Préparation des échantillons MALDI homogènes pour les applications quantitatives

Résumé

Un protocole pour réduire les hétérogénéités spatiales des signaux d'ions en spectrométrie de masse MALDI en régulant la température du substrat au cours des processus de séchage de l'échantillon est démontrée.

Résumé

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Introduction

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protocole

NOTE: Ce protocole est développé pour réduire l'hétérogénéité spatiale du fragment maltotriose et la bradykinine (1-7) préparé avec la méthode sèche-gouttelettes. Le protocole consiste en trois étapes principales, y compris la préparation et le préconditionnement, le dépôt de l'échantillon et le séchage, et la masse analyse des données de spectrométrie. Les procédures sont décrites et sont décrits plus en détail ci-dessous:

1. Préparation et préconditionnement

1. Nettoyage de la plaque échantillon
   1. Porter des gants en nitrile et de la main-laver la plaque d'échantillon doucement avec du détergent et désionisée eau distillée (DDW).
   2. Rincer la plaque échantillon avec du méthanol (MeOH) et DDW.
   3. Insérez la plaque d'échantillon dans un bécher de 600 ml et remplir avec DDW.
   4. Soniquer la plaque d'échantillon dans DDW pendant 15 min dans un bain à ultrasons (200 W, 40 kHz).
   5. Retirer DDW du bêcher et remplir le bécher avec MeOH.
   6. Soniquer la plaque d'échantillon dans du MeOH pendant 15 min dans un bain à ultrasons (200 W, 40 kHz).
   7. Souffler les gouttes de solvant sur la plaque avec de l'azote gazeux et de garder la plaque d'échantillon sec avant le dépôt de l'échantillon.
2. Réglementer Chambre de séchage Température
   NOTE:. La chambre de séchage est un 35 x 20 x 45 cm ³ (L x P x H) chambre acrylique La figure 1 montre l'image de ce système de séchage. La chambre est purgée avec de l'azote gazeux à température ambiante par l'intermédiaire d'un débitmètre de gaz à un débit constant pour maintenir une condition de faible humidité relative contrôlée par un hygromètre calibré installé à l'intérieur de la chambre de séchage. Un bloc à base de cuivre dans la chambre de séchage équipée d'un circulateur d'eau à température constante programmée est utilisée pour recevoir des plaques d'échantillons en acier inoxydable. Le bloc de base de cuivre est capable de réguler la température de la plaque échantillon 5-25 ° C. Les températures de l'air, le bloc de base de cuivre, et la plaque d'échantillon sont surveillées par des thermocouples de type K.
   1. Ouvrez la porte et mettre rapidement la plaque d'échantillon sur le cuivrebloc de base puis fermez la porte.
   2. ajuster manuellement le débitmètre de gaz pour régler le débit d'azote de 10 pieds cubes standard par heure (SCFH).
   3. Surveiller l'humidité relative dans la chambre de séchage par l'hygromètre et un réglage fin du débitmètre de gaz pour assurer l'humidité relative est toujours inférieure à 25%.
   4. Surveiller la température de la plaque d'échantillons par des thermocouples de type K et régler la température de circulation d'eau manuellement jusqu'à ce que la plaque d'échantillon atteint 5 ° C pendant une expérimentation ou la température ambiante (25 ° C) pour le contrôle.
      Remarque: Afin de stabiliser la plaque d'échantillon à une température conçue, la température de circulation d'eau est généralement réglé entre 0 et 5 ° C inférieure à celle de l'échantillon prévu. Par exemple, pour maintenir 5 ° C à la plaque d'échantillons, le réglage de la température de la circulation d'eau est dans la plage de 0 à 2 ° C; pour maintenir la plaque d'échantillon à 25 ° C, la température de consigne du thermostat d'eau est comprise dans l'intervalle de 23 à 25 ° C.
   5. Vérifiez que les températures requises et l'humidité relative sont atteints (tableau 1) avant le dépôt de l' échantillon.
      Remarque: Tous les paramètres, ainsi que leurs valeurs de réglage pour les procédés de séchage à différentes températures de la plaque d'échantillon sont indiqués dans le tableau 1.
      REMARQUE: à une faible température de plaque d'échantillons, la condensation de l'eau sur la plaque d'échantillon peut se produire si la porte de la chambre est ouverte pendant une longue période. Si la condensation de l' eau se produit, fermez la porte et NE PAS déposer un échantillon sur elle jusqu'à ce que la condensation de l' eau est séché.
3. Préparation de la matrice et Analyte Solutions
   1. Préparation des solutions de matrice
      1. Préparer une solution 0,1 M THAP avec 50% d'acétonitrile (ACN): 50% de solution aqueuse DDW.
   2. Préparation des analytes
      1. Préparer 10 ^-4 M solution maltotriose avec DDW.
      2. Préparer 10 ^-5 M fragment de la bradykinine (1-7) dans une solution à 50% d' acétonitrile(ACN): 50% de solution aqueuse DDW.

