양적 응용 프로그램에 대한 균일 MALDI 시료의 제조

요약

샘플 건조 공정 중에 기판의 온도를 조절하여 MALDI 질량 분석기에서 이온 이질성 신호 공간을 감소시키는 프로토콜이 설명된다.

초록

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

서문

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

프로토콜

참고 :이 프로토콜은 건조-방울 방법으로 제조 된 말 토트 리오스와 브라 디 키닌 단편 (1-7)의 공간적 이질성을 줄이기 위해 개발되고있다. 프로토콜은 준비 및 전처리 샘플 증착 및 건조하고, 질량 분석 데이터 분석을 포함하여 세 개의 주요 단계로 구성된다. 절차를 요약하고 아래에보다 상세히 설명된다 :

1. 준비 및 전처리

1. 샘플 플레이트 청소
   1. 니트릴 장갑을 착용하고 세제와 증류수 - 탈 이온수 (DDW)으로 가볍게 샘플 판을 손 씻는다.
   2. 메탄올 (메탄올)과 DDW와 샘플 판을 씻어.
   3. 600 ml의 비이커에 샘플 플레이트를 삽입하고 DDW로 입력합니다.
   4. 초음파 조 (200 W, 40 KHZ)에서 15 분 동안 DDW의 샘플 플레이트를 초음파 처리.
   5. 비커에서 DDW를 제거하고 메탄올로 비커를 입력합니다.
   6. 초음파 욕 (200 W, 40 KHZ)에서 15 분 동안 메탄올에있는 샘플 플레이트 초음파 처리.
   7. 질소 가스와 함께 접시에 용매 방울을 불어 샘플 증착하기 전에 건조 샘플 플레이트를 유지합니다.
2. 규제 건조 챔버 온도
   참고 :. 건조 챔버는 35 X 20 X 45cm ³ (가로 x 세로 x 높이) 아크릴 챔버 그림 1은 이러한 건조 시스템의 그림을 보여줍니다. 챔버는 건조실 내부에 설치된 보정 습도계 의해 모니터링 낮은 습도 조건을 유지하기 위해 일정한 유량으로 가스 유량계를 통해 실내 온도를 질소 가스로 치환된다. 프로그래밍 항온 순환 장치를 구비 한 건조 챔버에서의 구리베이스 블록 스테인리스 샘플 판을 수용하기 위해 사용된다. 구리베이스 블록은 25 ° C에서 5 샘플 플레이트 온도를 조절 할 수있다. 공기, 구리베이스 블록 및 샘플 플레이트의 온도를 K 형 열전대에 의해 모니터링된다.
   1. 문을 열고 빠르게 구리에 샘플 판을 넣어베이스 블록은 문을 닫습니다.
   2. 수동 10 시간당 표준 입방 피트 (SCFH) 내지 질소 유량을 설정하는 가스 유량계를 조정한다.
   3. 상대 습도는 항상 25 % 이하로되도록하여, 습도계와 미세 조정 가스 유량계에 의해 건조 챔버 내의 상대 습도를 모니터링.
   4. K 형 열전대에 의해 샘플 플레이트의 온도를 모니터링하고 샘플 플레이트는 실험 또는 제어 상온 (25 ° C)에 대한 5 ° C에 도달 할 때까지 수동으로 물 순환 장치의 온도를 조정한다.
      주 : 설계된 온도에서 샘플 판을 안정화시키기 위해서, 물 순환 온도는 일반적으로 설계된 시료보다 낮은 5 ° C를 0으로 설정된다. 예를 들어, 샘플 플레이트에서 5 ° C를 유지하는 물 순환 장치의 설정 온도는 35 ° C 0의 범위이다; 25 ° C에서 샘플 플레이트를 유지하는 물 순환 장치의 설정 온도는 23-25 ​​℃의 범위이다.
   5. 필요한 온도 및 상대 습도가 샘플 증착 이전 (표 1)에 도달되도록.
      주의 : 다른 샘플 플레이트 온도가 건조 공정의 모든 매개 변수뿐만 아니라 설정 값을 표 1에 나타내었다.
      참고 : 챔버 문이 오랜 시간 동안 열려있는 경우 낮은 샘플 플레이트 온도에서 시료 접시에 물 응축이 발생할 수 있습니다. 물 결로가 발생하는 경우, 문을 닫고 물 응축 밖으로 건조 될 때까지 어떠한 샘플을 입금하지 마십시오.
3. 매트릭스와 분석 대상 솔루션의 준비
   1. 기질 용액의 제조
      1. 50 % DDW 수용액 : 50 % 아세토 니트릴 (ACN)와 0.1 M THAP 솔루션을 준비합니다.
   2. 분석의 준비
      1. DDW 10 ^-4 M 말 토트 리오스 솔루션을 준비합니다.
      2. 50 % 아세토 니트릴에 ^10-5 M의 브라 디 키닌 단편을 제조 (1-7) 용액(ACN) : 50 % DDW 수용액.

2. 샘플 증착 및 건조

1. 프리믹스 0.1 M의 THAP 용액 0.25 μL 및 ^10-4 M의 말 토트 리오스 또는 ^10-5 M의 브라 디 키닌 단편 (1-7) 미세 원심 튜브 용액 0.25 μL.
2. 3 초 동안 혼합 용액을 소용돌이.
3. 원심 관의 바닥에 상기 용액을 수집하기 위해 2 초 (2,000 XG)에 혼합액을 원심 분리기.
4. 조심스럽게, 건조실의 문을 열고 피펫으로 시료 접시에 솔루션의 0.1 μl를 입금 즉시 문을 닫습니다.
5. 샘플 물방울이 건조 할 때까지 기다립니다.
   .주의 : 다른 샘플 플레이트 온도가 전형적으로 관찰 건조 시간은 표 1에 나열된 5 ° C의 시료 판 온도, 평균 건조 시간은 800 초이다 1000; 25 ° C의 샘플 플레이트 온도의 평균 건조 시간은 100 내지 150 S이고EC.
6. 건조 후에, 건조 챔버의 문을 연다.
7. 실내 온도 (25 °에 C)에 물 순환 온도를 설정합니다.
   참고 : 샘플 플레이트는 건조 과정에서 실온 (25 ℃로)에서 지속적으로 유지되는 경우이 단계를 건너 뜁니다.
8. 상온 (25 ° C) 내지 샘플 플레이트 온도 복귀 후, 건조 챔버에서 샘플 판을 제거한다.
9. 5 배의 실체 현미경에서 샘플 형태를 검사하고 스냅 샷 밝은 필드 이미지를 촬영.
   주 : 액정 모폴로지 같이 예상되지 않는 경우에는 같은 방법으로 새로운 샘플을 준비 할 필요가있다. 일반적인 액정 모폴로지는도 2의 상부 패널에 나타낸다.
   참고 예 5 ° C 낮은 샘플 플레이트 온도와 경우에 따라서는 건조 챔버로부터 복용 ​​전 실온으로 샘플 플레이트를 예열하는 것이 중요하다. 샘플을 증착 할 때, 예 혼합 solutio을 유지하지 마십시오n은 10 초 이상 피펫의 끝에서입니다. 샘플을 증착 한 후 다시 예 혼합 용액을 사용하지 마십시오. 도 2의 상부 패널은 다양한 샘플 플레이트의 온도로 제조 된 샘플의 시야 화상을 나타낸다.

3. 질량 분석 데이터 분석

1. 질량 분석 데이터 수집
   참고 제조 한 후, 샘플을 영상화 질량 분석법을 이용하여 분석 될 수있다. 현재 연구에서, 촬상 MS 실험은 실험실 내장 동기화 이중 극성 TOF를 이용하여 수행된다 (DP-TOF) 촬상 질량 분석계. 촬상 기능 ¹⁵ 상용 MALDI-TOF 질량 분석기는 또한 실험에 적합하다. 질량 분석기는 선형 추출 최적화 추출 지연을 갖는 양 이온 모드에서 동작된다. 이온의 운동 에너지는 20 kV로한다. 레이저 빔 크기는 시료 표면에 직경이 35㎛이며, 각 스폿의 스펙트럼은 AVE이고5 레이저 샷의 분노.
   1. MALDI 질량 분석기에 샘플 플레이트를 삽입합니다.
   2. 단계 2.1-2.9에서 조제한 시료 질량 분광 분석 이미징 수행한다.
   3. 결과 창에 표시된 질량 목록에서 특성 질량 피크를 선택하고 두 차원 이온 이미지를 플롯 "2D"을 클릭합니다.
      참고 : THAP 혼합 말 토트 리오스를 들어, 특성 피크는 말 토트 리오스, 양성자 THAP을 sodiated 및 THAP을 sodiated 있습니다. THAP 혼합 키닌 단편 (1-7)의 경우, 특징적인 피크는 브라 디 키닌 단편 (1-7), 양성자 THAP를 양성자와 THAP sodiated를 포함한다.
   4. 신호 강도의 상한 및 하한을 결정하는 팝업 창 조절 버튼을 클릭하고 "사진 저장 '을 클릭. 이 설정은 이온의 이미지의 콘트라스트를 정의한다.
      참고 : 데이터의 모든 개인 설정에서 금이 지역과 낮은 밝기를 나타내는 널 명소가 제거된다.
   5. 관찰하고 이온을 비교단계 2.9에서 찍은 밝은 필드 이미지와 이미지.
      주 : 질량 분석, 특히 이온의 이미지 구성을 이미징 상업적기구와 함께 달성 될 수있다. 때문에 데이터 수집 및 분석 소프트웨어의 다양한, 사용자는 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 장비 공급 업체에서 제공하는 소프트웨어의 지시를 따라야합니다.
2. 데이터 분석
   참고 : 샘플의 이질성이 정량적으로 분석된다. 이 데모에서는, 모든 샘플은 이온의 공간 분포를 분석하기 위해 자체 개발 한 소프트웨어에 의해 다수의 동심 영역으로 분할된다. 분석은 또한 독립형 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다.
   1. 중요하지 않은 부분을 제거하는 결과 창에 표시된 이온 이미지에서 널 명소와 금이 영역을 클릭합니다.
      주 :이 절차는 이온 이미지의 필수 영역을 정의합니다.
   2. 이온 이미지의 최 층을 찾기 위해 버튼 "가장자리를 찾아"을 클릭합니다.
   3. 데이터베이스에 최 층의 이온 풍부한 정보를 저장하고 동시에 이온 이미지에서이 층을 제거하기 위해 "공제"를 클릭합니다. 이 최 층을 나타내는 확인란 결과 윈도우의 "출력 데이터"목록에 표시됩니다.
   4. 이온 이미지의 중심이 정의 될 때까지 반복 3.2.2와 3.2.3 단계를 반복합니다.
   5. 클릭하고 "출력 데이터"목록에있는 모든 확인란을 선택하고 데이터를 내보낼 "내보내기"를 클릭합니다.
   6. 이온의 공간 분포 정보를 획득하기 위해 각 층의 평균 이온 풍부 계산 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여 보낸 데이터를 연다.

결과

밝은 필드 화상과 시료 판 (5)의 온도가 25 ° C로 제조 토트 리오스 및 브라 디 키닌 단편 (1-7)의 MS 이미지는도 1에 도시되어있다. sodiated 말 토트 리오스, 이온 신호를 중심으로 채워의 경우 샘플 영역의 주변에이를 25 ° C의 샘플 플레이트의 온도로 제조되는 경우. 5 ° C에 샘플 플레이트의 온도를 감소시킴으로써, 신호는 균일하게 전체 샘플 면적에 걸쳐 채워. 5 ...

토론

이전 이론적 예측에 기초하여, 방울 내에서의 온도 - 유도 된 유체 역학적 흐름이 외측으로 용매 증발에 의한 모세관 흐름을 극복 할 수있다. 온도가 증가 액적 내에 그라디언트 때 분자의 내부 재순환 등의 효율이 향상된다. 주위 온도에서 주변을 유지하면서 5 ℃ 하에서 샘플 플레이트의 온도를 유지하는 경우, 예측 결과에 따라, 상기 액적 내의 재순환 흐름의 평균 속도는 외측 모세관 흐름보다 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab