 3. Maya Estrojen Ekran deneyi; hazırlanması ve minimal ortam ve orta bileşenlerinin depolanması.

2. Hazırlık ve stora10x konsantre maya kültürü ge
   1. 1. gün, büyüme ortamı hazırlamak (3.4.1 ayrıntılı olarak) ve steril bir erlene dökün. -20 ° C'de saklandı kriyojenik şişeden 10x konsantre edildi maya 125 ul ekle. orbital bir karıştırıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de kuluçkaya ortamı inkübe edin.
   2. 2. günde, büyüme ortamı (~ 50 mi) iki şişe olmak ve ayrı steril konik şişeler içine dökün. Büyüme ortamı, her şişeye 24 saat kültürlendi maya 1 ml ilave edilir. orbital bir karıştırıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de kuluçkaya ortamı inkübe edin.
   3. 3. günde, steril bir 50 ml santrifüj tüpüne her 24 saatlik kültür dökün. 2,000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje 50 mi borular. Süpernatantı dökün ve% 15 gliserol ile minimal ortamda 5 ml her bir pelet yeniden askıya. 4 aylık bir süre için -20 ° C'de steril cryovials ve mağaza 1.2 ml 10x konsantre edilmiş maya kültürü 0.5 ml'lik alikotları sağlayın.
3. PrepaStandart eğriler için rasyon ve depolama kimyasal stoklarının
   1. mutlak etanol ile iki kez tüm cam ve spatula durulayın ve kirlenmektedir herhangi izlerini kaldırmak için kullanılmadan önce kurumaya bırakın.
   2. toz ağırlığındaki kabininde bir cam şişenin içine doğrudan E2 tartılır ve mutlak etanol içinde hacimce konsantrasyonunu ayarlamak. 2x10 ^-7 M (54.48 ug / L) bir konsantrasyona seyreltilir. Mühür kapak ve mağaza 4 ° C'de (bir kıvılcım serbest buzdolabında).
4. tahlil yapımcı
   1. 0. günde, büyüme ortamı hazırlar. minimal ortamda 45 ml şişe için 5 ml glükoz solüsyonu, 1.25 mi, L-aspartik asit çözeltisi, 0.5 mL vitamin çözeltisi, 0.4 mi, L-treonin çözeltisi ve 125 ul bakır (II) sülfat çözeltisi ilave edin. steril erlene büyüme ortamı dökün.
      1. şişeye (-20 ° C depolama çözüldü) 10x konsantre edilmiş stok 125 ul ilave edin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de İnoküle ortamı inkübe edin.
   2. 1. gün, steril 96-iyi 'seyreltme plaka' etiketlemek ve E2 standart eğrinin ve test kimyasal (lar) / çıkış ekstraktı (lar) (örn EE2) içinde (etanol içinde 100 ul hacim) seri dilüsyonları yapmak.
   3. Etiket steril 96-de optik düz dipli mikrotitre 'tahlil plaka (ler)'. her bir levha testi kimyasal (lar) / çıkış özü (ler) sıraları ilaveten boşlukları (artı / eksi çözücü) ve bir E2 standart eğri içerir.
   4. Pipet deney plakasının uygun kuyuya her bir konsantrasyonu 10 ul (E2, kimyasal veya ekstresi). Pipet deney plakasının her "Çözücü boş" kuyuya etanol 10 ul. kuruyana kadar buharlaşmaya kapak kapalıyken bir deney plakası bırakın.
   5. Büyüme ortamı (~ 50 mi) bir şişe yapmak ve şişe başına klorofenol 0.5 mi kırmızı β-D-galaktopiranosid (CPRG) çözeltisi ilave edilir. Bir levha okuyucu içinde 620 nm'deki kültür bulanıklığı ölçülerek 24 saatlik kültür içinde maya hücrelerinin yoğunluğu belirlemek. a aşılamak24 saat kültürden 4x10 ⁷ maya hücreleri ile ssay araç.
   6. steril çukur içine inoküle deney ortamı dökün. Çok kanallı bir pipet kullanılarak 96 oyuklu deney plakasının her bir oyuğuna inoküle deney ortamı 200 ul ekle.
   7. 96-kuyu tahlil plaka kapağı koymak ve bant ile kenarları mühür. titre plaka karıştırıcısı üzerinde 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde deney plakasının (ler) çalkalanır ve doğal olarak havalandırılan bir ısıtma kabini içinde 32 ° C de inkübe edilir.
   8. 2. günde, kuvvetli bir şekilde 2 dakika boyunca bir titre plaka karıştırıcısı üzerinde deney plaka (lar) çalkalayın. 32 ° C inkübatör dönmek.
   9. 4. günde, bir titre plaka karıştırıcısı üzerinde 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde deney plakasının (ler) çalkalayın. Bir plaka okuyucusu kullanılarak, daha sonra yaklaşık 1 saat için stand 540 nm'de (CPRG ~ 575 nm için en uygun emiş) ve (bulanıklık) 620 nm 'lik bir emişteki bir deney plakası (ler) okuma plaka (lar) bırakın. oda sıcaklığında plaka (lar) ve gerekirse daha sonra okumak bırakın.
5. Östrojenik aktivite hesaplamaları
   1. aşağıdaki denklem kullanılarak bulanıklık için doğru tahlil okuma: Düzeltilmiş değeri = örnek veya 540 nm'de standart (E2) absorbans - [620 nm'de örnek veya standart (E2) absorbans - 620 nm'de boş absorbans]. Uygun boşlukları (kirlenme kontrol etmek için) ile arsa E2 standart eğri ^8.
   2. 'Estradiol eşdeğerleri' hesaplamak için düzeltilmiş örnek (özü ya da kimyasal) kullanın. / Numuneyi katmak E2 eşdeğer değerlere absorbans değerleri ayıklamak için çizilen E2 standart eğri değerleri ve regresyon denklemini (3 parametreli polinom veya lineer fit bağlı olarak) kullanın. Kullanım konsantrasyon faktörü (yani, su ekstre edilmiş ve hacim etanol ekstresi içinde yeniden süspansiyon haline) Önceden ekstre numunede östrojenik aktivite hesaplamak için kullanılır.

Erkek Etkafa golyan Vivo vitellogeninin İndüksiyon olarak kullanılması östrojenik Faaliyet 4. Laboratuvar Dayalı Değerlendirme

1. (Pimephales erkek fathead minnows kullanınpromelas)> sekonder seks karakterleri (görüntüler eski 4 ay, yani gerdek tüberküllerin geliştirilmesi ve erkek cinsel belirlenmesi gösteren bir sırt fatpad).
   1. yumurtlama etkinliği önlemek için, ayrı olgun testi başlamadan önce üç hafta (± 3 gün) erkekler. 3 g / l arasında bir en fazla yükleme olan en az iki 45 L cam akvaryumları ayarlayın. test için sağlıklı balıkların yeterli sayıda sağlamak için, 100 erkek en az kullanın.
   2. Test deneyimli olacak gibi aynı çevre koşullarında erkek balık tutmak (yani, 25 ± 1 ° C su sıcaklığı ve 16: 8 saat aydınlık: karanlık fotoperiyot). Örneğin, en azından her 6-8 saat, bir% 95 değiştirme zamanı sağlamak için her bir tank için seyreltme suyu akış oranının muhafaza, 45 L tankı 330 ml / dakika.
2. Test cihazı ve deneysel tasarım
   1. wat litresi başına balık en fazla 3 g yükleme karşılamak için büyük bir cam tankları kullanıner. 8 yetişkin erkekler (nominal 4.5 g her), 10-20 L tankı kullanın.
      1. Her tedavi için iki çoğaltma tankları kullanın ve gereksiz görme bozuklukları her tankı kalkan (yani, tanklar arasındaki lamine kart ekranlarını kullanın). Bir çalışmada numarası, bir poz konsantrasyonu ve bir gemi kimlik numarası ile her tankı tanımlayın.
   2. atıksu çıkış suyu çalışmaları için
      1. varışta, hemen 10 ± 1 ° C'de depolama tankına atık aktarın. atık alınmasından itibaren iki saat içinde atık dozaj başlayın.
      2. Aklimasyonundan kabına 10 ° C depolama tankından, peristaltik pompa vasıtasıyla, atık besleyin. 18 ± 2 ° C'de aklimasyonundan kabı içinde çıkış maddesinin ısıtın. (Balık tutan) testi akvaryumları sonra dozlama / karıştırma damarlarına aklimasyonundan kaptan ısıtılmış atık pompa ve. 25 ± 1 ° C 'lik bir sıcaklığa akvaryumları ısıtın.
   3. kimyasal dozlama çalışmaları için
      1. toz ağırlığındaki kabininde test kimyasalları tartılır. Tercih edilen çözücüler kullanılmadan GKD ₂ O konsantre kimyasal stokları hazırlayın.
         Not: çözücüler test bileşiklerinin çözündürülmesi için gerekli olması halinde, seyreltme suyu kontrolüne ek olarak çözücü madde kontrolleri kullanın.
      2. karıştırma kabı dozlama için akış kontrol cihazı (ler) üzerinden bir sıcaklık kontrollü başlık tankı / Yerçekimi besleme veya pompa seyreltme suyu. Pompa gemileri karıştırma / doz bir peristaltik pompa sistemi kullanılarak kimyasal stok (ler) konsantre. İstenen poz konsantrasyonu elde etmek ve su debisi (seyreltme suyu) (stok kimyasal) pompa hızını kontrol edin.
         Not: Kullanım silikon tüp karıştırma kabı / dozajlama gelen her test kabına su / Test kimyasal beslemek için. En az 24 saat% 75 kabı değiştirilmesini sağlamak için yeterli olan bir akış oranı, 20 L'lik bir tank için, yani, 20 ml / dakika kullanın. belirtilen nominal değerin ±% 10 akış hızını korumak.
   4. (25 ° C'de 5.8 mg ^L-1) 25 ± 1 ° C'de poz tankı su sıcaklığı, hava doygunluğu değerinin% 70 üzerinde çözünmüş oksijen ve çalışma boyunca (6.5 ila 8.5 pH değeri başlayarak) ± 0.5 pH birimi koruyun. 16 saat ışık photoperiod aydınlatma koşullarını ayarlayın: 8 saat karanlık, 20 dakika şafak / alacakaranlık geçiş dönemleri ile.
   5. Balık 2.5 (± 0.1) de taze çözüldü dondurulmuş yetişkin artemia (Artemia) ile günde iki kez yem başına tank başına g besleyin. Ayrıca tropikal pul balık yemi küçük bir miktar (iki parmak tutam) ile günde bir kez balık yemi. Her yem arasında 3 saat en az bırakın.
      1. (Kontrollere göre, iyi, orta veya kötü) beslenme tepkisi / davranışını izlemek için bir günlük beslenme kaydını tutun. herhangi meyvelerin gıda ve dışkı çıkarmak için en az iki kez (tercihen günde) bir hafta tankları sifon. En az haftada bir kez deney gemilerin kenarlarına ve dipleri temizleyin.
   6. Haftalık su örneği alınHer tanktan s (analitik kimya yoluyla) (Maya ekran üzerinden) östrojenik aktivite ve kimyasal kompozisyonunu onaylamak için. su örnekleme, özetleme ve analiz ayrıntıları için bölümlere 1-3 bakınız.
      Not: her bir deney için, doz yanıtını izlemek için seyreltme suyu kontrol (negatif kontrol), pozitif kontrol (E2 ve EE2) artı çıkış maddesi (100, 50 ve% 25), en az üç ya da test dilüsyonları kimyasal kullanımı. Yeni teknolojiler test ise, tedavi olan veya olmayan bileşik / çıkış maddesinin kullanımı (tedavisiz ör EE2, TAML / hidrojen peroksit ile EE2 _{(H2O 2)} tedavisi ^12; Şekil 1).

TAML / peroksit su arıtma kullanarak 17α-etinilestradiol ekotoksisite kaldırılmasını belirlemek için bir in vivo fathead minnow vitellogeninin Biyoassay deneysel tasarımı temsil eden Şekil 1. Diyagramı. Ihrkurmak erimental sekiz 11 L cam akvaryumlara suyun sürekli akışı ile her beslenen oluşur. Bağımsız bir kimyasal stok çözeltileri ve su (süzüldü deklorine) karışım odası teslim edilir. Karıştırma damarlarda (reaksiyon olmadan) Nominal konsantrasyonları 2 ng / L EE2, 80 nM TAML ve 0.16 mg / LH ₂ O _{2 'dir.} Kimyasal stok çözeltileri (EE2, H ₂ O ₂ ve TAML) hazırlanmış ve reaksiyonları karıştırma damarlarda başlaması, böylece ayrı ayrı dozlanmıştır. Balıklar (tank başına 8 erkek fathead balıklardır) yaklaşık 45 dakikalık bir reaksiyon süresinden sonra karışım (lar) maruz kalmaktadır. Su numuneleri haftalık maruziyet tankları alınır. Plazma örnekleri çalışmanın başında, bir temel grubundan östrojenik biyobelirtecin vitellogeninin (VTG) ölçmek için fathead minnows alınan ve maruz kalma 21 gün sonra tüm diğer balık vardır. Belirli tedaviler şunlardır: '-C'; Negatif kontrol (seyreltme suyu sadece), '+'; EE2 olumlu kontrolü,'+ H'; EE2 artı H ₂ O ₂ '+ T'; EE2 artı H ₂ O ₂ artı TAML. Bu rakam Mills ve ark., 2015 ¹² modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Test prosedürü
   1. aklimasyonundan dönemi
      1. Her seksüel olgunluğa erişmiş erkek balık ıslak ağırlığı (g) ölçün ve her tankın (tank başına 8 erkek) rastgele ayrılamadı.
      2. Aynı partiden ayrılmamış balık tutmak ve aynı test koşullarında onları korumak. fiziksel hasar ya da 7 günlük alıştırma döneminde durumun eksikliği belirtileri göstermeye herhangi bir bireyi değiştirmek için bu balıkları kullanın. Her tedavi tankı tamamen test koşullarına acclimated olan 8 erkek vardır aklimasyonundan döneminin sonunda olun.
      3. Aynı ba ek bir 8 erkeklerden 'temel' plazma numuneleri almakerkek balık tch. bölüm 4.4 kan örnekleme yöntemi ve 4.5 de vitellogeninin (VTG) analiz yöntemini izleyin.
   2. 4.2.2 ya 4.2.3 de tarif edildiği gibi bir alışma periyodunun ardından 21 gün süreyle maruz tanklarına çıkış maddesi ya da kimyasal dozaj stokları sağlar. Monitör ölüm, davranış ve her balık fiziksel görünümü günün ilk yem günlük öncesinde tankı çoğaltırlar. Herhangi bir anormal davranış veya olayları kaydetmek.
      Not: çevresel koşulların sağlanması ve beslenme oranları balıkların sağlığını (bölümler 4.2.4 ve 4.2.5) korumak.
4. 21 günlük maruziyet süresinden sonra balık Örnekleme
   1. örnekleme öncesinde 12 saat, balık besleme durdurmak.
   2. Kan örneklerinin toplanması için etiket mikro santrifüj tüpleri, Aprotininin ~ 5 ul (bir proteaz inhibitörü) ekleyin ve buz üzerine koyun.
   3. deklorine 1 L su başına MS222, 500 mg çözülmesiyle MS222 (anestezi) içindeki bir 500 mg / l'lik bir çözelti (daha önce iklime25 ± 1 ° C). 1 M NaOH ile pH 7.4 ± 0.4 MS222 nötralize.
   4. tamponlu MS222 halinde depodan her balık getirin. Tüm operkulum hareketi (genellikle 5 ± 1 dakika) sona erene kadar çözelti içinde tutun.
   5. Tedbir ve terminal anestezi altında çatal uzunluğu (mm) kaydedin. Kuyruk kesmek ve kaudal arter (Şekil 2) kan toplamak için heparinli hemocrit tüp kullanmak için tek kullanımlık neşter kullanın. Dikkatle önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpe kan dağıtmak ve buz üzerinde tutmak.
   6. Kan çizdikten sonra hemen balıkları öldür. dolaşım ve / veya beyin imha kalıcı durmasıyla ölüm onaylayın. Tedbir ve toplam balık ağırlığı (en yakın 0.01 g) kaydetmek ve gerektiğinde dokuların teşrih.
   7. toplama, 2 saat içinde kan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 7,000 x g) santrifüjlenir. Yeni etiketli 0.4 ml mikrosantrifüj küvetin içine bir pipet kullanarak plazma süpernatant aktarınbuz üzerinde es ve mağaza. Plazma VTG konsantrasyonlarının analiz edilmeden önce -80 ° C 'de santrifüj ve mağaza 30 dakika içinde, kuru buz üzerinde plazma içeren tüpler dondurun.

Şekil erkek (Pimephales promelas), plazma toplama ve testis yerini gösteren 2. Fotoğraf. Bütün balık kan örnekleri toplamak için öldürülmeleri gerektiğini 21 günlük maruziyet sonunda. Bir kez hızlı bir şekilde, ölçülen kaudal arterden kan toplama takip gerekir bu terminal anestezi balık uzunluğu (çatal boy, mm) altında Photo-A:. ​​Kırmızı noktalı çizgi (tek kullanımlık neşter kuyruğu kesmek için kullanılması gereken kuyruk amputasyon için yeri gösterir ). Fotoğraf-B kan toplamak için kullanılan bir heparinli hemocrit tüpü gösterir. onun kan örneği alındıktan sonra her balık bu durumda bütün kafa içinde, hemen öldürülmesi gerektiğinivücut (Foto-C) den kopmuş edilmiştir. Balık öldürüldü edildikten sonra vücut boşluğuna iç organları ortaya kadar açılabilir. Fotoğraf-C vs sazan balıkları, örneğin, fathead minnow, kızılkanat, sazan, yüzmek mesane (SB) göre testis (gonad) konumunu gösterir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. fathead minnows için özel olarak tasarlanmış bir homolog VTG enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti ile, plazma VTG konsantrasyonları ölçülür.
   1. üreticinin protokolü tarif edilen VTG standartları ve tamponlar hazırlamak. 5,000 ve 1: plazma örneği 01:50, 1 seyreltilir 500.000 ve üreticinin talimatlarına göre VTG standart eğri aralığında okumaları elde etmek için iki nüsha halinde bunları tahlil. vitellogeninin konsantrasyonlarını hesaplamak için üreticinin yönergeleri izleyin.

Gelişmiş / Roman Atıksu Arıtma Teknolojileri 5. Tarla Değerlendirmeleri Roach Vivo vitellogeninin ve İnterseks İndüksiyonunun (Rutilus rutilus) olarak kullanılması östrojenik aktivite Azaltmak için

1. yabani roach yakalama Atıksu Arıtma Tesisi deşarjı akışı aşağı yaşayan
   Not: gonochoristic ve östrojenik endokrin bozulmasına duyarlı olduğu bilinen vardır kullanın roach (Rutilus rutilus) ya da diğer bol tatlı su veya tuzlu balık türleri.
   1. Balık yakalamak, electrofishing kullanarak örgü, yakalama ya da durumun ¹³ bağlı diğer tanınmış balıkçılık yöntemleri. Örnekleme için laboratuvara geri havalandırılan tanklarda balık taşıyın.
   2. 4.4.2 detaylı olarak mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. 4.4.3 tarif edildiği gibi MS222 tamponlu hazırlayın. 4.4.4 detaylı olarak balık uyutmak.
   3. Terminal anestezi altında balık boy ve ağırlık ölçün.
   4. kaudal arter kullanarak Dispo kan toplamaksamur heparinize şırınga. hemen kan örneği alındıktan sonra her balık öldür. Dikkatle önceden etiketli mikrosantrifüj tüpler içine kan dağıtmak ve buz üzerinde tutmak. Adım 4.4.7 de açıklandığı gibi plazma hazırlayın ve ELISA (4.5) ile VTG ölçün.
   5. forseps her balığın 2-3 balık pulları kaldırmak ve tek tek etiketli küçük kağıt zarf yerleştirmek kullanma. Daha sonra balık yaş tayini ve büyüme analizi için kuru koşullarda oda sıcaklığında saklayınız zarflar.
   6. Bir neşter ile Açık vücut boşluğuna iç organları ortaya çıkarmak için. Iki tarafında yer alan bir gonad (Şekil 2) ile yüzmek mesane ortaya çıkarmak için bağırsak dışarı atın. Dikkatle cam şişenin içine ince burunlu forseps ve yer ile eşleştirilmiş gonadlar çıkarın. 01:10 doku oranında Bouin fiksatifi sahip gonadlar için kullanılabilir: sabitleştirici.
   7. doku büyüklüğüne (sabitleştirici saat başına 1 mm nüfuz) bağlı olarak 6-24 saat süreyle Bouin en doku bırakın. Sabit sonra Bouin sabitleştirici bir off dökün% 70, endüstriyel metil alkol (IMS) ile değiştirin d. dokular histopatolojik (Bölüm 5.3) için işleme kadar oda sıcaklığında sabit doku saklayın.
2. Roach in vivo vitellogeninin ve interseks indüksiyon kullanarak östrojenik aktivite Alan dayalı değerlendirme
   1. Deney tasarımı ve kurmak
      Not: in vivo çalışma başlatılmasının öncesinde de tank ve pilot tesisi kurma. sisteme balık herhangi ilave edilmeden önce 3-4 hafta akan tankları başlayın. Su akış oranları, su kalitesi ve emin parametreleri aktif hale getirmek için düzenli olarak şartları (pH, sıcaklık, çözünmüş oksijen, vb) Monitör korunabilir.
      1. Büyük tanklar Construct (örneğin, 300-1,000 L) 'kontrol' alabilir pilot tesis sitesinde, klorlu de musluk suyu, standart tedavi atık (lar) ve paralel tedavi atık (ler) gelişmiş. tanklara hava pompası / havalandırıcılar takın. Set su akış hızları en az 6 tankı v ulaşmak içinGünde olume değişim.
         Not: tanklar iyi yalıtılmış ve aşırı günlük sıcaklık dalgalanmaları önlemek için gölgeli olduğundan emin olun. Tasarım tankları davranışsal değişiklikler (beslenme yetersizliği vb), hastalık ve ölüm belirtileri için balık gözlem, izin vermek.
   2. 1 saat için ilgili tanklarda (balık çiftliğinden) roach çanta yüzen pozlamayı başlayın. yavaş yavaş su sıcaklığına kadar çanta tank su ekleyin ve koşullar, ortam vardır. onların tankları içine balık bırakın.
   3. pelet haline balık yemek (boyut 0.5-0.8) günlük yetişkin roach besleyin. Uneaten yem temelinde ayarlanmış küçük topak haline (pelet boyutları 100-300) non-östrojenik besleme ¹⁴ ad libitum, günlük çocuk roach besleyin. Bir günlük besleme rekor belgeleyen besleme yanıtı / davranış tutmak (kontrollere kıyasla, orta veya zayıf, iyi).
   4. östrojenik aktivite ve kimyasal kompozisyonunu onaylamak için her tanktan haftalık su numuneleri alır. Sesu numune alma ve analiz yöntemleri ile ilgili ayrıntılar için e bölümleri 1-3.
3. Balık histopatoloji ¹⁵ Gonadlar
   1. Dikkatle bir kesme tahtası üzerinde cımbız ve yer ile kaptan (adım 5.1.6 ve 5.1.7 açıklanmıştır) disseke ve sabit gonadlar çıkarın.
   2. 3 bölümden (ön, orta ve arka) içine ve her bölüm 3-5 mm kalınlığında kesiti kesim her gonad kesmek için bir mikrotom bıçak kullanın. Dikkatle etiketli plastik biyopsi kaset içine altı adet koyun ve Tablo 4'te listelenen zamanlamaları kullanılarak doku işlemci içine yerleştirin.
   3. Balmumu embed dokular ve döner mikrotom (3-5 mikron) bölüm. (45 ° C'de ayarlanır) ısıtılmış bir plaka üzerinde etiketli biyo-yapışkan kaplı cam slaytlar ve yer slaytlar transfer bölümleri 24 saat boyunca kurumaya.
   4. . Ya elle ya da Tablo 5'te ayrıntılı zamanlamaları kullanarak, otomatik Stainer kullanarak, slaytlar Leke lekeli doku üzerinde montaj maddesinin bir damla yerleştirin ve lay cam doku korumak için montaj ajan üzerinde lamel.
   5. İlk olarak, cinsiyet belirleme (10X göz hatları büyütme ile 20X, yani 2X objektif) düşük büyütme her slayt ve vücut boşluğuna ¹⁵ eklerin noktalarının sayısını inceleyin. Her balık için herhangi bir anormallik edin.
   6. Daha yüksek büyütme (100X veya 400X) at, gametogenez aşamaları, anormallikler ve testis dokusunda oosit varlığını değerlendirmek için doku incelemek. ⁶ (Tablo 6) 7 (% 100 yumurtalık dokusu) 0'dan değişen aşağıdaki derecelendirme sistemi (normal erkek doku) kullanarak interseks şiddetini kaydedin.

adım sayısı	tedavi	amaç	Süresi (saat)
1	% 70 IMS	kurutma	3
2	% 90 IMS	kurutma	2.5
3	% 95 IMS	kurutma	1.5
4	% 100 IMS	kurutma	1.5
5	% 100 IMS	kurutma	1.5
6	% 100 IMS	kurutma	1.5
7	% 100 IMS	kurutma	1.5
8	Histoloji temizleme maddesi	takas	1.5
9	Histoloji temizleme maddesi	takas	1.5
10	Histoloji temizleme maddesi	takas	1.5
11	BALMUMU	Wax infiltrasyonu	1.25
12	BALMUMU	Wax infiltrasyonu	1.25
			20 saat TOPLAM

Tablo 4. İşleme histopatoloji için doku emprenye balmumu rejim. Dokular otomatik doku işlemcisinde işleme tabi tutulmalıdır. Dokular belirtilen süre için ayrıntılı çözümleri dalmış olmalıdır.

Hayır Leke.	Leke	amaç	Süresi (dak)
1	Histoloji Takas ajan	balmumu erir	15
2	% 100 IMS	hidrasyon	2
3	% 90 IMS	hidrasyon	2
4	% 70 IMS	hidrasyon	2
5	MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR)	Durulama	2
6	hemotoksilin	Lekeleri hücre çekirdekleri mavi	10
7	MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR)	fazla kaldır	10
8	asitleştirilir IMS	klorsuzlaştırma	20 sn
9	MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR)	Durulama	20 sn
10	LICO 3	Tuz	20 sn
11	MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR)	Durulama	20 sn
12	% 1 Eosin (sulu)	Lekeleri sitoplazma pembe	20 sn
13	MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR)	fazla kaldır	5
14	% 70 IMS	kurutma	2
15	% 90 IMS	kurutma	2
16	% 100 IMS	kurutma	5
17	Histoloji Takas ajan	IMS, bağlama maddesini çıkarın	5

Tablo 5. Hematoksilen ve Eosin (H & E) Balık gonadal dokuların boyanması için çözümler ve daldırma süreleri. Slaytlar Alloc her banyosunda yerleştirilmelidirsırayla zaman caktır. Dokuların H & E boyama balık gonadlar üzerinde östrojenik atıksu atık gelişimsel ya da örgütsel etkilerini belirlemek için gereklidir.

Gol	bölüm Açıklama
0	Normal erkek testis
1	Multifokal testis dokusunda arasında dağılmış 1-5 oosit (genellikle tek başına) ile ovotestis
2	Multifokal ovotestis, genellikle küçük kümeler halinde 6-20 oosit testis dokusunda arasında dağılmış
3	Multifokal ovotestis, kümeler halinde 21-50 oosit
4	> 50 ve <100 oosit. Bölüm genellikle multifokal ve test bir mozaik görünümündediricular ve yumurtalık dokusu.
5	> 100 oosit, genellikle multifokal ama aynı zamanda testis dokusundan ayrılır yumurtalık ve testis dokusunun açıkça tanımlanabilir bölgeleri ile fokal olabilir.
6	bölümündeki gonadal doku yüzde> 50 yumurtalık ve açıkça epitel hücreleri ve fagositik dokuların testis dokudan ayrılır.
7	bölümünde gonadal doku 100 yüzde yumurtalık olduğunu.

Tablo 6. skorlama sistemi roach interseks durumunun ciddiyetini değerlendirmek için. Histolojik gonad dokusu hazırlanan slaytlar ışık mikroskobu altında incelenmesi gerektiğini, 20X de, 100X ve 400X büyütme, herhangi bir anormallik ve testis dokusunda oosit varlığını değerlendirmek için. Bu tablo Jobling ve diğ. 2006 ^6.

Sonuçlar

Girişimleri atıksu arıtma süreçleri iyileştirme etkisini anlamak için ya da boşalmış atık endokrin bozan aktivitesinin kaldırılması etkinliği açısından AAT mevcut en yüksek tedavi olarak ekipman güçlendirme için en uygun teknolojiyi belirlemek için, anahtar kimyasal ölçümünü sadece gerektirir işleri girmek değil, aynı zamanda endokrin bozan aktiviteye sahip olabilir yıkım ürünlerinin analizini gerektirir bileşenleri. Evsel atık atık, bu en estrojenik maddeler, steroid hormonlar, estron (E1) 17β-estradiol (E2) ve 17α-etinilestradiol (EE2) ^5,8 bulunmaktadır. Steroid estrojenler esas aktif olmayan konjugatlarının ^16,17 bir karışımı olarak vücuttan atılır. Bu konjuge östrojenler ölçüde bakteriyel aktivite ile kanalizasyon sistemine ayrıştırdığından ve daha fazla bozulma AAT oluşur. ayrıştırdığından steroidler aradsorpsiyon yoluyla atık su akışından çıkarıldı e çamur ya da oluşumu ile sonuçlanan ikincil tedavi sırasında biyolojik olarak parçalanır, öncelikle dönüşüm yan ürünleri ve sonuçta tam mineralizasyon ilk aktif bileşen oluşabilir için. çıkış akımındaki tüm tek tek bileşiklerin kimyasal analiz zaman alıcı ve pahalı bir zor olacak ve bir numune içinde mevcut bilinmeyen aktif bileşenleri kapsamaz olacaktır. Ayrıca, her bir bileşenin estrojenik bir miktar, sadece analiz bileşiklerin bir numunesinin kümülatif estrojenik potansiyelleri estradiole göre bir göstergesini sağlayacaktır. Bu dönüşüm süreçleri bilinmeyen östrojenik maddeler ya da nerede içeri giren endüstriyel kaynaklı olduğunu oluşturmak bir risktir. In vivo ve in vitro ekotoksikolojisi biyo-deneylerde kimyasal analizi birleştiren gibi muamele edilmiş kanalizasyon gibi karışımlar bilinmeyen estrojenik bileşenlerin varlığı için bir çözüm sağlar. Maya östrojen Scr gibi in vitro deneylerleeen (VAR) kanalizasyon atık östrojenik aktivitesini belirlemek için ve işlenmiş numuneler ^8,18,19 aktif bileşenleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, in vivo ve in vitro ile test karşılaştırmalar ¹¹ önemli olabilir ve endokrin bölücü potens tedavisi ile ilgili olarak, yeni işlemler kapsamlı bir değerlendirme, kimyasal ve ekotoksikolojisi testlerin bir pil gerektirir.

Bireysel arıtma tesisleri veya işlemler atık akımından aktif bileşikleri çıkarmak olmadığının belirlenmesi Örnek ekstraksiyonu, konsantrasyon ve özü, analizden önce temizlenmesi takip kimyasal analiz kullanılarak elde edilebilir, genellikle LCMS (/ MS) veya GCMS kullanılarak yapılan (/ MS) yöntemleri. Bireysel etkisiz konsantrasyonlar (PNEC) ²⁰ veya çevresel kalite standardı tahmin kimyasal analizinden elde edilen veriler uygunluğunu belirlemek için kullanılabilirs (EQS) özel bireysel bileşiklerin ²¹ ve bu nedenle bu tür yöntemler yasal uyumluluk verileri için hayati önem taşımaktadır. Bundan başka, hedef ya da hedef olmayan kimyasal analiz yöntemleri toplam yanıt sağlamak, biyolojik yöntemler ile karşılaştırıldığında, tek tek bileşiklerin ya da izomerlerin tanımlanması ve kantitatif sağlar. Kimyasal analiz yöntemleri, bu nedenle ayrı bileşiklerin değerlendirilmesi karşılamak ve bireysel arıtma tesisi bazında bu atıksu arıtma sorunlarını çözmek için yapılabilir izin verir. Çalışmalar sentetik hormon çıkarılması EE2 daha az etkili olma eğilimindedir, ancak geleneksel bir atık su muamele (örneğin, aktif çamur bitkiler), doğal steroid hormon çıkarılması son derece etkili olduğunu göstermiştir. bunlar pred aşağıda EE2 kaldırmak için bir uç boru-çözeltisi olarak kullanılabileceğini ozon gibi teknikler kullanılarak, gelişmiş tedavi ile alan çalışmaları, granül aktif karbon (GAC) ve membranlar, yüksek maliyetli olsa göstermiştiretki seviyeleri icted ve algılama sınırları aşağıda. Şekil 3 pilot ölçekli belediye atık su arıtma tesisinde GAC kullanarak EE2 kaldırılmasını gösterir. Boru GAC tedavisinin ucunu kullanarak belediye atık su arıtma tesislerinde pilot ölçekte yapılan çalışmalar da östrojenik etki gücü azalma GAC aşağıdaki Şekil 4'te görüldüğü gibi Maya Östrojen Ekranı (EVET) kullanılarak ölçülür gösteriyor.

Şekil 3. gelişmiş üçüncül tedavi sonrası etinilestradiol kaldırılmasını gösteren örnek alan verisi. (A) Numuneler numune korunması için açıklanan prosedürler izlenerek, geleneksel (aktif çamur tesisi) tedavi sonrasında AAT tahsil edilir. (B) Numuneler normal faz SPE kullanarak müdahale maddeleri kaldırmak için katı faz ekstraksiyon, temizlenmiş-up kullanılarak ayıklanır veJel geçirgenlik kromatografisi. (C), temiz, konsantre edilmiş ekstrakt düşük bir hacme konsantre edildi ve MRM modunda negatif iyon elektrosprey LCMS / MS ile analiz edilir. Sonuçlar izotopik iç standartlarını kullanarak iç standardizasyon kullanılarak hesaplanır. Gösterilen örnekte, EE2 0.1 ng / L öngörülen etkisiz seviyeye (PNEC) üstünde bir konsantrasyonda nihai ASP çıkış maddesi içinde mevcut olan ve GAC ve ozon kullanılarak çıkarılır (O ₃₎ çevresel olarak güvenli bir konsantrasyona seyreltildi. Burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Bir Maya Östrojen Ekranı (EVET) tahlil plaka (A), sarıdan kırmızıya renk değişikliği gösteren örneklerin östrojenik aktiviteye ilişkin Şekil 4. Fotoğraf. EVET tahlil plaka gösteren oluşturulan araziler absorbans düzeltilmiş (540Estradiol standart (B) nm), aktif çamur çıkış (ASP) ve granül aktif karbon (GAC) ile muamele atık çıkış maddesi örnekleri (C). Her numune iki kez test edilmiştir. ASP ve GAC atıkları ayıklanır ve bölüm 1'de belirtilen SPE yöntemleri kullanılarak konsantre edilmiştir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ozonlama Ayrıca, geleneksel olarak işlenmiş atık su işleme tesisleri, steroid östrojen ve östrojenik aktivite giderilmesinde etkilidir. Ozon atık su numuneleri bir organik kirletici maddelerin geniş ve çözünmüş organik madde oksitleyebileceğini ve dezenfeksiyon özellikleri sağlar. ozonlama etkinliği pH, organik madde miktarına ve ozon uygulanan doz su özelliklerine bağlıdır. Kötü geleneksel muamele ile çıkarılır östrojenler olabilir0.8 ve 2 mg O ₃ / mg DOC arasındaki dozlarda atık çıkarıldı. Ozon EDC bir dizi dökümü için uygulanabilir ozon yapan elektron yönünden zengin bir bölgede (doymamış karbon-karbon bağları, aromatik alkoller dahil olmak üzere aromatik bileşikler), ile reaksiyona giren bir seçici oksitleyici maddedir. Bununla birlikte, tek tek bileşiklerin ortadan kaldırılması gerekli orijinal bileşiğe tam mineralizasyon yol açmaz. Organik maddeler, aşağıdaki ozonlama yan ürünler, düşük molekül ağırlıklı bir dizi içerir üreten ara maddeleri ya da dönüşüm oksidasyon transforme edilebilir, aldehidler, ketonlar, karboksilik asitler, keto asitler ve bromlu bileşikler gibi bileşiklerin, polar sınıfları. Örnekler, bromat, formaldehit, asetaldehit ve karboksilik asitler yer alır. In vivo kullanma ve in vitro biyo-deneylerde ozon kısmen bazı kimyasal maddeler okside olmasına rağmen, elde edilen önemli bir transformasyon ürünleri daha düşük bir estrog sahip olduğu gösterilmiştirENIC gücü ve dolayısıyla östrojenik aktivitenin yüksek çıkarılmasına uygun bir doz sonuçlara ozon uygulanması.

atıksuların ek tedavi önemli faydalarından biri alıcı su ortamlarında erkek balıkların feminizasyonu azalma olduğu; azaltılmış doğurganlık ³ yol açabilir olumsuz etkisi. balık kullanılarak in vivo çalışmalar (örneğin, hamamböceği ya da fathead minnow) (Şekil 5'de görüldüğü gibi, örneğin) erkek balıkların testiste atıksu gösterisi dişi germ hücreleri veya oosit maruz. Interseks veya erkek VTG yoktur ya da önemli ölçüde bu tür GAC ⁷ veya ozon ²² gibi gelişmiş tedavi sonrası balık azaltılır. Bu çalışmalar, ancak bu üretilen çıkış maddesinin toksikliğini hitap etmez, ozonasyon sırasında üretilen dönüşüm ürünleri estrojenik olmadıklarını göstermektedir. Bu sorun, örneğin, diğer çalışmalarda Magdeburg ve arkadaşlarının çalışması ele alınmıştır. 23 kadar.

Normal bir erkek (A) ve interseks Şekil 5. Fotomikrografları (B, C) ​​alan bazlı değerlendirme. Photomicrograph-A atıksuların maruz kalan yetişkin roach (Rutilus Rutilus) dan gonadlar, normal erkek testis histolojik bölüm göstermektedir. Fotomikrografıdır-B ve C, altı ay boyunca aktif çamur prosesi atiksuyun maruz kalmış bir interseks erkek balık histolojik bölümleri, göstermektedir. Oklar testis dokusunda bulunan oosit göstermektedir. Ölçek çubuğu her fotomikrografiyle 100 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ozon, GAC veya membran teknolojisini kullanarak boru tedavi sonunda yüksek maliyetli bir alternatif daha düşük maliyetle geliştirilmesini gerektirmektedir, kimyasal (EDC) çıkarılmasını bozmakta endokrin için sürdürülebilir yöntemler. Ayrıca, soğurma ve ayırma yöntemleri, sadece yıkımı yoluyla ortadan kaldırarak yerine başka bir fazdan EDC ayırın. ^{26 -} TAML aktivatörleri atık ^12,24 içinde organik mikro hidrojen peroksit oksidasyonu katalize etmek için geliştirilmiştir. TAML etkili bir saf laboratuvar suda yanı sıra belediye atıksu arıtma tesislerinden gelen atık ve çivili idrar örneklerinin ¹² EE2 ve diğer steroid östrojen aşağılamak O ₂ H ₂ ile aktivatörlerinin. Laboratuar çalışmaları, TAML / H ₂ O ₂ tedavisi EVET biyoassay ve substantia kullanılarak in vitro ölçülen östrojenik aktiviteye EE2 çıkarılması dahil olmak üzere yüksek steroid östrojen temizlenmesini sağlar ve önemli ölçüde düşürdüğünü göstermektedirlly VTG biyoassay (Şekil 1 ve Şekil 6) kullanılarak ölçüldü vivo balık feminizasyon azalır.

Şekil 6. Ortalama EE2 konsantrasyon ve estrojenik etkinlik tedavi edilen ve edilmeyen tankı sular (A) ve başlangıç ​​plazma vitelogenin ve açıkta kalan bir erkek balık (B). A) EE2 konsantrasyonu (ng / L, koyu mavi bar) LCMS / MS ile ölçülmüştür , östrojenik aktivite (EE2 eşdeğer ng ​​/ L, koyu yeşil çubuklar) (EVET) in vitro Maya Östrojen Ekran ile ölçüldü. B) Plazma vitellogeninin (erkek fathead minnows içinde / ml, açık mavi bar) konsantrasyonu ng kantitatif enzim aracılığıyla ölçüldü immünosorbent deneyi (ELISA) -bağlı. Olarak rapor EE2 kimyasal analiz sonuçları <0.03 ng / L EE2 (yani, saptama sınırı (LOD) daha düşük), yani (yarım LOD sahip olarak tedavi edildi ortalamalar, standart hata ve istatistiksel analiz hesaplamalarında kullanılmak üzere 0.015 ng / L EE2). EE2 ve östrojenik aktivite 21 gün aşırı maruz kalmak örneklenmiş ortalama ölçülen konsantrasyonlar vardır. Plazma VTG maruz kalmadan önce (taban) ve 21 gün maruziyetten sonra ölçülmüştür. Tedavi rejimi oluşuyordu; Negatif kontrol (seyreltme suyu sadece), EE2 + H ₂ O ₂ + TAML, EE2 + H ₂ O ₂ ve EE2 sadece. Grafik-A Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil etmekte, grafik,-B'de Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Grafik-B barlarda yukarıdaki harfler istatistiksel benzerlik gösterir. Bu rakam Mills ve ark modifiye edilmiştir. ¹² bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Atıksu arıtma tesisleri EDC ile yüzey suyu kirlenme önemli yol vardır. Geleneksel olarak ilerlemiş veya gelişmekte olan tedavi süreçlerinin endokrin aktivitesinin giderilmesi etkinliğinin değerlendirilmesi, kimyasal ve biyolojik tahlillerin çeşitli kullanılmasını gerektirir. hedeflenmemiş ve hedeflenen analizi kullanılarak kimyasal analiz tek tek bileşenlerin çıkarılması etkinliği üzerinde nitel ve nicel veriler sağlar ve bu nedenle bir değerlendirme çevresel kalite standartlarına karşı yapılan veya analiz bileşiklerin veya bileşimlerin karışımları etkisiz konsantrasyonlar tahmin sağlar.

arıtılması ve bilinmeyen biyolojik olarak aktif bileşenlerin varlığında aşağıdaki maddelerden eksik mineralizasyon kaynaklanan dönüşüm ürünlerinin üretimi, tek başına kimyasal test kullanımlarını sınırlandırmaktadır. Analitik kimyager ile kombinasyon halinde in vitro biyo-deneyler, in vivo ve in bir kombinasyonury tarama atıksu arıtma süreçleri ortaya çıkan yoluyla EDC çıkarılması etkinliğini belirlemek için kullanışlı bir araç sağlar. geleneksel su kalite parametreleri ve diğer toksikolojik ve mikrobiyolojik uç noktaları ile birlikte yürütülen bu testler, mevcut ve gelişmekte olan atıksu arıtma teknolojilerinin kritik bir değerlendirmesini sağlar.

Olmadığı Maya tabanlı östrojen ekranları (örneğin, YES) not kimyasallar ve atıksuların östrojenik gücünü belirlemek için deneyler in vitro önemlidir. Kararlı biçimde transfekte edilmiş memeli hücre bazlı deneyler arasında bir sayı, örneğin, ER-CALUX ²⁷ ve insan göğüs kanseri hücreleri ya da servikal tümör hücreleri ile ²⁸ hERα-HeLa-9903 sırasıyla, çok geliştirilmiştir. EVET benzer memeli hücre bazlı analizlerle kıyasla olmuştur ve tekrarlanabilirlik karşılaştırılabilir yüksek düzeyde olduğu tespit edilmiştir, gerçek pozitif ve gerçek negatif östrojenik kimlik oranları ^29, bussesöf bazen ²⁷ biraz daha az hassas olduğu kabul edilir. Maya tabanlı muhabiri deneyleri yararlarından biri daha az sıkı biyo-kontrol önlemleri ve steril teknikler gerektirir gibi memeli hücre kültürü ile önemli bir deneyime olmayan laboratuvarlarda EVET daha kolay (EVET gerekirse tezgah üstünde yapılabilir), kabul edilebilir olmasıdır . İnsan hücre bazlı deneyler de EVET kullanılan standart kuvöz ve mikro okuyuculara kıyasla CO ₂ inkübatör ve luminometreyle gerektirir. İki maya bazlı östrojen raportör testleri (EVET, Saccharomyces cerevisiae ve A-EVET, Arxula adeninivorans) ISO 19040 onaylanması için şu anda geçiren laboratuvarlar arası yollar "Su kalitesi - su ve atık su östrojenik potansiyelinin belirlenmesi" endüstrileri vurgulayarak bu tekniklerin ilgi.

etkiyi açıklanan yöntemlerle sınırlamaları vardıralan ya da laboratuvar ortamında veya insan kirlenme (örneğin, plastikleştiriciler, yüzey aktif maddeler, kişisel bakım ürünleri) ile kaynaklanan östrojenik maddeler ile numune, numune saklama ve analiz esnasında numune. EVET deneyi (ya da diğer hücre bazlı raportör tahlilleri) kontaminasyon Bu tip arka plan yükseltmek ve tahlil kullanımını etkileyecektir. plastik şişelerde saklanan su örnekleri veya çözücüler kolayca yanlış pozitif neden olabilir. LCMS / MS ve EVET tahlil hem saptanabilir düzeye östrojen konsantre SPE gerektiren yanlış negatifler endişe de bulunmaktadır. matrisi, SPE sorbent ve yıkama çözücü seçimi ekstraksiyon etkinliğini ve akıtılan bileşiklerin türlerini etkileyebilir. Çok kutuplu ve bazik bileşikler kötü sorbent tarafından muhafaza edileceği gibi, negatif bir eğilim oluşturabilir, bu protokolde belirtilen koşullar kullanılarak çıkarılması için C18 SPE kartuşları kullanarak. Ayrıca, bu protokol metan elüte EVET eluent sulandırılması gereklidirol uçucu bileşiklerin kaybı ile sonuçlanan fon sağlayıcısı azot kuruyana kadar buharlaştırma yolu ile etanol. Bunun bir sonucu olarak protokol test edilen örneklerin östrojenik aktivite hafife sağlamak olabilir. Onlar çıkarılan henüz ya da buharlaşma nedeniyle kaybolur, çünkü bilinmeyen veya beklenmeyen bileşikler olarak EVET deneyi, cevapsız olabilir göz önüne alındığında Bu sınırlamalar özellikle önemlidir. Ayrıca, LCMS / MS tekniği kurtarma düzeltmek için etiketli dahili standartların kullanımı yapar; Bu yaklaşım VAR testi ile kullanılamaz.

Atık in vivo test önemli sınırlamalar, in vitro yöntemlerle karşılaştırıldığında değerlendirme için gerekli olan yüksek maliyet ve zaman bulunmaktadır. Şu anda östrojenik aktivite tespit etmek için balık embriyo testlerinin kullanımı sınırlıdır. Ancak, gelecekteki uygulamalara sahip olabilir balık embriyoları ^30, parlayan östrojen duyarlı transgenik üreten bazı başarı olmuştur. Bu protoc kullanılan Etkafa balıklardır (ol), ortak bir laboratuar türleri ve erkek balık VTG indüksiyon östrojenik maruz iyi belgelenmiş bir biyo-marker atık çıkış maddesi östrojenizitede ²² ya da diğer östrojenik bileşikler veya bunların karışımları ³¹ bir ölçülebilir ölçer bulunmaktadır. Endokrin bozucu kimyasallara OECD testi kurallar VTG her üç türün östrojen maruz kalma hassas bir biyolojik belirteç olmak, yetişkin fathead Minnow, Japon Medaka ve zebrafish ^32,33 ile onaylanmıştır. Ciddi interseks roach ^3'te görüldüğü gibi Ancak, VTG indüksiyon doğrudan üreme bozukluğu ve atıksu maruz kalma nedenle ekolojik sonuçlara ilişkili değildir. Öte yandan, hamamböceği nedeniyle büyük boyutlu, uzun nesil süre (2-3 yıl cinsel olgunluğa ulaşması), üreme tarzı için Ekotoksikoloji araştırma için bir klasik 'laboratuvar türleri' değildir; grup yumurtlama (üreme) yılda bir kez gerçekleşir ve zorluk sırasında başka kadın dan erkeklere (tanımlamak içinyumurtlama mevsimi). Ancak, bu normal gonochoristic türün çok iyi nedeniyle östrojenik atıksu atık aşağı, erkek balıklar endokrinoloji (örneğin, kadın-spesifik kanlarında vitellogeninin varlığı) ve histopatolojik (ovotestes tedirginlikler sergilenen keşif, İngiltere'de çalışılmıştır - testis ve / veya kadın üreme kanallarında) ^5,6 yumurta geliştirilmesi. Bu nedenle, bu protokollerin bir gelecek uygulaması olarak, hamamböceği (veya benzeri türler) atıksu kalitesi (ve düşük östrojenizitede) gerçek iyileştirmeler ileri işlenmiş atık suların alıcı nehirler görülür olmadığını göstermek için yararlı bir vahşi nöbetçi tür olabilir. Onlar da pilot bitkilerden ^7'den teknolojik gelişmiş atık suları izlemek için boru sistemleri sonunda kullanılabilir. In vivo atıksu değerlendirmelerde kullanmak için hangi tür göz önüne alındığında nispeten hızlı ve kontrollü test kullanarak laboratuvar türler arasında bir değiş tokuş karşılaştırıldığında varuzun alan bazlı, ama yerli türler kullanılarak test daha çevreyle ilgili. Bununla birlikte, in vivo değerlendirmelerde yüksek maliyetli ve sadece kimyasal analizi kullanılarak değerlendirmeler, aşağıdaki testler nihai grubu olarak ve in vitro deneylerde dikkate alınmalıdır.

Açıklanan protokoller dahilinde kritik adımlar hazırlanması ve örnekleri ve cam işleme dahil plastik ve örneklerin temas sınırlayıcı dahil olmak üzere çevresel kirleticilerden örneklerin kirlenmesini önlemek için (yani, şişeler ve örnekleme ekipmanları uygun yüzeye aktif temizlik maddesi ile ön tedavi edilmelidir) yanlış pozitif üretebilir diğer malzemeler. tasarımı ve aquaria ve balık pozlama sistemleri bina bu da aynı derecede önemlidir. İdeal akvaryumlar (konut stokları ve pozlama sırasında) en az kontaminasyon riski düşük adsorpsiyon ³² malzemelerden inşa edilmelidir. Paslanmaz çelik çıkış maddesi ya da bir su tutma tankı kullanılabilir.Bir cam yapım tanklar balık tankları için tercih edilir ise (bu da balığın kolay gözlem sağlar gibi). Düşük dereceli plastik boru ya da boru kullanımı, yani, kullanımdan önce en az 12 saat için seyreltme suyu altında herhangi bir kirletici süzülmeye bırakılır, 'doğru görmüş' ise ³² PVC ³⁴ ve ABS kullanılabilir kaçınılmalıdır. Tıbbi grade silikon boru tanklarına kimyasal ve atık su / seyreltme suyunun peristaltik pompa teslimat için tesisimizde başarıyla istihdam edilmiştir. Yanı sıra inşaat östrojenik kirlenmeyi dikkate ve su sporları sisteminin çalışan olarak, balıkların beslenme düşünmek de önemlidir; Birçok uygunluk balık yemleri balık östrojenik olduğu tespit edilmiştir. Nedenle önceki çalışmaların bu tür bunları kullanarak (Beresford ve ark. ¹⁴ Bkz, Maya Östrojen Ekranında, örneğin) faaliyet için herhangi bir yiyecek test edilmesi önemlidir.

Sorun gidermekalite güvence örnekleri çoklu seyahat, laboratuvar dahil ve çözücü boşlukları yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlara ortadan kaldırmak için pozitif kontroller ve gerçek örneklerin yanında analiz edilirse, basitleştirilmiş açıklanan kimyasal analiz veya EVET tahlil protokolleri. Pozitif (örneğin, EE2) ve negatif (seyreltme suyu sadece) kontrolü her zaman tespit edilecek herhangi bir beklenmedik kirlenme beklenen biyolojik belirteç veya son nokta (yani, VTG veya histopatoloji) hassasiyetini teyit ve izin in vivo deneylerde de kullanılması gerektiğini ( örneğin, deneysel seti yukarı, diyet ya da seyreltme suları) dan. protokolünde herhangi bir değişiklik herhangi bir çalışma yürütmektedir önce valide edilmelidir.

AAT atıkları yoluyla çevreye giren östrojenik bileşiklerin sıkı düzenleme ile daha etkin atıksu arıtma teknolojileri geliştirilmesi gerektiğini canlandırmak olduğunu. Bu yazıda anlatılan testlerin pil iltifatekotoksikolojik ve kimyasal değerlendirme testleri normal atık su arıtma tesisi, atık su boşaltma başvurdu. Bu nedenle, atıksu teknolojisi geliştiriciler ve tesis operatörlerine imkan vermelidir testin bütünsel pilin bu tip gelecekteki uygulamaya özel düzenlenmiş östrojenik kimyasallar ve genel biyolojik aktiviteyi hem kaldırmak için en iyi yöntemler dikkate alınarak en ekolojik açıdan güvenli tasarımlar uygulamak.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wellwash Versa plate washer	Thermo Scientific	5165010
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax 340PC
Incubator	Memmert	INB 400	37 °C incubation required for carp assay
Fisherbrand whirlimixer	Fisher Scientific	13214789
Icemaker	Scotsman	AF80
12-Channel F1 digital multichannel pipette	Thermo Scientific Finnpipette	4661070
ELISA kits	Biosense Laboratories	V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp)
Microfuge tubes, 0.5 ml	Alpha labs	LW2372
Microfuge tubes, 1.5 ml	Alpha labs	LW2375
Sulphuric acid, 95-98%	Sigma-Aldrich	258105
Histology
Tissue processor	Leica Biosystems	TP1020
Wax dispenser	Thermo Scientific Raymond Lamb	E66HC
Metal embedding mold	Leica Biosystems	Various
Hot plate	Thermo Scientific Shandon	3120063
Cold plate (EG1150 C)	Leica Biosystems	14038838037
Heated forceps (EG F)	Leica Biosystems	14038835824
Microtome	Leica Biosystems	RM2235
Paraffin section floatation  bath	Electrothermal	MH8517
Slide drying bench	Electrothermal	MH6616
Stainmate automated stainer	Thermo Scientific Shandon	E103/S10L
Cassettes, Histosette II, biopsy	Simport	M493
Paraffin wax	Thermo Scientific Raymond Lamb	W1
Histo-Clear II	National Diagnostics	HS-202
IMS (ethanol mix), IDA99	Tennants	ID440
Polysine adhesion slides	Thermo Scientific Gerhard Menzel	J2800AMNZ
Cover slips, 22x50 mm	VWR	631-0137
Histomount	National Diagnostics	HS-103
Haematoxylin Harris GURR	VWR	351945S
Eosin, 1%, aqueous	Pyramid Inovation	S20007-E
Fisherbrand slide boxes	Fisher Scientific	11701486
Microtome blades, MB35	Thermo Scientific Shandon	3050835
Bouin’s solution	Sigma Aldrich	HT10132-1L
Yeast screen
Flow cabinet	Labcaire Systems Ltd	SC12R
Cooled incubator	LMS Cooled Incubator	303
Incubator	Memmert	INB 400
Shaker	Grant	PSU-10i
Fisherbrand whirlimixer	Fisher Scientific	13214789
Plate shaker	Heidolph Titramax 100	544-11200-00
12-Channel F1 digital multichannel pipette	Thermo Scientific Finnpipette	4661070
12-channel pipette, electronic	Sartorius	735441
96-well flat-bottom microplates	MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt	76-232-05 260860 82.1581.001	We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
HPLC grade water	Rathburn	RH1020
Absolute ethanol	Hayman Kimia	F200238
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Sigma-Aldrich	P-5655
Ammonium sulphate	Sigma-Aldrich	A-2939
Potassium hydroxide, pellets	Sigma-Aldrich	P-1767
Magnesium sulfate, anhydrous	Sigma-Aldrich	M-2643
Iron(III) sulfate	Sigma-Aldrich	307718
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L-8912
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H-6034
Adenine	Sigma-Aldrich	A-2786
L-Argenine, hydrochloride	Sigma-Aldrich	A-6969
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M-5308
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T-8566
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I-7403
L-Lysine, hydrochloride	Sigma-Aldrich	L-8662
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P-5482
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G-8415
L-Valine	Sigma-Aldrich	V-0513
L-Serine	Sigma-Aldrich	S-4311
Thiamine, hydrochloride	Sigma-Aldrich	T-1270
Pyridoxine	Sigma-Aldrich	P-5669
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P-5155
Inositol	Sigma-Aldrich	I-5125
D-Biotin	Sigma-Aldrich	B-4639
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers	Sigma-Aldrich	G-7021
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A-4534
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T-8441
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1297
Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	10884308001
Glycerol	Sigma-Aldrich	G-2025
17 β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E-8875
Steroids
Acetone	Rathburn
Acetonitrile	Rathburn
Ammonia solution	Rathburn
Ethylacetate	Rathburn
Copper(II) nitrate	Sigma-Aldrich
Acetone	Rathburn
Dichloromethane	Rathburn
2,4,16,16-d4-17β-estradiol	CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-estrone	CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol	CDN Isotopes
17β-estradiol	Sigma-Aldrich
Estrone	Sigma-Aldrich
17α-ethynyl oestradiol	Sigma-Aldrich
Hexane	Rathburn
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich
Methanol	Sigma-Aldrich
Sodium hydrogen carbonate	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml)	Biotage
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml)	Biotage
Fish study
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6	Watson Marlow	982.0063.000
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20	Watson Marlow	999.2008.000
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m	Watson Marlow	913.A008.016
200 series multi-channel persitaltic pump	Watson Marlow	205CA
Silicone tubing x 15 m (dosing tanks)	VWR	SFM1-3250
silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow)	VWR	SFM1-5450
2.5 L glass winchester pk 4	Fisher Scienctific	BTF-505-050B
magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10	Fisher Scienctific	FB55595
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma Aldrich	E10521-10G
17α-Ethynylestradiol	Sigma Aldrich	E4876-100MG
Absolute ethanol	Hayman Kimia	F200238
SPE
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4	Sigma Aldrich	57276
disposable liners for manifold	Sigma Aldrich	57059
filtration tubes without frits 6 ml pk 30	Sigma Aldrich	57242
reservior adaptors pk 12	Sigma Aldrich	57020-U
stainless steel weight for manifold pk 4	Sigma Aldrich	57278
male Luer plug for manifold pk 12	Sigma Aldrich	504351
SPE Vacuum Manifold	Sigma Aldrich	57265
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12	Waters	WAT054806
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50	Waters	WAT020515
Methanol HPLC grade 2.5 L	Fisher Scientific	M/4056/17
7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399	Fisher Scientific	TUL-520-031K
Absolute ethanol	Hayman Kimia	F200238
vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump	Camlab	1136915