2. Le dépôt de l'échantillon et de séchage

1. Prémélange 0,25 ul de solution THAP 0,1 M et 0,25 pi de 10 ^-4 M ou maltotriose 10 ^-5 M fragment de la bradykinine (1-7) des solutions dans un microtube.
2. Vortex la solution mélangée pendant 3 sec.
3. Centrifuger la solution mélangée pendant 2 secondes (2000 x g) pour recueillir la solution au fond du tube de centrifugation.
4. Ouvrez la porte de la chambre de séchage, soigneusement déposer 0,1 ul de la solution sur la plaque d'échantillon à la pipette et fermer la porte immédiatement.
5. Attendez que l'échantillon gouttelette de sécher.
   . NOTE: Les temps de séchage habituellement observées avec des températures différentes de la plaque d'échantillon sont énumérés dans le tableau 1 pour la température de la plaque d'échantillon de 5 ° C, le temps de séchage moyen est de 800 à 1.000 sec; pour la température de la plaque d'échantillon de 25 ° C, le temps de séchage moyenne est de 100 à 150 sec.
6. Après séchage, ouvrir la porte de la chambre de séchage.
7. Régler la température de circulation d'eau à température ambiante (25 ° C).
   REMARQUE: Passer cette étape si la plaque d'échantillon est maintenu en permanence à la température ambiante (25 ° C) pendant le processus de séchage.
8. Après les échantillons de température de la plaque revient à la température ambiante (25 ° C), retirer la plaque d'échantillon de la chambre de séchage.
9. Examiner l'échantillon morphologie sous un stéréomicroscope 5X et prendre une image instantanée champ lumineux.
   NOTE: Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu, il est nécessaire de préparer un nouvel échantillon à la même procédure. Morphologies cristallines typiques sont présentés dans les panneaux supérieurs de la figure 2.
   REMARQUE: Dans les cas où la température basse de la plaque d'échantillons, tels que 5 ° C, il est important de chauffer la plaque à la température ambiante avant de le sortir de la chambre de séchage de l'échantillon. Lors du dépôt des échantillons, NE PAS garder le solutio prémélangéen dans la pointe de la pipette en 10 sec. NE PAS utiliser à nouveau la solution prémélangée après le dépôt des échantillons. Les panneaux supérieurs de la figure 2 montrent des images lumineuses champ d'échantillons préparés avec des températures différentes de la plaque d'échantillon.

3. Analyse des données de spectrométrie de masse

1. Spectrométrie de masse d'acquisition de données
   NOTE: Après la préparation, l'échantillon peut être analysé par spectrométrie de masse d'imagerie. Dans l'étude actuelle, les imagerie expériences MS sont réalisées à l' aide d' un synchronisé TOF double polarité de laboratoire intégré (DP-TOF) spectromètre de masse d'imagerie. ¹⁵ Commercial MALDI-TOF spectromètres de masse avec capacité d'imagerie sont également appropriés pour de telles expériences. Le spectromètre de masse est utilisé dans l'extraction linéaire et modes d'ions positifs avec des retards d'extraction optimisés. L'énergie cinétique des ions est de 20 kV. La taille du faisceau laser est de 35 um de diamètre sur la surface de l'échantillon, et le spectre de chaque endroit est le average de 5 tirs laser.
   1. Insérez la plaque d'échantillon dans le spectromètre de masse MALDI.
   2. Effectuer l'imagerie de masse analyse par spectrométrie à l'échantillon préparé dans les étapes 2.1-2.9.
   3. Sélectionnez un pic de masse caractéristique de la liste de masse affichée dans la fenêtre de résultat et cliquez sur "2D" pour tracer une image d'ions à deux dimensions.
      NOTE: Pour maltotriose mélangé avec THAP, les pics caractéristiques sont sodiated maltotriose, THAP protonée et sodiated THAP. Pour fragment de bradykinine (1-7) mélangé avec THAP, les pics caractéristiques comprennent protonés fragment de bradykinine (1-7), protonée THAP et sodiated THAP.
   4. Cliquez sur les boutons de réglage dans la fenêtre pour déterminer les limites supérieure et inférieure de l'intensité du signal et cliquez sur "enregistrer une image". Ce paramètre définit le contraste des images d'ions.
      NOTE: Dans chaque jeu individuel des données, les zones fissurées et les taches nulles montrant faible luminosité sont éliminés.
   5. Observer et comparer l'ionimage avec l'image lumineuse de champ qui a été prise à l'étape 2.9.
      NOTE: L'imagerie par spectrométrie de masse et la construction d'images d'ions particuliers peut être réalisé avec des instruments commerciaux. En raison de la variété de l'acquisition de données et de logiciels d'analyse, les utilisateurs doivent suivre les instructions logicielles fournies par le vendeur de l'appareil pour obtenir des images de haute qualité.
2. L'analyse des données
   NOTE: L'hétérogénéité des échantillons est analysé quantitativement. Dans cette démonstration, chaque échantillon est divisé en plusieurs zones concentriques par des logiciels développés en interne pour analyser la distribution spatiale des ions. L'analyse peut également être effectuée en utilisant un logiciel d'analyse de données autonome.
   1. Cliquez sur les points nuls et les zones fissurées dans l'image ionique indiqué dans la fenêtre de résultat pour éliminer les zones sans importance.
      NOTE: Cette procédure définit la zone essentielle image ionique.
   2. Cliquez sur "trouver bord" bouton pour trouver la couche outmost de l'image d'ions.
   3. Cliquez sur "déduire" pour enregistrer les informations de l'abondance d'ions de la couche outmost dans une base de données et enlever cette couche de l'image d'ions simultanément. Une case à cocher représentant cette couche outmost apparaîtra dans la liste des "données de sortie" de la fenêtre de résultat.
   4. Répéter les étapes 3.2.2 et 3.2.3 jusqu'à ce que le centre de l'image d'ions est définie.
   5. Cliquez sur et sélectionnez toutes les cases à cocher dans la liste des "données de sortie" et cliquez sur "export" pour exporter les données.
   6. Ouvrez les données exportées en utilisant le logiciel de feuille de calcul pour calculer l'abondance d'ions moyenne de chaque couche pour obtenir les informations de distribution spatiale des ions.

Résultats

Les images champ clair, ainsi que les images du fragment maltotriose et la bradykinine (1-7) préparé avec la température de la plaque d'échantillon de 5 et 25 ° C MS sont représentés sur la figure 1. Dans le cas du maltotriose sodiated, le signal d'ions principalement Remplit à la périphérie de la zone d'échantillon lorsqu'il est préparé avec une température de la plaque d'échantillon de 25 ° C. En diminuant la température de la plaqu...

Discussion

Sur la base des prédictions théoriques précédentes, les flux hydrodynamiques induites par la température à l'intérieur des gouttelettes peuvent surmonter l'extérieur des flux capillaires induits par évaporation du solvant. L'efficacité d'une telle recirculation interne des molécules est accrue lorsque la température des gradients dans une augmentation des gouttelettes. D'après les résultats prévus, en maintenant la température de la plaque d'échantillon à 5 ° C tout en maintena...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab