Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

Özet

Örnek Kurutma işlemleri esnasında alt-tabaka sıcaklığının ayarlanması sayesinde yöntemde MALDI kütle spektrometresi iyon sinyallerin uzaysal farklılıklarını azaltmak için bir kuralı gösterilmektedir.

Özet

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Giriş

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protokol

NOT: Bu protokol, kurutuldu-damlacık yöntemiyle hazırlanan maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) mekansal heterojen azaltmak için geliştirilmiştir. Protokol hazırlanması ve ön koşullandırma, örnek bırakma ve kurutma ve kütle spektrometrisi veri analizi de dahil olmak üzere, üç ana adımdan oluşur. prosedürleri tarif ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir:

1. Hazırlık ve Önkoşullanma

1. Örnek Plate Temizleme
   1. nitril eldiven giyin ve deterjan ve distile-deiyonize su (DDW) ile hafifçe örnek plaka el yıkayın.
   2. metanol (MeOH) ve DDW ile örnek plaka durulayın.
   3. 600 ml beher örnek plaka takın ve DDW ile doldurun.
   4. ultrasonik banyoda (200 W, 40 kHz) 'de 15 dakika süre ile DDW içinde örnek plaka sonikasyon.
   5. kaptan DDW çıkarın ve MeOH ile beher doldurun.
   6. ultrasonik banyo (200 W, 40 kHz) 15 dakika boyunca MeOH içerisinde örnek plaka sonikasyon.
   7. Azot gazı ile plaka üzerinde çözücü damla uçururum ve örnek birikimi önce kuru numune plaka tutun.
2. Düzenlenmesi Kurutma Odası Sıcaklığı
   NOT:. Kurutma odası 35 x 20 x 45 cm ³ (W x D x Y) akrilik haznesi Şekil 1, bu kurutma sisteminin resmini gösterir. odası kurutma bölmesinin içine monte kalibre edilmiş bir higrometre ile gözlenmiş düşük nispi nem durumunu korumak için sabit bir akış oranında bir gaz akış ölçer ile oda sıcaklığında azot gazı ile temizlenmiştir. programlanmış sabit sıcaklık su sirkülatör sahip kurutma bölmesi bir bakır temel blok çelik örneği plakaları karşılamak için kullanılır. bakır taban bloğu 25 ° C 5 örnek plaka ısısını düzenlemek için yapabiliyor. hava, bakır taban bloğu ve numune plakasının sıcaklık K-tipi termokupllar ile kontrol edilir.
   1. Kapıyı açın ve hızla bakır örnek plaka koymakBaz bloğu sonra kapağını kapatın.
   2. El ile saatte 10 standart kübik feet (SCFH'dir) azot akış hızını ayarlamak için gaz debi ölçer ayarlayın.
   3. bağıl nem her zaman% 25'in altına sağlamak için higrometre ve ince ayar gaz debimetre ile kurutma odasında bağıl nemi izleyin.
   4. K-tipi termokupl tarafından numune plaka sıcaklığını izlemek ve örnek plakası deney ya da kontrol için oda sıcaklığında (25 ° C) 5 ° C ulaşana kadar manuel olarak su sirkülasyon sıcaklığını ayarlamak.
      NOT: tasarlanan sıcaklıkta örnek plaka stabilize etmek için, su sirkülasyon sıcaklığı tipik olarak tasarlanmış örnek daha düşük, 5 ° C ila 0 olarak ayarlanır. Örneğin, örnek plakasına 5 ° C tutmak için su sirkülatörün sıcaklık ayarı 2 ° C ila 0 aralığındadır; 25 ° C'de bir örnek plaka korumak için, suyun sirkülatörün sıcaklık ayarı 23-25 ​​° C aralığındadır.
   5. Gerekli sıcaklık ve bağıl nem örnek birikimi önce (Tablo 1) ulaşılır emin olun.
      Not: farklı numune plakası sıcaklıkları kurutma işlemleri için tüm parametrelerin yanı sıra ayar değerleri Tablo 1 'de gösterilmiştir.
      NOT: oda kapısı uzun süre açık ise düşük örnek plaka sıcaklığında numune plaka üzerinde su yoğunlaşması oluşabilir. Su yoğunlaşması oluşursa kapıyı kapatın ve su yoğunlaşması kurumuş kadar üzerinde herhangi bir örnek yatırmak ETMEYİN.
3. Matris ve analit Çözümleri Hazırlanması
   1. matris çözümleri hazırlanması
      1. % 50 DDW sulu solüsyon: 50% asetonitril (ACN) ile 0.1 M thap çözeltisi hazırlayın.
   2. Analitlerin hazırlanması
      1. DDW ile 10 ^-4 M maltotriozdur çözeltisi hazırlayın.
      2. % 50 asetonitril, 10 ⁵ M bradikinin fragmanı hazırlandı (1-7) çözeltisi(ACN):% 50 DDW sulu çözelti.

2. Örnek Biriktirme ve Kurutma

1. Karışımlar 0.1M thap solüsyonu 0.25 | il 10 ⁴ M maltotrioz veya 10 ⁵ M bradikinin fragmanı (1-7), bir mikrosantrifüj tüpü içinde çözeltiler 0.25 ul.
2. 3 sn karışık bir çözüm karıştırın.
3. santrifüj tüpünün dibinde çözüm toplamak için 2 sn (2000 xg) karışık bir çözüm santrifüjleyin.
4. dikkatle, kurutma odasının kapısını açın pipet ile örnek plaka üzerinde solüsyonun 0.1 ul yatırmak ve hemen kapıyı kapatın.
5. Örnek damlacık kurumasını bekleyin.
   . NOT: Farklı numune plaka sıcaklıkları genellikle gözlenen kurutma süreleri Tablo 1'de listelenen 5 ° C örnek plaka sıcaklığı için, ortalama kuruma süresi 800 1000 sn; 25 ° C Örnek plakası sıcaklığı için ortalama kuruma süresi 100 ile 150 sec.
6. Kuruduktan sonra, kurutma odasının kapısını açın.
7. oda sıcaklığında (25 ° C) su sirkülasyon sıcaklığını ayarlamak.
   NOT: Numune plaka kurutma işlemi sırasında, oda sıcaklığında (25 ° C) sürekli tutulursa, bu adımı atlayın.
8. Oda sıcaklığında (25 ° C) Örnek plaka sıcaklığı döndükten sonra, kurutma bölmesinin örnek plakasını çıkarın.
9. 5X stereomikroskop altında örnek morfolojisi incelemek ve bir anlık parlak alan görüntü almak.
   Not: kristal morfolojileri olarak beklenmemektedir, bu aynı prosedür ile yeni bir numune hazırlamak için gereklidir. Tipik bir kristal morfolojisi, Şekil 2'nin üst panel gösterilmiştir.
   NOT: 5 ° C gibi düşük örnek plaka sıcaklığına sahip durumlarda, kurutma bölmesinin çıkarmadan önce oda sıcaklığına örnek plaka ısıtmak için önemlidir. Örnekleri yatırma yaparken, önceden karıştırılmış Solutio tutmak YAPMAYINn 10 sn boyunca pipet ucu. numuneleri yatırma sonra yeniden premix çözüm kullanmayan ETMEYİN. Şekil 2'nin üst panel farklı numune plakası sıcaklıkları ile hazırlanan numunelerin parlak alan görüntüleri gösterir.

3. Kütle Spektrometresi Veri Analizi

1. Kütle Spektrometre Veri Toplama
   NOT: hazırlandıktan sonra, numune görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilebilir. Bu çalışmada, görüntüleme MS deneyler laboratuar yönelik yapılmış senkronlaştırılmış çift kutup TOF kullanılarak gerçekleştirilir (DP-TOF) kütle spektrometresi görüntüleme. Görüntüleme yeteneği ile ¹⁵ ticari MALDI-TOF kütle spektrometre aynı zamanda, deneyler için de uygundur. kütle spektrometresi doğrusal ekstraksiyon ve optimize edilmiş emme gecikmeler ile pozitif iyon modunda çalıştırılır. iyonların kinetik enerjisi 20 kV. Lazer ışını boyutu örnek yüzeyinde çapı 35 mikron ve her nokta spektrum ave olduğunu5 lazer çekim öfke.
   1. MALDI kütle spektrometresi içine örnek plaka yerleştirin.
   2. adımlarda 2,1-2,9 hazırlanan örnek kütle spektrometresi analizi görüntüleme gerçekleştirin.
   3. sonuç penceresinde gösterilen kitle listeden karakteristik kitle tepe seçin ve iki boyutlu iyon görüntü çizmek için "2D" tıklayın.
      Not: thap ile karıştırılır maltotrioz için, karakteristik tepe noktaları maltotrioz, protonlanmış thap sodiated ve thap sodiated edilir. Thap ile karıştırıldı bradikinin fragmanı (1-7) için, karakteristik tepe noktaları bradikinin fragmanını (1-7) protonlanmış thap protonlanmış ve thap sodiated içerir.
   4. sinyal yoğunluğu üst ve alt limitlerini belirlemek için pop-up pencere ayar düğmelerini tıklatın ve "bir resmi kaydetmek" butonuna tıklayınız. Bu ayar, iyon resimlerin kontrastını tanımlar.
      NOT: veri her bireyin setinde, kırık bölgeler ve düşük parlaklığını gösteren boş noktalar ortadan kalkar.
   5. Gözlemlemek ve iyon karşılaştırmakAdım 2.9 olarak alınmıştır parlak alan görüntü ile görüntü.
      Not: kütle spektrometrisi ve özellikle iyonlarının görüntülerin inşaat Görüntüleme ticari araçlar ile elde edilebilir. Nedeniyle veri toplama ve analiz yazılımı çeşitli kullanıcıların yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için cihaz satıcısı tarafından sağlanan yazılım talimatları takip etmelidir.
2. Veri analizi
   NOT: Numunelerin heterojen kantitatif analiz edilir. Bu gösteri, her numune iyonları dağılımını analiz etmek in-house geliştirilen yazılımın birden fazla eş merkezli bölüme ayrılmıştır. analiz, tek başına bir veri analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
   1. önemsiz alanları kaldırmak için sonuç penceresinde gösterilen iyon görüntüde boş noktalar ve kırık bölgeleri tıklayın.
      NOT: Bu prosedür iyon görüntünün temel alanını tanımlar.
   2. iyon görüntünün dıştaki katman bulmak için lütfen "kenar bulmak" tıklayın.
   3. bir veritabanında dış tabakasında iyon bolluğu bilgileri kaydetmek ve aynı anda iyon görüntüden bu katmanı kaldırmak için "düşeriz" tıklayın. Bu dıştaki katman temsil eden bir onay kutusu sonucu penceresinin "çıkış verileri" listesinde görünür.
   4. iyon görüntünün merkez tanımlanır yineleyerek 3.2.2 ve 3.2.3 adımları.
   5. Tıklayın ve "çıkış verileri" listedeki tüm onay kutularını seçin ve verileri vermek için "ihracat" a tıklayın.
   6. iyonların mekansal dağılımı bilgilerini elde etmek için her katmanın ortalama iyon bolluğu hesaplamak için tablo yazılımını kullanarak dışa aktarılan verileri açın.

Sonuçlar

Parlak alan görüntüleri ve örnek plakası 5 sıcaklığı ve 25 ° C ile hazırlanan maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) MS Fotoğraflar, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Sodiated maltotrioz, iyon sinyali esas olarak doldurulur halinde örnek alanın çevresine 25 ° C lik bir örnek plakası sıcaklığı hazırlandığında. 5 ° C'ye örnek plaka sıcaklığı düşürerek, sinyal homojen tüm numune alanı üzerinde doldurur. 5 ° C'nin altında ö...

Tartışmalar

önceki teorik tahminlere dayanarak, damlacıklar içindeki sıcaklık kaynaklı hidrodinamik akışları dışa çözücü buharlaştırma yoluyla uyarılan kılcal akışları üstesinden gelebilir. sıcaklık damlacık artışı içinde gradyanlar zaman moleküllerin bu iç sirkülasyonu verimliliği artırılmıştır. çevre sıcaklığında çevresi muhafaza edilirken, 5 ° C'nin altında Örnek plaka sıcaklığı tutmak zaman tahmin edilen sonuçlara göre, damlacık içindeki sirkülasyon akımlarının ort...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab