폐수 처리 프로세스의 효능의 평가를위한 화학 및 생체 독성 방법의 배터리를 사용하면 에스트로겐 효능을 제거하는 방법

요약

내분비 교란 화합물 (EDC)는 수생 환경에 상당한 위험을 초래할. 시 폐수 처리 공장은 지표수의 에스트로겐 효능에 큰 기여입니다. 이 문서에서 제공하는 방법은 EDC 제거에 대한 효능 및 폐수 처리 공정의 적합성의 평가를 할 수 있습니다.

초록

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

서문

야생 동물의 생식 건강에 내분비 교란 화합물의 부작용에 ​​대한 우려는 물 프레임 워크 지침 (WFD) 아래의 "시계 목록"에이 에스트로겐 물질 (에스트라 디올과에 티닐 에스트라 디올)를 배치하는 유럽 연합 (EU)을 주도하고있다. EDC는 천연 및 합성 스테로이드 에스트로겐, 의약품, 농약, 산업용 화학 물질과 야생 동물에 알려진 부작용과 소비자 제품의 성분을 포함한 화학 클래스의 다양한 포함한다. 이들 화합물의 일부는 잠재적으로 인간의 건강 ^{(1)에 영향을} 미칠 수 있습니다.

연구는 하수 처리장에서 폐수가 ^{2 물고기에} 에스트로겐있는 것으로 나타났습니다과 결과로 많은 수신 물은 물고기 ³ 에스트로겐도 있습니다. 이것은 최초의 야생 수컷 물고기의 피와 높은 사전에 (여성 특정 난황 단백질 전구체 ⁴⁾ 증가 vitellogenin 농도를 보여 주었다 영국의 국가 설문 조사를 통해 입증되었다원자가는 성별 간 정상적으로 자웅 이체 물고기 종 ^5,6에서 (남성 물고기의 정소에서 계란 및 / 또는 여성의 생식 관의 개발).

기존의 하수 처리는 일반적으로 용해시키고, 유기물을 제거합니다 현탁 기본 및 보조 처리하여 예비 스크리닝 이루어진 3 단계 과정이다. 개별 EDC의 제거 효과는 물질의 물리 화학적 특성에 적용하고 치료 과정의 효율성에 의존적이다. 흡착 및 생물 분해를 통해 많은 EDC 제거에 상당한하지만 불완전 할 수 있습니다. 차 처리, 모래 여과로, (예를 들어, 오존) 고도 산화 처리를 사용하여 고급 반면 EDC 제거 ^(7)의 증가에 효과적이나 활성탄 완전한 제거 ⁷ 근처 효과적으로 달성 될 수있다.

폐수 처리 옛 성은에 대한 새로운 기술의 평가DS는 EDC 제거에 제안 된 방법의 유효성을 확인합니다. 타겟 화학 독물학 테스트 함께 분석, 생체 내 및 시험관 내 생물 검정의 사용을 포함하여 시험의 전지는 이러한 목적을 위해 종합적인 데이터를 제공한다. 규제 목적에 매우 유용하지만, 대상 화학 분석은 모니터 화합물 (특정 대사 산물)에 데이터를 제공 할 수 있습니다. 생물 검정은 추가로, 그렇지 않으면 ^8,9를 들키지 될 것이다 부산물 대사 및 치료 생성 된 폐수 변환의 부작용의 "감지"할 수 있습니다. 본 논문은 원유의 에스트로겐 효능 및 치료 하수를 제거하고 물을받는 선진국과 신흥 폐수 처리 공정의 수의 효능을 평가하기 위해 화학 및 생태 독성 실험실 분석의 배터리의 사용을 설명합니다.

프로토콜

윤리 문 : 물고기 화학 물질 / 혼합물의 활동을 방해 내분비을 평가하기위한 프로토콜 브루넬 대학 런던의 동물 복지에 의해 승인 된 동물에서 윤리적 검토 기관 (AWERB)과 영국 홈 오피스로 (과학적 절차) 법 1986.

1. 물 샘플 수집, 보존 및 추출

1. 샘플 수집 및 보존
   1. 적합한 표면 활성 세정제로 병을 사용 청소하기 전에. 청소 후, 물, 배수 및 건조로 병을 씻어.
   2. 질산 구리 0.5 g, 6 mL의 3.6 M 염산 용액으로 이루어진 보존제를 함유하는 2 L 용량의 유리 병에 시료 수집. 10 ° C 이하에서 보관할 샘플. 추출 가능한 다음의 수집 및 보존 즉시 분석 할 수 있습니다.
2. 샘플 추출 및 (스테로이드 에스트로겐 분석) 청소 ⁽¹⁰⁾
   1. 고체 상 추출 (SPE)
      1. 추출에 앞서, 1 ㎛ 기공 크기의 필터 종이를 이용하여 부유 물질, 여과 물 샘플을 감소시킨다.
         1. 2,4,16,16-D ₄ -17β - 에스트라 디올 (E2) : 일단-D 2,4,16,16 ₄ -estrone 포함 중수 소화 내부 표준 원액을 급상승 100 μl를 추가하여 내부 표준, 스파이크 샘플을 필터링 : 및 2,4,16,16-D ₄ -17α-에 티닐 에스트라 디올 (EE2) (전체 40 μg의 메탄올 / L에서) 1,000 ㎖의 유출 물 (100 ml의 유입) 하수 2 NG / L의 내부 스파이크의 결과에 유출 물 샘플 및 하수 유입 샘플 20 NG의 /의 L.
      2. 특수 목적 장치에 일회용 밸브 라이너, 스티렌 디 비닐 벤젠 SPE 카트리지 및 카트리지 저수지를 연결합니다. 장비를 테스트하기 위해 진공 펌프에 스위치가 적절하게 밀봉된다.
      3. 피펫 각 저장조에 에틸 아세테이트 5 ㎖를, 카트리지를 조정한다. 진공 펌프 (10 inHg와 분당 10 ㎖ 미만의 유량을 허용 이하) 스위치액체를 빼냅니다. 특수 목적 카트리지를 건조하게하지 마십시오. 물 5ml 다음에 메탄올 5 mL를 반복 과정.
      4. 물 각 카트리지 탱크를 상부 및 카트리지 저장소 유리 샘플 병 사이에 1/8 "PTFE 튜브를 연결한다. 분 미만 10 ㎖의 유속으로 진공 켜고 샘플 전체가 카트리지를 통과 할 수있다. 폐기물 플라스크가 필요 웁니다.
      5. 철저하게 (예를 들면, 짙은 갈색 빛 갈색으로) 색상을 변경 진공 카트리지 내용까지 (공기 또는 질소를 사용하거나)가 SPE 카트리지를 건조.
      6. 추출 매니 폴드 내부 랙과 장소에 깨끗하고 건조 10 ml의 유리 수집 튜브를 넣습니다. 각 라이너는 유리 병 위에 있는지 확인합니다. 피펫 (8), 진공 펌프 (분당 10 ㎖ 미만의 유량)에 대한 각 샘플 저장조에 디클로로 메탄, 스위치 ㎖의 통해 수집 튜브로 액체를 당긴다.
      7. 특수 목적 매니 폴드에서 10 ml의 튜브를 제거1 ml의 볼륨을 줄이기 위해 집중 장치를 사용합니다. 자동 샘플러 바이알에 각각의 샘플을 전송하고 더 질소 블로우 다운 장비를 사용하여 100 μL에 집중한다.
   2. 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC) 청소
      1. . 표 1에 기재된 조건을 사용하여 GPC 장착 된 HPLC로 용출 시료 추출물의 95 μl를 주입 한 GPC는 집중과 질소 장치를 폭파 한 후 헥산 2.0 ml의 구성 사용하여 200 ㎕를 아래로 추출 집중.
   3. SPE 청소
      1. 특수 목적 매니 폴드에 일회용 밸브 라이너, 아미노 프로필 카트리지 및 카트리지 저수지를 연결합니다. 추출 매니 폴드 내부 랙과 장소에 깨끗하고 건조 10 ml의 유리 수집 튜브를 넣습니다. 피펫 각 저장조로 헥산 2 ml를, 카트리지를 조정한다. 액체가 카트리지를 통과 할 수 있습니다.
      2. 저수지에 GPC 샘플 추출 피펫 다시에 액체를 수카트리지를 통과. 유리 병에 샘플 용출액을 수집하고 매니 폴드에서 제거합니다. 용출액을 버리지 마십시오.
      3. 랙에 새로운 깨끗하고 건조 10 ml의 수집 병을 넣고 추출 매니 폴드 내부에 배치합니다. 카트리지를 세척 저장조 헥산 (30 % v / v)의 에틸 아세테이트를 가하여 2 카트리지를 통해 액체를 끌어한다. 모든 세척액을 폐기, 헥산 중 에틸 아세테이트의 추가 2 ㎖로 반복한다.
      4. 다시 추출 매니 폴드 내부 랙에 원래 10 ml의 수집 유리 병 (단계 1.2.3.2)을 놓습니다. 피펫 아세톤, 아세트산 에틸 2 ㎖ (50 % v / v)의 탱크로 진공 펌프를 켜고 바이알로를 통해 액체를 끌어 (2 inHg와 분당 미만이 용액의 유속을 허용하도록 이하) . 또 다른 에틸 아세테이트 2 ml의 과정을 반복한다.
      5. 샘플 병을 제거하고 1 ml의 추출물 볼륨을 줄이기 위해 집중 장치를 사용합니다. t 증발, 장비를 날려 작은 유리 병에 샘플을 전송하고 질소를 사용그는 초기 건조 압축을 풉니 다.
      6. 메탄올 100 ㎕를 넣고 잘 섞는다. (0.3 ml의 인서트) 자동 샘플러 바이알에 추출물을 전송하고 유리 병 캡. LCMS / MS를 사용하여 샘​​플을 분석한다 (섹션 2 참조).

기둥:	PL 겔, 50 A, 300 X 7.5 mm, 5 μm의
가드 칼럼 :	PL 겔 50 X 7.5 mm, 5 μm의
이동상 :	디클로로 메탄
유량 :	분 당 1 ml의
칼럼 온도 :	25 ° C
UV 검출기 :	210 nm의
주입량 :	95 μL
주입 모드 :	대ARD
속도를 그리기 :	분 당 500 ml의
속도를 꺼내기 :	분 당 500 ml의
위치를 그리기 :	3mm
분획 수집 :	3 ㎖ 분획 (7-10 분) 10 ㎖의 유리 병에

표 1 조건 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)를 추출 폐수 샘플의 청소에 대한 파라미터. 표 GPC 컬럼, 이동상, 온도 주입량 및 검출기 파장 사항.

3. (효모 에스트로겐 화면에 대한) 샘플 추출
   1. 섹션 1.2.1.1에서 상세한 필터 샘플. 특수 목적 장치에 일회용 밸브 라이너, C18 SPE 카트리지 및 카트리지 저수지를 연결합니다. 장치를 테스트하기위한 진공 펌프의 스위치를 적절하게 밀봉된다.
   2. 각 저장조 피펫 5 ml의 메탄올의 C를 컨디셔닝하도록18 카트리지. 를 통해 1 분 반 방법을 일시 중지, (분당 약 5 ML의 흐름을 허용하는 약 5 i​​nHg와에)와 통해 액체 실행하자 진공 켭니다. 카트리지가 건조 실행하자하지 마십시오. HPLC 등급 또는 이중 증류수 중 하나와 반복 과정 (DDH ₂ O). 다시 건조 실행되지 않습니다.
   3. 섹션 1.2.1.4에 설명 된대로 물 샘플의 압축을 풉니 다. 완전히 건조 카트리지를 적어도 30 분 동안 진공을 계속한다.
   4. 추출 매니 폴드 랙에 깨끗하고 건조 10ml를 수집 튜브를 놓습니다. 각 라이너는 유리 병 위에 있는지 확인합니다. 각 저장소에 메탄올 5 mL를 추가합니다. 진공 (5 ml / 분의 최대 유량)의 전원을 켜고 액체 통해 2 분 반 방법을 일시 중지, 유리 병에 카트리지를 통과 할 수 있습니다.
   5. 앞서 YES 스크린을 사용하여 분석을 질소를 사용하여 초기에 건조 추출물을 줄이고 500-1,000 μL 에탄올로 재구성한다. 증발을 방지하기 위해 샘플 병의 뚜껑을 밀봉 (4 ° C에서 유지 불꽃 무료냉장고).

LCMS / MS를 사용하여 2. 화학 분석

1. 제조업체의 지침을 사용하여 LCMS / MS 시스템의 동작 조건을 최적화한다.
2. 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석 조건을 사용하여 캘리브레이션 표준 용액 시료 추출물 빈 및 분석 품질 관리 (AQC) 샘플을 분석하고, 표 2에 설명 된대로, 이온 전이를 모니터. 내부 이용한 시료 추출물 스테로이드 에스트로겐의 농도를 결정 표준 ^10.

LCMS
액체 크로마토 그래피
기둥:	C18 (2), 150 X 4.6 mm, 5 μm의.
주입량 :	20 μL
흐름:	분당 0.5 ㎖의.
엠모 바 단계 :	용매 A : 0.1 %의 암모니아를 함유하는 물.
	용매 B : 아세토 니트릴.
그라데이션 프로그램 :
시간 (분)	0	(10)	(18)	(24)	(28)
A : B 용매 비율	90:10:00	50:50:00	0.479167	0.479167	90:10:00
질량 분석
출처:	전기 분무 (음이온)
가스와 출처 :	CUR : 20 PSI, GS1 : 70 PSI, GS2 : 30 PSI
	TEM : 600 °의 C, CAD 가스 5 IonSpray 전압 -900
MRM 전환 :
E1 :		145분의 269 & 143분의 269
E2 :		145분의 271 & 143분의 271
EE2 :		145분의 295 & 143분의 295
E1-D4 :		147분의 273
E2-D4 :		147분의 275
EE2-D4 :		145분의 299

표 2. 세부 매개 변수 및 폐수 추출물 스테로이드 에스트로겐의 LCMS / MS 분석을위한 조건. 표는 속도, 이동상 조건 a를 시료 주입 볼륨을 제공하고 흐름차의 그라데이션.

체외 효모 에스트로겐 화면에서 사용 3. 에스트로겐 활동 (YES) 분석 ⁽⁸⁾

1. 준비 및 (a) (g)을 표 3에 따라 최소 배지 및 배지 성분을 저장한다.

(a) 최소 배지 (PH 7.1)

철 2 (SO 4) 이중 증류수 3-50 ㎖ (DDH 2 O) 40㎎을 첨가하여 철 2 (SO 4) 3 용액을 준비

추가 1 L의 DDH 2 O 2 L의 유리 비커에

비커에 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 :

13.61 g의 KH 2 PO 4

1.98 g (NH 4) 2 SO 4

4.2 g의 KOH

0.2 g 황산

유한 요소 2 (SO 4)를 1 ml의 3 솔루션

50 mg을 L-류신

50 mg을 L 히스티딘

50 mg의 아데닌

20 mg을 L 염산 아르기닌

20 mg을 L 메티오닌

30 mg을 L 티로신

30 mg을 L 이소류신

30 mg을 L 염산 리신

25 mg을 L 페닐알라닌

100 mg을 L 글루타민산

150 mg을 L 발린

375 mg을 L 세린

자기 벼룩와 가열 교반기에 비커를 넣고이 모두 녹을 때까지 저어

pH가 7.1 인 것을 확인하고 필요한 경우 조정

50 ㎖의 멸균 주사기 금속 나사 상단 뚜껑 유리 병에 45 ml의 분취 량을 분배하여

오토 클레이브를 10 분 동안 121 ℃에서 최소 배지 멸균

실온에서 보관

(b) D - (+) - 글루코스 :

DDH 2 O 20 % w / V 수용액을 준비

금속 나사 상단 뚜껑 유리 병에 20 ml의 분취 량을 분배

오토 클레이브를 10 분 동안 121 ° C에서 포도당 용액을 소독

실온에서 보관

(c) L 아스파라긴산 :

DDH 2 O 4 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 제조

금속 나사 상단 뚜껑 유리 병에 20 ml의 분취 량을 분배

오토 클레이브를 10 분 동안 121 ° C에서 L 아스파라긴산 용액 살균

실온에서 보관

(라) 비타민 해결 방법 :

DDH 2 O 100 ㎖ 비오틴 2 mg을 첨가하여 바이오틴 용액을 준비

8 mg을 티아민, 8 mg을 피리독신, 8 mg의 판토텐산, 40 mg의 이노시톨을 무게. 180 ml의 2 O의 DDH 모든 건조 성분과 비오틴 용액 20 ml를 추가

층류 공기 유동 캐비닛, 무균 유리​​ 병에 0.2 μm의 공경 일회용 필터를 통해 여과하여 멸균 10 ㎖ 분취 량을 만들기

저장 4 ° C에서

(전자) L-트레오닌 :

DDH 2 O 24 ㎎ / ㎖의 L- 쓰 레오 닌의 100 ㎖를 준비

금속 나사 상단 뚜껑 유리 병에 10 ml의 분취 량을 분배

오토 클레이브를 10 분 동안 121 ℃에서 L- 쓰 레오 닌 용액을 소독

실온에서 보관

(F) 구리 (II) 설페이트 :

DDH 2 O를 20 mM의 구리 (II) 설페이트 용액 25 ㎖를 준비

층류 캐비닛, 무균 유리​​ 병에 0.2 ㎛의 세공 크기 필터를 통해 여과하여 멸균 5 ㎖ 분액을 만들기

실온에서 보관

(g) 클로로 페놀 레드-β-D-갈 락토 (CPRG) :

DDH 2 O에 CPRG의 10 ㎎ / ㎖ 용액을 25 ml의 준비

층류 캐비닛, 무균 유리​​ 병에 0.2 ㎛의 세공 크기 필터를 통해 여과하여 멸균 5 ㎖ 분액을 만들기

저장 4 ° C에서

표 3. 효모 에스트로겐 화면 분석; 준비와 최소 배지 및 배지 성분의 저장.

2. 준비 및 스토10 배 농축 효모 문화의 GE의
   1. 1 일에, 성장 매체를 준비 (3.4.1에 설명 된대로) 및 멸균 삼각 플라스크에 붓는다. -20 ° C에 저장 극저온 유리 병에서 10 배 농축 효모의 125 μl를 추가합니다. 궤도 통에 약 24 시간 동안 28 ° C에서 접종 미디어를 품어.
   2. 2 일에, 성장 매체 (~ 50 ㎖)의 두 병을 별도의 멸균 원뿔 플라스크에 붓는다. 성장 미디어의 각 플라스크에 넣고 24 시간 배양 한 효모의 1 ML을 추가합니다. 궤도 통에 약 24 시간 동안 28 ° C에서 접종 미디어를 품어.
   3. 3 일에, 멸균 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에 각 24 시간 문화를 붓는다. 2,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 50 ml의 튜브. 상층 액을 붓고, 15 % 글리세롤로 최소 배지 5 ㎖에 각각의 펠릿을 다시 일시. 사개월의 최대 -20 ° C에서 멸균 크리오 바이알 (cryovial) 및 저장 1.2 ml의 10 배 농축 효모 문화의 0.5 ml의 분취 량을 확인합니다.
3. 처리장표준 곡선 배급 및 저장 화학 주식
   1. 무수 에탄올로 두 번 모두 유리와 주걱을 세척하여 오염 물질의 흔적을 제거하기 위해 사용하기 전에 건조 둡니다.
   2. 분말 무게 캐비닛 유리 병에 직접 E2를 달아 무수 에탄올의 부피 농도를 조정합니다. × 10 ^-6 M (54.48 μg의 / L)의 농도로 희석한다. 물개 뚜껑 및 저장 4 ° C에서 (불꽃없는 냉장고에).
4. 분석 생산
   1. 0 일에서 성장 매체를 준비합니다. 최소 배지 45 ml를 용기에 5 ml의 글루코스 용액, 1.25 mL의에 L 아스파르트 산 용액을 0.5 mL의 비타민 용액, 0.4 ml의 L- 쓰 레오 닌 용액, 125 μL, 구리 (II) 설페이트 용액을 추가한다. 멸균 삼각 플라스크로 성장 매체를 따르십시오.
      1. 플라스크에 (-20 ° C 저장 영역에서 해동) 10 배 농축 된 주식의 125 μl를 추가하고 궤도 통에 약 24 시간 동안 28 ° C에서 접종 미디어를 품어.
   2. 1 일에, 멸균 96 웰 '희석 판'레이블 및 E2 표준 곡선과 시험 물질 (들) / 유출 추출물 (들) (예를 들어, EE2)의 (에탄올 100 μL 볼륨)를 연속 희석을합니다.
   3. 라벨 멸균 96 웰 광학 평평한 바닥 마이크로 타이 '분석 플레이트 (들)'. 모든 접시에 시험 물질 (들) / 유출 추출물 (들)의 행에 추가 공백 (플러스 / 마이너스 용매)과 E2 표준 곡선을 포함한다.
   4. 피펫 분석 플레이트의 적당한 웰에 각 농도의 10 μL (E2, 화학적 또는 추출). 피펫 분석 플레이트의 각 "빈 용매"웰에 에탄올 10 μL. 증발 건고 할 수있는 뚜껑으로 분석 플레이트를 남겨주세요.
   5. 성장 매체 (~ 50 ㎖)의 병을 확인하고 병 당 클로로 페놀 0.5 ml의 붉은-β-D-갈 락토 (CPRG) 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 접시 리더에서 620 nm에서 문화의 탁도를 측정하여 24 시간 배양 효모 세포의 밀도를 결정합니다. ㄱ 접종24 시간 배양에서 4 × ⁷ 효모 세포와 ssay 매체.
   6. 멸균 통에 접종 분석 매체를 따르십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 96- 웰 분석 플레이트의 각 웰에 접종 분석 배지 200 μl를 추가한다.
   7. 96- 웰 분석 플레이트에 넣고 뚜껑을 테이프로 모서리를 밀봉. 역가 플레이트 통에 2 분 동안 격렬하게 분석 플레이트 (들)을 흔들어 및 자연 환기 가열 캐비닛에 32 ° C에서 품어.
   8. 2 일에 적극적으로 2 분에 대한 역가 플레이트 통에 분석 플레이트 (들)을 흔들어. 32 ° C 배양기로 돌아갑니다.
   9. 4 일에, 역가 플레이트 통에 2 분 동안 격렬하게 분석 플레이트 (들)을 흔들어. 플레이트 판독기를 사용하여 다음 약 1 시간 동안 서 540 나노 미터 (CPRG ~ 575 nm의 최적의 흡광도)와 (탁도의 경우) 620 나노 미터의 흡광도에서 분석 플레이트 (들)을 읽을 판 (들)을 둡니다. 실온에서 플레이트 (들) 및 필요한 경우 나중에 읽기를 남겨주세요.
5. 에스트로겐 활성을 계산 <올>
6. 다음 방정식을 사용하여 탁도에 대한 올바른 분석 수치 : 수정 값 = 샘플 또는 540 nm에서 표준 (E2) 흡수 - [620 nm에서 시료 또는 표준 (E2) 흡수 - 620 nm에서 빈 흡광도]. 적절한 공백 (오염을 확인하기 위해)와 플롯 E2 표준 곡선 ^8.
7. '에스트라 디올 균등'을 계산하는 보정 된 샘플 (추출물 또는 화학 물질)를 사용합니다. / 샘플을 보간 E2 해당하는 값으로 흡광도 값을 추출 플롯 E2 표준 곡선 값과 회귀 식 (3 매개 변수 다항식 또는 선형 피팅에 따라)를 사용합니다. 사용 농도 계수 (즉, 물 추출과 에탄올의 부피 추출액에 재 현탁) 사전 추출 된 샘플에서 에스트로겐 활성을 계산한다.

남성 얼간이 황어 생체 Vitellogenin 유도에 사용 에스트로겐 활동 4. 실험실 기반 평가

1. (진흙 새우를 남성 얼간이 황어를 사용하여promelas)> 이차 성징을 (표시 된 사개월, 즉, 결혼식 결핵의 개발과 남성의 성적 결정을 나타내는 지느러미 fatpad).
   1. 산란 행위를 방지하기 위해, 별도의 성숙 시험 개시전 삼주 (± 3 일) 수컷. 3g / L의 최대 부하와 두 개 이상의 45 L 유리 수족관을 설정합니다. 시험에 건강한 물고기의 적절한 숫자를 보장하기 위해, 100 명의 남성의 최소 사용합니다.
   2. 테스트에서 경험하는 바와 같이 동일한 환경 조건에서 남성 물고기를 유지 (즉, 25 ± 1 ° C의 물 온도와 16 : 8 시간 빛 : 어두운 광주). 즉, 적어도 매 6-8 시간의 95 % 여분의 시간을 보장하기 위해 각각의 탱크에 희석 물의 흐름 속도를 유지하는 45 L 탱크 330 ml / 분.
2. 시험 장치 및 실험 설계
   1. 와트의 리터 당 물고기의 최대 3 g의 하중을 수용하기 위해 대형 유리 탱크를 사용하여어. 8 성인 남성 (명목상 4.5 g 각)를 들어, 10 ~ 20 L 탱크를 사용합니다.
      1. 각각의 치료를 위해 두 개의 복제 탱크를 사용하고 불필요한 시각 장애에서 각 탱크를 보호 (즉, 탱크 사이에 적층 카드 화면을 사용한다). 연구 번호, 노출 농도와 선박 식별 번호로 각 탱크를 식별합니다.
   2. 폐수 배출 연구를위한
      1. 도착 즉시 10 ± 1 ℃에서 저장 탱크로 유출 물을 전송합니다. 유출 물을 수령 한 두 시간 내에 유출 물을 먹이지 시작합니다.
      2. 순응 용기에 10 ° C 저장 탱크에서 연동 펌프를 통해 유출 물을 공급. 18 ± 2 °의 C에 순응 용기에 유출 물을 가열한다. (물고기를 보유하고있는) 시험 수족관​​에 다음 정량 / 혼합 용기에 순응 용기에서 가열 된 유출 물을 펌프합니다. 25 ± 1 ℃의 온도로 가열 수조.
   3. 화학 물질 투여 연구
      1. 분말 무게 캐비닛에 테스트 화학 물질의 무게를. 바람직하게는 용매를 사용하지 않고 DDH ₂ O에 집중 화학 주식을 준비합니다.
         주 : 용매 시험 화합물을 용해하는 데 필요한 경우 희석 제어 외에 컨트롤 용매를 사용한다.
      2. 용기를 혼합 투여에 유량 제어 장치 (들)를 통해 온도 조절 헤더 탱크 /에서 중력 공급 또는 펌프 희석. 펌프 용기를 혼합 / 정량으로 연동 펌프 시스템을 이용한 화학 스톡 (들)을 농축시켰다. 원하는 노출 농도를 달성하기 위해 물 유속 (희석) (스톡 화학) 펌프 속도를 조절.
         참고 : 사용 실리콘 튜브 용기를 혼합 / 투약에서 각 시험 용기에 물 / 시험 물질을 공급하는. 적어도 24 시간에서 75 % 용기 교체를 제공하기에 충분한 유속으로 20 L의 탱크 즉, 20 ml / 분을 사용한다. 지정된 공칭 값의 ± 10 %의 유량을 유지한다.
   4. (25 ° C에서 5.8 mg을 ^L-1) 25 ± 1 ℃에서 노출 탱크 수온 공기 포화 값의 70 % 이상의 용존 산소 및 연구 내내 (6.5 내지 8.5의 pH를 시작) ± 0.5의 pH 단위를 유지한다. 16 시간 빛의 광주에 조명 조건을 설정 : 8 시간의 어둠을, 20 분의 새벽 / 황혼의 전환 기간에.
   5. 물고기 2.5 (± 0.1)에서 갓 해동 냉동 성인 소금물 새우 (아테)와 하루에 두 번 공급 당 탱크 당 g 피드. 또한 열대 플레이크 물고기 음식을 소량 (두 손가락 핀치)으로 하루에 한 번 물고기를 먹이. 각 피드 사이에 3 시간의 최소를 남겨주세요.
      1. (컨트롤에 비해 좋은 중간 또는 가난한) 공급 응답 / 동작을 모니터링하기 위해 매일 공급 기록을 유지합니다. 어떤 먹다 남은 음식과 배설물을 제거하기 위해 두 배 이상 (바람직 매일) 주 탱크를 사이펀. 적어도 일주일에 한 번 시험 용기의 측면과 바닥을 청소합니다.
   6. 주간 물 샘플을 채취각 탱크에서들 (분석 화학을 통해) (효모 화면을 통해) 에스트로겐 활성 및 화학 성분을 확인합니다. 물 표본 추출, 추출 및 분석에 대한 자세한 내용은 섹션 1-3를 참조하십시오.
      주 : 각 실험에서, 투여 량 반응을 모니터링 희석 제어 (음성 대조군), 양성 대조군 (E2 또는 EE2) 플러스 폐수 (100, 50 및 25 %)의 적어도 세 희석액 또는 시험 물질을 사용한다. 새로운 기술을 테스트하는 경우, 치료 또는없이 화합물 / 유출 물을 사용 (치료없이 예를 들어, EE2, 타미 / 과산화수소와 EE2 (H ₂ O ₂₎ 치료 ^(12)도 1).

타미 / 과산화수소 수처리을 사용하여 17α-에 티닐 에스트라 디올의 생태 독성의 제거를 결정하는 생체 얼간이 미노 vitellogenin 생물 검정의 실험 설계를 나타내는 그림 1. 다이어그램. 특급설정 erimental는 팔 (11) L 유리 어항의 물을 연속적인 흐름과 각 공급으로 구성되어 있습니다. 개별 화학 원액과 물 (필터링 탈 염화)는 혼합 챔버로 전달된다. 혼합 용기에 (반응 없음) 공칭 농도는 2 NG / L EE2, 80 nM의 타미 0.16 μg의 / LH ₂ O _2이다. 화학 재고 솔루션 (EE2, H ₂ O _2와 타미)을 준비하고 반응이 혼합 용기에 시작하도록 개별적으로 투여한다. 물고기 (탱크 당 8 남성 얼간이 황) 약 45 분의 반응 접촉 시간 후 혼합물 (들)에 노출되어있다. 물 샘플은 매주 노출 탱크에서 가져옵니다. 혈장 샘플은 연구 개시시,베이스 라인 그룹에서 에스트로겐 바이오 마커 vitellogenin (VTG)을 측정하는 얼간이 황에서 찍은 노출 21 일 후에 다른 물고기. 특정 치료는 다음과 같습니다 '-C'; 음성 대조군 (희석 만), '+'; EE2의 양성 대조군'+ H'; EE2 플러스 H ₂ O _2, '+ T'; EE2 플러스 H ₂ O ₂ 플러스 타미. 이 그림은 밀스 등. 2015 ^12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 시험 절차
   1. 적응 기간
      1. 각 성적으로 성숙한 수컷 물고기의 습 중량 (g)을 측정하고 각각의 탱크 (탱크 당 8 남성)에 무작위로 할당합니다.
      2. 같은 배치에서 할당되지 않은 물고기를 유지하고 동일한 테스트 조건을 유지한다. 물리적 손상 또는 7 일간의 적응 기간 동안 조건의 부족의 징후를 보여 어떤 개인을 대체하는이 물고기를 사용합니다. 각 처리 조 완전히 테스트 조건에 적응 한 8 명의 남성을 갖는 순응 기간 말에 확인.
      3. 같은 바에서 추가로 8 명의 남성에서 '기본'플라즈마 샘플을 채취남성 물고기의 TCH. 4.4 절에서 혈액 샘플링 방법 및 4.5에서 Vitellogenin (VTG) 분석 방법을 따르십시오.
   2. 4.2.2 또는 4.2.3에 설명 된대로 적응 기간 후 21 일 동안 노출 탱크에 유출 물 또는 화학 물질 투여 주식을 제공합니다. 모니터 사망률, 행동과 각 물고기의 외모는 하루의 제 1 공급 매일 전에 탱크를 복제합니다. 비정상적인 행동이나 사건을 기록한다.
      참고 : 환경 조건을 확인하고 공급 비율은 물고기의 건강 (섹션 4.2.4과 4.2.5)를 유지한다.
4. 21 일간의 노출 기간 후에 생선 샘플링
   1. 이전 샘플링에 12 시간은 물고기를 먹이를 중지합니다.
   2. 혈액 샘플을 수집 라벨 마이크로 원심 분리 튜브, 아프로 티닌 ~ 5 μL (프로테아제 억제제)를 첨가하고, 얼음에 배치.
   3. 탈 염소 처리 물 1 L 당 MS222 500mg을 용해 MS222 (마취제)의 500 ㎎ / ℓ 용액을 (이전 순화25 ± 1 ° C까지). 1 M의 NaOH를 사용하여 pH를 7.4 ± 0.4로 MS222을 중화.
   4. 버퍼링 된 MS222로 탱크에서 각 물고기를 이동합니다. 모든 아가미 운동 (일반적으로 5 ± 1 분)의 중단 때까지 용액에 보관하십시오.
   5. 측정 단자 마취 포크 길이 (mm)를 기록한다. 꼬리를 절단하고, 꼬리 동맥 (그림 2)에서 피를 수집하기 위해 헤파린 hemocrit 튜브를 사용하는 일회용 메스를 사용합니다. 조심스럽게 미리 라벨링 microcentrifuge 관에 혈액을 분배하고 얼음에 보관하십시오.
   6. 피를 그린 후 즉시 물고기를 죽일. 순환 및 / 또는 뇌의 파괴의 영구 중단에 의해 죽음을 확인합니다. 측정하고 전체 물고기의 무게 (가까운 0.01 g)을 기록하고 필요에 따라 조직을 해부하다.
   7. 컬렉션의 2 시간 이내에 혈액 (4 ° C에서 5 분 동안 7,000 XG)를 원심 분리기. 새로운 레이블 0.4 ML의의 microcentrifuge 욕조에 피펫을 사용하여 플라즈마 뜨는을 전송얼음 에스 저장. VTG 혈장 농도 분석 전에 -80 ℃에서 원심 분리하고 저장 30 분 이내에 건조 얼음 함유 플라즈마 튜브를 고정.

그림 남성 얼간이 미노 (진흙 새우 promelas), 플라즈마 수집 및 고환의 위치를 묘사 2. 사진. 모든 물고기가 혈액 샘플을 수집 살해해야하는 21 일간의 노출의 끝에서. 일단 신속하게 측정 꼬리 동맥에서 채혈 한 다음해야이 터미널 마취 물고기 길이 (포크 길이, mm) 아래 사진-A :. 빨간색 점선은 (일회용 메스가 꼬리를 절단하는 데 사용되어야 꼬리 절단에 대한 위치를 나타냅니다 ). 포토 B는 혈액을 수집하기 위해 사용되는 헤파린 hemocrit 튜브를 나타낸다. 그 혈액 샘플을 촬영 한 후 각각의 물고기는 다음이 경우 전체 머리에 즉시 사망한다몸 (사진-C)에서 절단되었다. 물고기가 살해되면 체강은 내부 장기를 공개하도록 열 수 있습니다. 사진-C 등 잉어 물고기, 예를 들어, 얼간이 미노, 바퀴벌레, 잉어,의 부레 (SB)와 관련하여 고환 (생식선)의 위치를 보여줍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 얼간이 황어 위해 특별히 설계된 동종 VTG의 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트 플라즈마 VTG 농도를 측정한다.
   1. 제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 VTG 표준 및 버퍼를 준비합니다. 5000, 1 : 혈장 샘플 1시 50분 1 희석 500,000 및 제조업체의 지침에 따라, VTG 표준 곡선의 범위 내에서 측정 값을 얻기 위해 중복을 분석. vitellogenin 농도를 계산하는 제조업체의 지침을 따르십시오.

고급 / 소설 폐수 처리 기술 5. 현장 평가는 로치의 생체 Vitellogenin과 성별 간 유도 (Rutilus의 rutilus)에서 사용 에스트로겐 활성을 완화하기

1. 야생 바퀴벌레의 캡처 폐수 처리 공장 배출구의 스트림을 살고
   참고 : 자웅 이체 및 에스트로겐 내분비 계 장애 물질에 민감한 것으로 알려져 있습니다 사용 바퀴벌레 (Rutilus의 rutilus) 또는 다른 풍부한 담수 나 염수 물고기 종.
   1. 캐치 물고기, electrofishing를 사용하여 그물, 트래핑 또는 상황 ^(13)에 따라 다른 인식 낚시 방법. 샘플링을위한 실험실로 다시 폭기 탱크에서 물고기를 운반 할 것.
   2. 4.4.2에 설명 된대로의 microcentrifuge 튜브를 준비합니다. 4.4.3에 설명 된대로 MS222을 버퍼를 준비. 4.4.4에 설명 된대로 물고기를 마취.
   3. 터미널 마취에서 물고기의 길이와 무게를 측정한다.
   4. 꼬리 동맥 사용 DISPO에서 혈액을 수집검은 담비 헤파린 주사기입니다. 즉시 혈액 샘플 수집 후 각 물고기를 죽일. 조심스럽게 사전 표지의 microcentrifuge 튜브에 혈액을 분배하고 얼음에 보관하십시오. 단계 4.4.7에 설명 된대로 플라즈마를 준비하고 ELISA (4.5)에 의해 VTG를​​ 측정한다.
   5. 집게 각 물고기에서 2-3 물고기 비늘을 제거하고 개별적으로 표시된 작은 종이 봉투에 배치하여. 나중에 물고기 나이 판별 및 성장 분석을위한 건조 상태의 실온에서 보관 봉투.
   6. 메스 오픈 체강은 내부 장기를 공개합니다. 양쪽에있는 생식선 (그림 2)와 부레를 공개 창자를 꺼내. 조심스럽게 유리 병에 잘 코 집게와 장소 쌍의 생식선을 제거합니다. 1시 10분 조직의 비율로 Bouin의 정착과 생식선을 커버 : 정착액.
   7. 조직의 크기 (정착은 시간 당 1mm에서 침투)에 따라 6-24 시간 동안 Bouin의에서 조직을 둡니다. 고정 된 후에는 Bouin의 고착성을 부어70 % 산업용 변성 알코올 (IMS)로 교체 거라고. 조직은 조직 병리학 (5.3 절)에 대한 처리 될 때까지 실온에서 고정 된 조직을 저장합니다.
2. 바퀴벌레의 생체 vitellogenin 및 성별 간 유도을 사용하여 에스트로겐의 활동이 필드를 기준으로 평가
   1. 실험 설계 및 설정
      참고 : 생체 작업 시작의 사전에 탱크 및 파일럿 플랜트를 설정합니다. 시스템에 물고기의 또한 이전에 3-4주 흐르는 탱크를 시작합니다. 물 유량, 수질 확인 파라미터를 확인하기 위해 정기적 조건 (PH, 온도, 용존 산소 등)를 모니터링하는 것은 유지 될 수있다.
      1. 큰 탱크를 구축합니다 (예 : 300 - 1,000 L) '제어'를받을 수있는 파일럿 플랜트에서 사이트는, 염소화 드 수돗물, 표준 처리 폐수 (들) 및 병렬 처리 폐수 (들)을 전진. 탱크에 공기 펌프 / 에어 레이터를 연결합니다. 집합 물 유속은 적어도 6 개의 탱크 V를 달성하루 olume 교환.
         참고 : 확인 탱크 잘 절연 과도한 매일 온도의 변동을 방지하기 위해 음영 확인하십시오. 디자인 탱크는 행동 변화 (공급 부족 등), 질병과 사망의 징후 물고기의 관찰을 허용합니다.
   2. 1 시간 동안 각각의 탱크 (물고기 농장에서) 바퀴벌레의 가방을 부동하여 노출을 시작합니다. 서서히 물 온도까지 가방에 탱크의 물을 추가하고 조건은 주변입니다. 자신의 탱크에 물고기를 놓습니다.
   3. 펠렛 물고기 음식 (크기 0.5-0.8)에서 매일 성인 바퀴벌레를 공급. 먹지 공급에 기초하여 조정 작은 펠렛 (펠렛 크기 100-300) 비 - 에스트로겐 피드 ¹⁴ 수의, 매일 청소년 ​​바퀴벌레 피드. 매일 먹이 기록 문서화 공급 응답 / 동작을 유지 (컨트롤에 비해 온건 또는 가난한 사람, 좋은).
   4. 에스트로겐 활성 및 화학 성분을 확인하기 위해 각각의 탱크에서 매주 물 샘플을 가져 가라. 자체물 시료 채취 및 분석 방법에 대한 자세한 내용은 전자 섹션 1-3.
3. 물고기의 조직 병리학은 ¹⁵ 생식선
   1. 조심스럽게 커팅 보드에 핀셋과 장소 컨테이너에서 (단계 5.1.6과 5.1.7에서 설명) 해부 및 고정 생식선을 제거합니다.
   2. 3 부 (전방, ​​중앙 및 후방)로 각 부분이 3-5 mm 두께의 단면을 절단에서 각각의 생식선을 잘라 마이크로톰 블레이드를 사용합니다. 조심스럽게 레이블 플라스틱 생검 카세트에 여섯 조각을 배치하고, 표 4에 열거 된 타이밍을 이용하여 조직을 프로세서에 놓습니다.
   3. 왁스 포함 조직 및 로터리 마이크로톰 (3-5 μm의) 섹션. (45 ° C로 설정) 가열 접시에 표시된 바이오 접착제 코팅 된 유리 슬라이드와 장소 슬라이드로 전송 섹션은 24 시간 동안 건조합니다.
   4. . 수동 또는 표 5에 설명 된 타이밍을 이용하여 자동 염색기를 이용하여 슬라이드 얼룩 스테인드 조직에 부착 제의 드롭을 배치하고, LAY 유리의 조직​​을 보호하기 위해 부착 제를 통해 커버 슬립.
   5. 첫째, 성별을 결정하는 (10X 아이 라인 배율 20 배, 즉 2X 목적) 낮은 배율에서 각 슬라이드와 체강 ^(15)에 첨부 지점의 수를 검사합니다. 각 물고기에 대한 이상을합니다.
   6. 높은 배율 (100X 또는 400X)에서, 배우자 단계, 이상과 고환 조직에서 난자의 존재를 평가하기 위해 조직을 검사합니다. ⁶ (표 6 참조) 7 (100 % 난소 조직) 0에 이르기까지 다음과 같은 등급 시스템 (일반 남성 조직)를 사용하여 성별 간의 심각도를 기록합니다.

단계 수	치료	목적	시간 (시간)
1	70 % IMS	탈수	삼
이	90 % IMS	탈수	2.5
삼	95 % IMS	탈수	1.5
4	100 % IMS	탈수	1.5
(5)	100 % IMS	탈수	1.5
6	100 % IMS	탈수	1.5
(7)	100 % IMS	탈수	1.5
8	조직학 개간 에이전트	청산	1.5
9	조직학 개간 에이전트	청산	1.5
(10)	조직학 개간 에이전트	청산	1.(5)
(11)	밀랍	왁스 침투	1.25
(12)	밀랍	왁스 침투	1.25
			20 시간의 총

표 4. 처리 조직 병리학을위한 조직을 함침 왁스 제도. 조직은 자동 조직 프로세서에서 처리되어야한다. 조직은 시간 동안 카메라를 자세히 설명 된 솔루션에 몰입해야한다.

어떤 얼룩.	얼룩	목적	시간 (분)
1	조직학 용지 에이전트	왁스 용해	(15)
이	100 % IMS	수화	이
삼	90 % IMS	수화	이
4	70 % IMS	수화	이
(5)	수돗물 (RUNNING)	헹구기	이
6	HAEMOTOXYLIN	얼룩 세포 핵 블루	(10)
(7)	수돗물 (RUNNING)	초과 제거	(10)
8	산성화 IMS	탈 염소	20 초
9	수돗물 (RUNNING)	헹구기	20 초
(10)	LICO 3	소금	20 초
(11)	수돗물 (RUNNING)	헹구기	20 초
(12)	1 % 에오신 (수성)	얼룩 세포질 핑크	20 초
(13)	수돗물 (RUNNING)	초과 제거	(5)
(14)	70 % IMS	탈수	이
(15)	90 % IMS	탈수	이
(16)	100 % IMS	탈수	(5)
(17)	조직학 용지 에이전트	IMS, 결합제를 제거	(5)

표 5. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 물고기 성선 조직의 염색에 대한 솔루션 및 침지 시간. 슬라이드는 ALLOC 각 화장실에 배치해야순서대로 시간을 ated. 조직의 H & E 염색은 물고기 생식선에 에스트로겐 폐수 폐수의 개발이나 조직에 미치는 영향을 결정하기 위해 필요합니다.

점수	섹션 설명
0	보통 남성의 고환
1	다 초점은 고환 조직에 흩어져 1-5 난자 (일반적으로 단독)와 난소 고환
이	다 초점 난소 고환은 종종 작은 클러스터의 6-20 난자는 고환 조직에 흩어져
삼	다 초점 난소 고환, 클러스터의 21-50 난자
4	> 50 <100 난자. 제 대개 다발성이고 시험 모자이크 모양을 갖는다icular 및 난소 조직.
(5)	> 100 난자, 일반적으로 다 초점뿐만 아니라 고환 조직에서 분리 난소와 고환 조직을 명확하게 식별 영역이 초점이 될 수 있습니다.
6	섹션에서 성선 조직 %의> 50 난소하고 명확 상피 세포와 탐식 조직에 의해 고환 조직에서 분리된다.
(7)	절에 성선 조직의 100 %는 난소입니다.

표 6. 채점 시스템은 바퀴벌레의 성별 간 상태의 심각도를 평가하기 위해. 조직 학적 성선 조직의 준비된 슬라이드를 광학 현미경으로 관찰해야한다, 20X에서 100X와 400X 배율은, 어떤 이상과 고환 조직에서 난자의 존재를 평가합니다. 이 테이블은 Jo​​bling <에서 수정EM> 등. 2006 ^6.

결과

시도 폐수 처리 공정 개선의 효과를 이해하기 위해 또는 방전 폐수 내분비 교란 활성의 제거 효과에 대해 WWTP 기존에 차 치료로 장치를 개조하기위한 가장 적합한 기술을 결정하는 주요 화학의 측정​​뿐만 아니라 필요 작품을 입력 할뿐만 아니라, 내분비 교란 활성을 가질 수 분해물의 분석이 필요 부품. 국내 하수 폐수에 존재하는 대부분의 에스트로겐 물질은 스테로이드 호르몬, 에스트론 (E1), 17β-에스트라 디올 (E2)과 17α-에 티닐 에스트라 디올 (EE2) ^{5,8입니다.} 스테로이드 에스트로겐 주로 비활성 접합체 ^{(16, 17)의} 혼합물로 본체로부터 배출된다. 이러한 복합 에스트로겐은 실질적으로 세균의 활동에 의해 하수도에 deconjugated하고 더 저하는 폐수 처리 설비에서 발생합니다. deconjugated 스테로이드 아칸소흡착 폐수 스트림에서 제거 E는 슬러지 형성을 초래 차 처리시 생분해, 우선 변환 부산물 결국 전체 광물 초기 활성 성분이 발생할 수있다. 배출 스트림 내의 모든 개별 화합물의 화학 분석 시간과 비용이 소요 어려울 것이고, 시료에 존재하는 알 활성 성분을 포함하지 않을 것이다. 또한, 각 성분의 에스트로겐 기여의 합계는 분석 화합물의 샘플의 누적 에스트로겐 효능의 표시를 제공 할 것이다. 이 변환 프로세스가 알 수없는 에스트로겐 물질 어디서 유입이 산업 기원입니다 발생 위험이다. 생체 내 및 시험 관내 독물학 생물 검정의 화학적 분석을 결합하여 이러한 하수 처리 수의 혼합물의 알려지지 에스트로겐 성분의 존재에 대한 해결책을 제공한다. 예를 들면 효모 에스트로겐 크레아티닌로 시험 관내 분석법을EEN는 (YES) 하수 폐수의 에스트로겐 활성을 측정하고, 처리 된 샘플 ^8,18,19 중에 활성 성분을 식별 할 수 있도록 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 생체 간 및 시험 관내 시험에서의 비교 ⁽¹¹⁾ 중요 할 수 있으며, 내분비 교란 힘의 치료에 대한 새로운 프로세스의 종합적인 평가는 화학 및 생태 독성학 시험의 배터리가 필요합니다.

개별 처리 설비 나 공정이 폐수 스트림에서 활성 화합물을 제거할지 여부의 결정 샘플의 추출, 농축 및 추출 전에 분석의 청소 다음 화학 분석을 이용하여 달성 될 수 있으며, 대부분 LCMS (/ MS) 또​​는 GCMS를 사용하여 수행 (/ MS) 방법. 개별 효과 농도 (PNEC) ²⁰ 또는 환경 품질 표준 예측하지 화학적 분석으로부터 얻은 데이터는 적합성을 결정하기 위해 사용될 수있다의 (EQS) 특정 개인 화합물의 ²¹ 따라서 이러한 방법은 규정 준수 데이터 중요합니다. 또한, 타겟 또는 비 - 타겟 화학 분석 방법은 전체 응답을 제공 생물학적 방법과 비교하여 각각의 화합물 또는 이성질체의 동정 및 정량을 허용한다. 화학 분석 방법에 따라서 개별 화합물의 평가를 충족시키고 개별 처리장 기준이 폐수 처리 문제를 해결하도록 할 수 있습니다. 연구는 합성 호르몬 제거 EE2 덜 효과적인 경향이 있지만, 종래의 폐수 처리 (예를 들면, 활성 오니 식물) 천연 스테로이드 호르몬의 제거에 매우 효과적 일 수 있다는 것을 보여 주었다. 그들은 PRED 이하 EE2를 제거하기 위해 사후 처리 용액으로서 이용 될 수있는 오존과 같은 기술을 이용하여 고도 처리를 이용하여 현장 연구는 입상 활성탄 (GAC) 및 막은 높은 비용이라도 입증영향 수준 icted 및 검출 한계 아래에. 그림 3은 파일럿 규모의 도시 폐수 처리 공장에서 GAC를 사용 EE2의 제거를 보여줍니다. 파이프 GAC 처리 단부를 이용하여 하수 처리장에 파일럿 규모에서 수행 연구는 에스트로겐 효능의 저하 GAC를 수행하면,도 4에 도시 된 바와 같이 효모 에스트로겐 화면 (YES)를 사용하여 측정 나타낸다.

도 3 급 고급 처리 다음에 티닐 에스트라 디올의 제거를 보여주는 예 필드 데이터. (A) 샘플은 샘플의 보존에 대해 기재된 절차에 따라, 종래의 (활성 오니 설비) 처리 이후 처리장에서 채취된다. (B) 시료는 순상 SPE를 사용하여 방해 물질을 제거하는 고체상 추출 세정을 사용해서 추출되고겔 투과 크로마토 그래피. (C) 깨끗한 농축 추출물을 낮은 체적까지 농축하고 MRM 모드 음이온 전기 분무 된 LCMS / MS를 이용하여 분석된다. 결과는 동위 원소 표지 내부 표준을 사용하여 내부의 표준화를 사용하여 계산된다. 도시 된 예에서, EE2 0.1 NG / L의 예측 어떤 효과 레벨 (PNEC) 이상의 농도로 최종 ASP 유출에 존재하고 GAC 및 오존을 사용하여 제거한다 (O ₃₎ 환경 ​​적으로 안전한 농도로. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

효모 에스트로겐 화면 (YES) 분석 플레이트 (A), 황색에서 적색으로 색 변화를 나타내는 샘플의 에스트로겐 활성에 관한 그림 4. 사진. 를 YES 분석 플레이트를 보여주는에서 만든 플롯이 흡광도를 수정 ((540)에스트로젠 표준 (B)의 나노 미터)는, 활성 오니 법 유출 (ASP)와 입상 활성탄 (GAC) 폐수 처리 폐수 샘플 (C)이. 각 샘플은 이중으로 시험 하였다. ASP와 GAC 폐수는 추출 부 (1)에 설명 된 SPE 방법을 사용하여 농축 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

오존은 통상적으로 처리 된 폐수 처리 공장에서 스테로이드 에스트로겐과 에스트로겐 활성을 제거하는데 효과적이다. 오존은 폐수 샘플에서 유기 오염 물질의 다양한 용존 유기 물질을 산화 할 수 있으며, 소독 속성을 제공합니다. 오존의 효과는 pH를, 유기물의 양의 오존인가 량으로 물의 특성에 따라 달라진다. 잘못 종래 처리에 의해 제거 될 수 에스트로겐0.8 및 2 mg을 O ₃ / mg을 DOC 사이의 용량으로 폐수에서 제거. 오존은 EDC 다수의 브레이크 적용 오존을 만들어 전자 풍부한 사이트 (불포화 탄소 - 탄소 결합, 방향족 알코올을 포함한 방향족 화합물)과 반응하여 선택적 산화제이다. 그러나, 개별 화합물의 제거는 반드시 원래의 화합물의 전체 광물로 이어질하지 않습니다. 유기 물질은 다음 오존 부산물, 저 분자량의 번호를 생성 중간체 변환 산화 변형 될 수 있고, 알데히드, 케톤, 카르 복실 산, 케토 산, 브롬화 화합물과 같은 화합물의 극성 클래스. 예를 들면, 브롬 산, 포름 알데히드, 아세트 알데히드 및​​ 카르 복실 산을 포함한다. 생체 내에서 사용하여 시험 관내 생물 검정에서 오존 일부만 어떤 화학 물질을 산화하더라도, 얻어진 형질 전환 주 제품이 하부 estrog있는 것으로 밝혀졌다enic 효능 때문에 에스트로겐 활성의 높은 제거에 적합한 투여 결과 오존의 적용.

폐수의 추가 치료의 주요 장점 중 하나는 물을받는 남성 물고기의 여성화의 감소이다; 감소 임신 ³ 발생할 수있는 부작용. 물고기를 사용하여 생체 연구 (예를 들어, 바퀴벌레 또는 얼간이 미노) (그림 5에서 볼 수 있듯이, 예를 들면) 남성 물고기의 정소에서 폐수 쇼 여성의 생식 세포 또는 난자에 노출. 성별 간 또는 남성 VTG이 없거나 현저 같은 GAC ⁷ 오존 ^(22)과 같은 고급 치료 다음 물고기가 감소합니다. 이러한 연구는 단이 생성 된 용출액의 독성을 해결하지 않는 오존 중에 생성 변태 제품 에스트로겐 아니라는 것을 보여준다. 이 문제는, 예를 들어, 다른 연구에서 부르크 등의 연구를 다루어왔다. (23)입니다.

일반 남성 (A) 및 성별 간 그림 5. 현미경 사진 (B는 C) 필드를 기반으로 평가. 현미경 사진-A에 폐수에 노출 된 성인 바퀴벌레 (Rutilus의 rutilus)에서 생식선은 정상 남성 고환의 조직 학적 섹션을 보여줍니다. 현미경-B 및 -C는 6 개월 동안 활성 슬러지 공정 폐수 유출 물에 노출 된 갖는 성별 간 남성 물고기의 조직 학적 섹션을 보여줍니다. 화살표는 고환 조직에 존재하는 난자를 나타냅니다. 스케일 바는 각각의 현미경 사진 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

오존, GAC 또는 박막 기술을 사용하여 파이프 처리 단부의 높은 비용 대안 저비용의 개발을 필요로 화학 (EDC) 제거를 방해 내분비 지속 방법. 또한, 흡착 및 분리 방법은 간단하게 분해를 통해 그들을 제거하기보다는 다른 하나의 단계에서 EDC를 분리합니다. ^{26 -} 타미 활성제 폐수 ^{(12, 24)에서} 유기 micropollutants의 과산화수소 산화 반응을 촉진하기 위해 개발되고있다. 타미 효과적으로 순수 실험실 물과 하수 처리 시설에서 폐수와 아군 소변 샘플 ¹² EE2 및 기타 스테로이드 에스트로겐 저하 O ₂ H ₂ 활성제. 실험실 연구, 타미 / H ₂ O ₂ 처리가 YES의 생물 검정과 substantia를 사용하여 시험 관내에서 측정 한 에스트로겐 활동을 EE2를 제거하는 등 높은 스테로이드 에스트로겐 제거를 제공하고 실질적으로 감소 표시에서야 베드로는 VTG의 생물 검정법 (그림 1, 그림 6)를 사용하여 측정 생체 내에서 물고기의 여성화를 감소.

그림 6. 평균 EE2 농도의 에스트로겐 활성을 처리하고, 처리되지 않은 탱크 물 (A)와베이스 라인에서 플라즈마 vitellogenin 노출 된 수컷 물고기 (B). A) EE2의 농도 (NG / L, 진한 파란색 막대)를 LCMS / MS로 측정 하였다 , 에스트로겐 활동 (EE2 상당 NG의 /의 L, 짙은 녹색 바) (YES) 시험 관내 효모 에스트로겐 화면을 통해 측정 하였다. B) 플라즈마 vitellogenin을 (남성 얼간이 황어에서 / ㎖, 밝은 파란색 막대) 농도를 ng를하는 양적 효소를 통해 측정 하였다 면역 분석법 (ELISA)을 -linked. 보고 EE2 화학 분석 결과 <0.03 NG /의 L의 EE2 (즉, 검출 한계 (LOD)보다 낮은)는, 즉, (반 LOD를 가진 것으로 처리 하였다 평균, 표준 오류 및 통계 분석의 계산에 사용 0.015 NG / L EE2). EE2 및 에스트로겐 활성은 21 일 노출을 통해 샘플링 평균 측정 농도이다. 플라즈마 VTG 노출 전 (베이스 라인)에 21 일간 노광 후에 측정 하였다. 치료 정권은 구성; 음성 대조군 (희석 만), EE2 + H ₂ O ₂ + 타미, EE2 + H ₂ O _2, EE2 전용입니다. 그래프-A에서 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내는 그래프-B에서 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 그래프-B의 바 위의 편지는 통계적 유사성을 나타냅니다. 이 수치는 밀스 등에서 수정되었습니다. ^(12)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

폐수 처리 플랜트 EDC와 지표수 오염의 주 경로이다. 종래의 진보 된 또는 새로운 처리 공정의 내분비 활성의 제거 효과의 평가는 화학적 및 생물학적 분석의 다양한 이용을 필요로한다. 비 - 타겟팅 타겟팅 된 분석을 사용하여 화학 분석은 개별 성분의 제거 효과에 대한 정성 또는 정량적 인 데이터를 제공하고, 따라서 평가 환경 품질 기준에 의해 만들어진 또는 분석되는 화합물 또는 화합물의 혼합물의 효과 농도를 예측하지 할 수있다.

폐수 처리 및 알려지지 생물학적 활성 성분의 존재하에 다음 물질의 불완전 광물 인한 변형 산물의 생성은 단독 화학 시험의 유용성을 제한한다. 분석 화학자와 함께 체외 생물 검정 생체 내에서와에서의 조합RY 스크리닝 폐수 처리 공정 신흥 EDC 제거의 효과를 결정하기위한 유용한 도구를 제공한다. 전통적인 수질 파라미터 및 기타 미생물의 독성과 종점 함께 진행이 테스트는, 현재 및 새로운 폐수 처리 기술의 중요한 평가를 허용한다.

되지 않은 효모를 기반으로 에스트로겐 화면 (예 : YES)주의하는 화학 물질과 폐수의 에스트로겐 효능을 결정하는 분석 시험 관내에서 유일하게 중요하다. 안정적으로 형질 감염된 포유 동물 세포 기반 분석의 숫자는 예를 들어, ^ER-27 CALUX 인간 유방암 세포 또는 자궁 경부 종양 세포를 ^28-hERα 헬라-9903은 각각도 개발되고있다. Yes (예) 비슷한 포유 동물 세포 기반 분석과 비교되었으며, 재현성의 비교 높은 수준이 발견 된 사실 긍정적이고 진정한 부정적인 에스트로겐 식별 요금 ²⁹ altho우 때때로 ²⁷ 약간 덜 중요한 것으로 간주된다. 효모 기초 리포터 분석의 한 가지 이점은 덜 엄격한 생물 관리 방법 및 무균 기술을 필요로 포유 동물 세포 배양과 상당한 경험이없는 실험실에서 YES보다 쉽게​​ (YES 필요 벤치 위에서 수행 될 수있다)을 채용 할 수 있다는 . 인간의 세포 기반 분석은 또한 예에서 사용되는 표준 보육 및 마이크로 플레이트 리더에 비해 CO ₂ 인큐베이터와 luminometers을 필요로한다. 두 효모 기반 에스트로겐 기자 분석 (YES, 사카로 마이 세스 세레 비지와 A-YES, Arxula의 adeninivorans)는 ISO 19040의 검증을 위해 현재 겪고있다 간 실험실 산책로 "수질 - 물과 폐수의 에스트로겐 가능성의 결정"산업을 강조 이러한 기술에 대한 관심.

잠재적 오염물을 포함 기재된 방법에 제한이있다필드 또는 실험실 환경에서 인간 오염 (예를 들면, 가소제, 계면 활성제, 퍼스널 케어 제품)에 의해 발생하는 에스트로겐 물질과 시료 채취, 시료 저장 및 분석시 샘플. 예 '분석 (또는 다른 셀 기반 리포터 분석법)에 오염이 유형의 백그라운드 상승 및 분석의 사용에 영향을 미칠 것이다. 플라스틱 병에 저장된 물 샘플 또는 용매는 쉽게 오탐 (false positive)가 발생할 수 있습니다. LCMS / MS와 YES 분석이 모두 검출 수준으로 에스트로겐을 집중 SPE를 필요로 거짓 네거티브는 우려도 있습니다. 매트릭스, SPE 흡장 용출 용매의 선택은 추출 효율 및 용출 된 화합물의 종류에 영향을 미칠 수있다. 높은 극성 및 염기성 화합물이 저조한 흡착제에 의해 유지되는 바와 같이, 음의 바이어스를 생성 할 수있다이 프로토콜에 설명 된 조건을 사용하여 추출 C18 SPE 카트리지를 사용. 또한,이 프로토콜은 메테에서 용출 YES 용리액의 재구성이 필요합니다올 휘발성 화합물의 손실을 초래 FUNDER 질소를 증발 건조를 통해 에탄올. 결과적으로, 프로토콜은 테스트 샘플의 에스트로겐 활성을 과소 제공 할 수있다. 그들은이 추출되지 않은하거나 증발로 인해 손실되기 때문에 알 수 없거나 예상치 못한 화합물로 YES 분석이 누락 될 수 있습니다 고려할 때 이러한 제한은 특히 중요하다. 또한, LCMS / MS 기술은 복구 정정 표지 내부 표준을 사용한다; 이 방법은 YES 분석에 사용될 수 없다.

폐수의 생체 내 시험의 중요한 한계는 시험 관내 방법에 비해 평가에 필요한 높은 비용과 시간을 포함한다. 현재 에스트로겐 활성을 검출하는 어류 배아 시험의 사용이 제한된다. 그러나, 미래의 응용 프로그램을 수있는 물고기의 배아 ^(30), 빛나는 에스트로겐 반응 유전자를 생산하는 몇 가지 성공이 있었다. 이 protoc에 사용 얼간이 황어 (올) 일반적인 실험실 종과 남성 물고기 VTG 유도가 에스트로겐 노출 잘 문서화 된 바이오 마커 및 폐수 유출 estrogenicity ⁽²²⁾ 또는 다른 에스트로겐 화합물 또는 이들의 혼합물 ^(31)의 정량적 측정이다. 내분비 교란 화학 물질에 대한 OECD 테스트 가이드 라인은 VTG는 세 가지 종에서 에스트로겐 노출에 민감한 바이오 마커 인으로, 성인 얼간이 미노 일본 송사리와 제브라 피쉬 ^{(32, 33)를} 사용하여 검증되었다. 심각 성별 간 바퀴벌레 ^3에서 볼 수 그러나, VTG 유도는 직접, 생식 장애 및 폐수 노출 때문에 생태 학적 결과에 상관하지 않습니다. 한편, 바퀴벌레 때문에 그들의 큰 크기, 긴 생성 시간 (2-3 년 성적 성숙에 도달하기 위해), 생식 스타일 생태 독성학 연구를위한 고전적인 '실험실 종'아니다; 그룹 산란 (사육) 년에 한 번 발생하고, 어려움은시 이외의 여성에서 남성을 (식별산란 시즌). 그러나, 일반적으로 자웅 이체 아주 잘 때문에 에스트로겐 폐수 유출의 하류, 남성 물고기가 내분비학에 (예를 들어, 여성 고유의 혈액에서 vitellogenin의 존재) 및 조직 병리학 (ovotestes 교란을 전시 발견으로, 영국에서 연구되어왔다 - 고환 및 / 또는 여성의 생식 관) ^5,6 계란을 개발하고 있습니다. 따라서, 이러한 프로토콜의 미래 응용 프로그램으로, 바퀴벌레 (또는 유사 종) 폐수 품질 (감소 estrogenicity)에 실제 개선 발전 처리 폐수를받는 강에서 볼 경우 표시 유용한 야생 감시 종 수 있습니다. 또한, 파일럿 플랜트 규모 ⁷ 기술적 개선 된 배출물을 모니터링하는 파이프 시스템의 단부에 사용될 수있다. 생체 내 폐수 평가에서에서 사용할 종 고려할 때 상대적으로 빠른 제어 테스트를 사용하여 실험실 종 사이의 트레이드 오프는 비교가더 이상 필드를 기반으로하지만 토착 종을 사용하여 테스트보다 환경 관련. 그러나, 생체 내 평가에서와 같은 고비용이고 단지 화학 분석을 이용하여 평가를 다음 시험의 최종 세트로 시험 관내 분석에서 고려되어야한다.

개시된 프로토콜 내에서 중요한 단계는 제조 및 샘플 유리의 핸들링을 포함 플라스틱과 함께 시료의 접촉을 제한 포함한 환경 오염 물질 시료의 오염을 방지하기 위해 (즉, 병 샘플링 장치는 적합한 계면 활성제 세척제로 전처리한다) 오탐 (false positive)을 생성 할 수 있습니다 기타 자료. 설계 및 수족관과 물고기 노출 시스템을 구축 할 때 똑같이 중요하다. 이상적으로 수족관 (주택 주식 및 노출시)는 최소한의 오염 위험이 낮은 흡착 ⁽³²⁾ 재료로 구축되어야한다. 스테인레스 스틸은 유출 물 홀딩 탱크에 사용될 수있다.유리 구조의 탱크 어항 바람직하다 반면 (이는 또한 물고기 쉽게 관찰을 제공하기 때문에). 낮은 등급의 플라스틱 파이프 또는 튜브를 사용하는, 즉, 사용하기 전에 적어도 12 시간 동안 희석을 실행하는 임의의 오염 물질을 걸러 왼쪽 '적절히 양념'경우 ^(32), PVC ⁽³⁴⁾ 및 ABS 사용할 수 피해야한다. 의료 등급의 실리콘 튜브는 탱크 화학 물질 및 폐수 / 희석 수의 연동 펌프 납품을위한 우리의 시설에서 성공적으로 사용되어왔다. 뿐만 아니라 건설 에스트로겐 오염을 고려하고 수영 시스템의 실행, 물고기의 다이어트에 대해 생각하는 것이 중요하다; 많은 타당성 물고기 음식은 생선에 에스트로겐 것으로 밝혀졌다. 따라서 이전 연구의 이러한 종류를 사용하여 (베레스포드 등. ^(14)을 참조 효모 에스트로겐 화면에서, 예를 들어) 활동을 위해 어떤 음식을 테스트하는 것이 중요합니다.

문제 해결품질 보증 샘플 여러 여행, 실험실 등의 용매 블랭크는 위양성 및 위음성 결과를 제거하는 긍정적 인 컨트롤과 실제 시료와 함께 분석하면 간단 설명 된 화학 분석 또는 YES 분석 프로토콜. 긍정적 (예를 들어, EE2)과 음극 (희석 전용) 제어는 항상 감지 할 수있는 예상치 못한 오염을 예상 생물학적 바이오 마커 또는 엔드 포인트 (즉, VTG 또는 조직 병리학)의 감도를 확인하고, 허용하는 생체 분석도 사용되어야한다 ( 예를 들어, 실험 장치까지, 다이어트, 또는 희석 물)에서. 프로토콜의 수정은 어떠한 연구를 수행하기 전에 확인해야합니다.

폐수 처리 설비의 폐수를 통해 환경에 진입 에스트로겐 화합물의 엄격한 규제는보다 효과적인 폐수 처리 기술이 개발 될 필요가 있음을 관찰하다이다. 이 논문에 기재된 시험 전지는 칭찬생태 독성 및 화학 평가 시험은 일반적으로 폐수 처리 공장의 폐수 배출에 적용. 따라서 폐수 기술 개발자 및 플랜트 운영을 가능하게한다 테스트 전체적인 배터리 형식 미래 애플리케이션 특정 규제 에스트로겐 화학 전체 생물학적 활성을 모두 제거하는 최적의 방법을 고려하여 가장 생태 학적으로 안전 설계를 구현한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wellwash Versa plate washer	Thermo Scientific	5165010
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax 340PC
Incubator	Memmert	INB 400	37 °C incubation required for carp assay
Fisherbrand whirlimixer	Fisher Scientific	13214789
Icemaker	Scotsman	AF80
12-Channel F1 digital multichannel pipette	Thermo Scientific Finnpipette	4661070
ELISA kits	Biosense Laboratories	V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp)
Microfuge tubes, 0.5 ml	Alpha labs	LW2372
Microfuge tubes, 1.5 ml	Alpha labs	LW2375
Sulphuric acid, 95-98%	Sigma-Aldrich	258105
Histology
Tissue processor	Leica Biosystems	TP1020
Wax dispenser	Thermo Scientific Raymond Lamb	E66HC
Metal embedding mold	Leica Biosystems	Various
Hot plate	Thermo Scientific Shandon	3120063
Cold plate (EG1150 C)	Leica Biosystems	14038838037
Heated forceps (EG F)	Leica Biosystems	14038835824
Microtome	Leica Biosystems	RM2235
Paraffin section floatation  bath	Electrothermal	MH8517
Slide drying bench	Electrothermal	MH6616
Stainmate automated stainer	Thermo Scientific Shandon	E103/S10L
Cassettes, Histosette II, biopsy	Simport	M493
Paraffin wax	Thermo Scientific Raymond Lamb	W1
Histo-Clear II	National Diagnostics	HS-202
IMS (ethanol mix), IDA99	Tennants	ID440
Polysine adhesion slides	Thermo Scientific Gerhard Menzel	J2800AMNZ
Cover slips, 22x50 mm	VWR	631-0137
Histomount	National Diagnostics	HS-103
Haematoxylin Harris GURR	VWR	351945S
Eosin, 1%, aqueous	Pyramid Inovation	S20007-E
Fisherbrand slide boxes	Fisher Scientific	11701486
Microtome blades, MB35	Thermo Scientific Shandon	3050835
Bouin’s solution	Sigma Aldrich	HT10132-1L
Yeast screen
Flow cabinet	Labcaire Systems Ltd	SC12R
Cooled incubator	LMS Cooled Incubator	303
Incubator	Memmert	INB 400
Shaker	Grant	PSU-10i
Fisherbrand whirlimixer	Fisher Scientific	13214789
Plate shaker	Heidolph Titramax 100	544-11200-00
12-Channel F1 digital multichannel pipette	Thermo Scientific Finnpipette	4661070
12-channel pipette, electronic	Sartorius	735441
96-well flat-bottom microplates	MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt	76-232-05 260860 82.1581.001	We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds
HPLC grade water	Rathburn	RH1020
Absolute ethanol	Hayman Kimia	F200238
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Sigma-Aldrich	P-5655
Ammonium sulphate	Sigma-Aldrich	A-2939
Potassium hydroxide, pellets	Sigma-Aldrich	P-1767
Magnesium sulfate, anhydrous	Sigma-Aldrich	M-2643
Iron(III) sulfate	Sigma-Aldrich	307718
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L-8912
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H-6034
Adenine	Sigma-Aldrich	A-2786
L-Argenine, hydrochloride	Sigma-Aldrich	A-6969
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M-5308
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T-8566
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I-7403
L-Lysine, hydrochloride	Sigma-Aldrich	L-8662
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P-5482
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G-8415
L-Valine	Sigma-Aldrich	V-0513
L-Serine	Sigma-Aldrich	S-4311
Thiamine, hydrochloride	Sigma-Aldrich	T-1270
Pyridoxine	Sigma-Aldrich	P-5669
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P-5155
Inositol	Sigma-Aldrich	I-5125
D-Biotin	Sigma-Aldrich	B-4639
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers	Sigma-Aldrich	G-7021
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A-4534
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T-8441
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1297
Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG)	Sigma-Aldrich	10884308001
Glycerol	Sigma-Aldrich	G-2025
17 β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E-8875
Steroids
Acetone	Rathburn
Acetonitrile	Rathburn
Ammonia solution	Rathburn
Ethylacetate	Rathburn
Copper(II) nitrate	Sigma-Aldrich
Acetone	Rathburn
Dichloromethane	Rathburn
2,4,16,16-d4-17β-estradiol	CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-estrone	CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol	CDN Isotopes
17β-estradiol	Sigma-Aldrich
Estrone	Sigma-Aldrich
17α-ethynyl oestradiol	Sigma-Aldrich
Hexane	Rathburn
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich
Methanol	Sigma-Aldrich
Sodium hydrogen carbonate	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml)	Biotage
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml)	Biotage
Fish study
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6	Watson Marlow	982.0063.000
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20	Watson Marlow	999.2008.000
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m	Watson Marlow	913.A008.016
200 series multi-channel persitaltic pump	Watson Marlow	205CA
Silicone tubing x 15 m (dosing tanks)	VWR	SFM1-3250
silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow)	VWR	SFM1-5450
2.5 L glass winchester pk 4	Fisher Scienctific	BTF-505-050B
magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10	Fisher Scienctific	FB55595
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma Aldrich	E10521-10G
17α-Ethynylestradiol	Sigma Aldrich	E4876-100MG
Absolute ethanol	Hayman Kimia	F200238
SPE
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4	Sigma Aldrich	57276
disposable liners for manifold	Sigma Aldrich	57059
filtration tubes without frits 6 ml pk 30	Sigma Aldrich	57242
reservior adaptors pk 12	Sigma Aldrich	57020-U
stainless steel weight for manifold pk 4	Sigma Aldrich	57278
male Luer plug for manifold pk 12	Sigma Aldrich	504351
SPE Vacuum Manifold	Sigma Aldrich	57265
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12	Waters	WAT054806
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50	Waters	WAT020515
Methanol HPLC grade 2.5 L	Fisher Scientific	M/4056/17
7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399	Fisher Scientific	TUL-520-031K
Absolute ethanol	Hayman Kimia	F200238
vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump	Camlab	1136915