Preparação de Amostras de MALDI homogênea para Aplicações quantitativas

Resumo

Um protocolo para reduzir as heterogeneidades espaciais dos sinais de iões em espectrometria de massa MALDI por regulação da temperatura do substrato durante o processo de secagem da amostra é demonstrada.

Resumo

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Introdução

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protocolo

NOTA: Este protocolo é desenvolvido para reduzir a heterogeneidade espacial do fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado com o método da gota seco. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo a preparação e pré-condicionamento, a deposição de amostra e de secagem e análise de dados de espectrometria de massa. Os procedimentos são descritos e descritos com mais detalhe a seguir:

1. Preparação e pré-condicionamento

1. Limpeza da placa de amostra
   1. Usar luvas de borracha nitrílica e mão-lavar a placa de amostra suavemente com detergente e destilada-água deionizada (DDW).
   2. Lavar a placa de amostra com metanol (MeOH) e DDW.
   3. Insira a placa de amostra num copo de 600 ml e encher com DDW.
   4. Sonicar a amostra na placa de DDW durante 15 minutos num banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz).
   5. Remover DDW a partir do recipiente e encher a proveta com MeOH.
   6. Sonicar a placa de amostra em MeOH durante 15 min no banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz).
   7. Blow off as gotas de solvente na placa com azoto gasoso e manter a placa de amostra seca, antes da deposição da amostra.
2. Regulação da temperatura de secagem Câmara
   NOTA:. A câmara de secagem é de 35 x 20 x 45 ^cm3 (W x D x H) câmara de acrílico Figura 1 mostra a imagem deste sistema de secagem. A câmara é purgado com gás azoto a temperatura ambiente através de um medidor de fluxo de gás a uma velocidade de fluxo constante para manter uma condição de baixa humidade relativa controlada por um higrómetro calibrado instalado no interior da câmara de secagem. Um bloco de base de cobre na câmara de secagem equipada com uma constante circulação de água de temperatura programado é utilizado para acomodar placas de amostra de aço inoxidável. O bloco de base de cobre é capaz de regular a temperatura da placa de amostra de 5 a 25 ° C. As temperaturas do ar, do bloco da base de cobre, e a placa de amostra são monitoradas por termopares tipo K.
   1. Abra a porta e colocar rapidamente a placa de amostra sobre o cobrebloco da base, em seguida, fechar a porta.
   2. ajustar manualmente o medidor de vazão de gás para definir a taxa de fluxo de azoto a 10 pés cúbicos padrão por hora (scfh).
   3. Monitorar a umidade relativa do ar na câmara de secagem pelo higrômetro e afinar o medidor de vazão de gás para garantir a umidade relativa do ar é sempre inferior a 25%.
   4. Monitorar a temperatura da placa amostra por termopares tipo K e ajustar a temperatura da água de circulação manualmente até que o prato da amostra atinge 5 ° C durante experimento ou à temperatura ambiente (25 ° C) para o controlo.
      NOTA: De modo a estabilizar a placa de amostra a uma temperatura concebido, a temperatura de circulação de água é tipicamente definido de 0 a 5 ° C mais baixa do que a amostra concebido. Por exemplo, para manter a 5 ° C na placa de amostra, o ajuste da temperatura da bomba de circulação de água está compreendida no intervalo de 0 a 2 ° C; para manter a placa de amostras a 25 ° C, a regulação da temperatura da bomba de circulação de água é na gama de 23 a 25 ° C.
   5. Assegurar que as temperaturas exigidas e a humidade relativa são atingidos (Tabela 1), antes da deposição da amostra.
      NOTA: Todos os parâmetros, bem como os seus valores de ajuste para os processos de secagem com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão apresentados na Tabela 1.
      NOTA: a uma temperatura baixa placa de amostra, a condensação de água na chapa de amostra, pode ocorrer se a porta da câmara é aberta para um longo período de tempo. Se ocorrer condensação de água, fechar a porta e não depositar qualquer amostra nele até a condensação da água é seco.
3. Preparação da matriz e do analito Soluções
   1. Preparação de soluções de matriz
      1. Preparar solução 0,1 M THAP com 50% de acetonitrilo (ACN): 50% solução aquosa de DDW.
   2. Preparação de analitos
      1. Prepare 10 ^-4 solução maltotriose M com DDW.
      2. Preparar 10 ^-5 M fragmento bradicinina (1-7) em solução a 50% de acetonitrilo(ACN): 50% solução aquosa de DDW.

2. A deposição da amostra e Secagem

1. Pré-mistura de 0,25 ml de solução 0,1 M THAP e 0,25 ul de 10 ^-4 M de maltotriose ou soluções em um tubo de microcentrífuga de 10 ^-5 M fragmento bradicinina (1-7).
2. Vortex a solução misturada por 3 s.
3. Centrifugar a solução mista de 2 seg (2000 xg) para recolher a solução no fundo do tubo de centrifugação.
4. Abrir a porta da câmara de secagem, cuidadosamente depositar 0,1 ul da solução na placa de amostra com uma pipeta e fechar a porta imediatamente.
5. Aguarde até que a gota de amostra a secar.
   . NOTA: Os tempos de secagem tipicamente observada com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão listados na Tabela 1 para a temperatura da placa de amostra de 5 ° C, o tempo médio de secagem é de 800 a 1000 seg; para temperatura da placa de amostra de 25 ° C, o tempo médio de secagem é de 100 a 150 sec.
6. Após a secagem, abrir a porta da câmara de secagem.
7. Ajustar a temperatura da água de circulação até à temperatura ambiente (25 ° C).
   NOTA: Ignore este passo se a placa de amostra é mantida constantemente à temperatura ambiente (25 ° C) durante o processo de secagem.
8. Depois da amostra de temperatura da placa de voltar à temperatura ambiente (25 ° C), remover o prato da amostra a partir da câmara de secagem.
9. Examinar a morfologia da amostra sob um microscópio estereoscópico de 5x e tomar imagem de campo brilhante um instantâneo.
   NOTA: Se as morfologias de cristal não são como esperado, é necessário preparar uma nova amostra com o mesmo procedimento. Morfologias cristalinas típicas são apresentadas nos painéis superior da Figura 2.
   NOTA: Nos casos com temperaturas de chapa de amostra baixa, tal como 5 ° C, é importante para aquecer a placa de amostra para a temperatura ambiente antes de o levar para fora da câmara de secagem. Ao depositar as amostras, não mantenha o solutio pré-misturadon na ponta da pipeta ao longo de 10 seg. NÃO usar a solução pré-misturada de novo depois de depositar as amostras. Os painéis superior da Figura 2 mostrar as imagens de campo brilhante de amostras preparadas com temperaturas de chapa de amostra diferentes.

Análise 3. Espectrometria de Massa de dados

1. Dados de espectrometria de massa Aquisição
   NOTA: Após a preparação, a amostra pode ser analisada utilizando espectrometria de massa de imagem. No presente estudo, as experiências de imagiologia MS são realizados utilizando um sincronizado TOF dupla polaridade construído em laboratório (DP-TOF) espectrómetro de massa de imagiologia. ¹⁵ espectrómetros de massa MALDI-TOF comercial com capacidade de imagiologia também são adequados para tais experiências. O espectrómetro de massa é operado na extração linear e modos de iões positivos com atrasos de extração otimizados. A energia cinética dos iões é de 20 kV. O tamanho do feixe de laser é de 35 um de diâmetro sobre a superfície da amostra, e o espectro de cada ponto representa a avraiva de 5 disparos de laser.
   1. Insira a placa de amostra para o espectrómetro de massa MALDI.
   2. Realizar imagem análise de espectrometria de massa para a amostra preparada em passos 2.1-2.9.
   3. Selecione um pico de massa característica da lista de massa mostrado na janela de resultados e clique em "2D" para traçar uma imagem ion bidimensional.
      NOTA: Para maltotriose misturado com THAP, os picos característicos são sodiated maltotriose, THAP protonada e sodiated THAP. Por fragmento de bradicinina (1-7) misturado com THAP, os picos característicos incluem protonado fragmento bradicinina (1-7), THAP protonado, e sodiated THAP.
   4. Clique nos botões de ajuste na janela de pop-up para determinar os limites superior e inferior da intensidade do sinal e clique em "salvar uma imagem". Esta configuração define o contraste das imagens íon.
      NOTA: Em cada conjunto individual de dados, as regiões rachados e os pontos nulos mostrando baixa luminosidade são eliminados.
   5. Observar e comparar o íonimagem com a imagem de campo brilhante que foi tomada no passo 2.9.
      NOTA: Geração de espectrometria de massa e produção de imagens de iões específicos pode ser conseguida com instrumentos comerciais. Devido à variedade de aquisição de dados e software de análise, os usuários devem seguir as instruções de software fornecidas pelo fornecedor do instrumento para obter imagens de alta qualidade.
2. Análise de dados
   NOTA: A heterogeneidade das amostras é analisado quantitativamente. Nesta demonstração, cada amostra é dividida em várias áreas concêntricas por software desenvolvido in-house para analisar a distribuição espacial dos íons. A análise pode também ser realizada usando software de análise de dados independente.
   1. Clique os pontos nulos e as regiões rachados na imagem ion mostrado na janela de resultado para remover as áreas sem importância.
      NOTA: Este procedimento define a área essencial imagem de iões de.
   2. Clique em "encontrar edge" botão para encontrar a camada mais externa da imagem de ion.
   3. Clique em "deduzir" para salvar as informações abundância de íons da camada mais externa em um banco de dados e remover esta camada a partir da imagem de íon simultaneamente. Uma caixa de seleção que representa esta camada mais externa aparecerá na lista "de dados de saída" da janela de resultados.
   4. Repita os passos 3.2.2 e 3.2.3 até que o centro da imagem de iões é definido.
   5. Clique e selecione todas as caixas de seleção na lista de "dados de saída" e clique em "Exportar" para exportar os dados.
   6. Abrir os dados exportados usando o software de planilha para calcular a abundância média de iões de cada camada para obter as informações de distribuição espacial de íons.

Resultados

As imagens de campo brilhante, bem como as imagens de MS fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado, com a temperatura da placa de amostra de 5 e 25 ° C são apresentados na Figura 1. No caso de maltotriose sodiated, o sinal de iões principalmente povoa na periferia da área de amostra quando é preparado com uma temperatura de placa de amostra de 25 ° C. Diminuindo a temperatura da placa de amostra a 5 ° C, o sinal preenche de forma homogénea sobre toda a ...

Discussão

Com base em previsões teóricas anteriores, fluxos hidrodinâmicos induzidas pela temperatura dentro de gotículas pode ultrapassar para fora fluxos capilares induzidas por evaporação do solvente. A eficiência de tais moléculas de recirculação interna é aumentada quando a gradientes de temperatura dentro de um aumento de gotícula. De acordo com os resultados previstos, ao manter a temperatura da placa de amostra abaixo de 5 ° C, mantendo a sua envolvente, à temperatura ambiente, a velocidade média de fluxo d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab