Preparazione dei campioni MALDI omogenei per applicazioni quantitative

Riepilogo

Lo dimostra un protocollo per la riduzione eterogeneità spaziali di segnali di ioni in spettrometria di massa MALDI regolando la temperatura del substrato durante i processi di essiccazione del campione.

Abstract

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. The heterogeneity of ion signals is a severe problem in MALDI, which results in poor data reproducibility and makes MALDI unsuitable for quantitative analysis. By regulating sample plate temperature during sample preparation, thermal-induced hydrodynamic flows inside droplets of sample solution are able to reduce the heterogeneity problem. A room-temperature sample preparation chamber equipped with a temperature-regulated copper base block that holds MALDI sample plates facilitates precise control of the sample drying condition. After drying of sample droplets, the temperature of sample plates is returned to room temperature and removed from the chamber for subsequent mass spectrometric analysis. The areas of samples are examined with MALDI-imaging mass spectrometry to obtain the spatial distribution of all components in the sample. In comparison with the conventional dried-droplet method that prepares samples under ambient conditions without temperature control, the samples prepared with the method demonstrated herein show significantly better spatial distribution and signal intensity. According to observations using carbohydrate and peptide samples, decreasing substrate temperature while maintaining the surroundings at ambient temperature during the drying process can effectively reduce the heterogeneity of ion signals. This method is generally applicable to various combinations of samples and matrices.

Introduzione

Mass spectrometry (MS) is one of the most important analytical techniques for analyzing the molecular compositions of complex samples. Among all the ionization methods used in MS, matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is the most sensitive and widely used method in bioanalytical applications.¹ In comparison to other ionization techniques, MALDI has the highest sensitivity and high tolerance to salt contaminants. Such analytical properties make MALDI the first choice for carbohydrate analysis and many proteomics applications. However, sample preparation is a crucial step for obtaining high quality data in MALDI-MS.

The most commonly used sample preparation method for MALDI-MS is the dried-droplet method, in which sample droplets are deposited on a surface and dried under ambient conditions. This drying method is simple and generally effective.^2-5 However, a common problem in the dried-droplet method is that the resultant analyte/matrix crystals normally distribute irregularly. In many cases, the crystals aggregate at the periphery of sample areas, resulting in the so-called ring-stain formation.^6-8 The heterogeneous crystal morphologies affect the spatial distribution of analyte molecules, which results in severe fluctuation in ion signal over sample areas. Such severe signal fluctuations and poor data reproducibility are known as the "sweet spot" problem in MALDI-MS.⁹ Thus, there is a great need for reducing spatial heterogeneities in MALDI-MS dried droplet applications.

Hydrodynamic flows in the sample droplet play an important role in determining the spatial distribution of samples prepared with the dried-droplet method.^10-12 It was found that the evaporation of solvent induces outward capillary flows within droplets, which are responsible for the ring-stain formation.^7,10 In contrast, recirculation flows induced by tangential surface-tension gradients may counterbalance the outward capillary flows.¹³ If the recirculation flow speeds are higher than that of the outward capillary flows, the samples can be efficiently redistributed to reduce the heterogeneity problem.¹⁴

In this work, we demonstrate a detailed protocol for preparing samples with a simple drying chamber to induce efficient recirculation flows during droplet drying processes. Droplet drying conditions are precisely controlled, including the temperatures of the sample plate and its surroundings, and the relative humidity within the chamber. The model analytes include maltotriose and bradykinin chain (1-7). The matrix used for the demonstration is 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP). The samples are examined with time-of-flight (TOF) MS, and the data are analyzed quantitatively to show the reduction of heterogeneity.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo è sviluppato per ridurre l'eterogeneità spaziale maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con il metodo essiccati gocciolina. Il protocollo consiste di tre fasi principali, compresa la preparazione e precondizionamento, la deposizione del campione e l'essiccazione, e l'analisi dei dati di spettrometria di massa. Le procedure sono delineati e descritti più in dettaglio qui di seguito:

1. Preparazione e precondizionamento

1. Pulizia del piatto del campione
   1. Indossare guanti di nitrile e mano-lavare delicatamente la piastra campione con detergente e acqua distillata-deionizzata (DDW).
   2. Lavare il piatto del campione con metanolo (MeOH) e DDW.
   3. Inserire la piastra campione in un becher da ml 600 e riempire con DDW.
   4. Sonicare piatto del campione in DDW per 15 minuti in un bagno a ultrasuoni (200 W, 40 kHz).
   5. Rimuovere DDW dal bicchiere e riempire il bicchiere con MeOH.
   6. Sonicare piatto del campione in MeOH per 15 minuti in bagno ad ultrasuoni (200 W, 40 kHz).
   7. Soffiare via le gocce di solvente sul piatto con gas azoto e mantenere la piastra campione asciutto prima deposizione del campione.
2. Regolazione della temperatura di asciugatura Camera
   NOTA:. La camera di essiccazione è un 35 x 20 x 45 cm ³ (L x P x A) camera di acrilico La figura 1 mostra l'immagine di questo sistema di asciugatura. La camera è pulita con temperatura ambiente azoto gassoso attraverso un misuratore di flusso di gas ad una portata costante per mantenere una condizione di bassa umidità relativa monitorata da un igrometro calibrato installato all'interno della camera di essiccazione. Un blocco base di rame nella camera di essiccazione dotato di una costante circolatore dell'acqua temperatura programmata Serve per targhe di esempio in acciaio inox. Il blocco base in rame è in grado di regolare la temperatura della piastra del campione da 5 a 25 ° C. Le temperature dell'aria, blocco base di rame, e la piastra sono controllate da K-termocoppie.
   1. Aprire la porta e rapidamente mettere piatto del campione sul rameblocco di base quindi chiudere la porta.
   2. Regolare manualmente il misuratore di portata di gas per impostare il flusso di azoto a 10 piedi cubi standard per ora (SCFH).
   3. Monitorare l'umidità relativa nella camera di essiccazione dal igrometro e calibrare il misuratore di portata di gas per assicurare l'umidità relativa è sempre inferiore al 25%.
   4. Monitorare la temperatura del piatto del campione mediante termocoppie di tipo K e regolare manualmente la temperatura dell'acqua circolatore finché la piastra campione raggiunge 5 ° C per esperimento oa temperatura ambiente (25 ° C) per il controllo.
      NOTA: Al fine di stabilizzare il piatto del campione ad una temperatura progettato, la temperatura dell'acqua circolatore è in genere impostato tra 0 e 5 ° C inferiore rispetto al campione progettato. Ad esempio, per mantenere 5 ° C al piatto del campione, la temperatura del circolatore acqua è nell'intervallo da 0 a 2 ° C; per mantenere la piastra di campione a 25 ° C, la temperatura del circolatore acqua è nell'intervallo da 23 a 25 ° C.
   5. Assicurarsi che le temperature richieste e l'umidità relativa vengono raggiunti (Tabella 1) prima della deposizione del campione.
      NOTA: Tutti i parametri ei loro valori di regolazione per i processi di essiccazione a temperature diverse piastre campione sono riportati in Tabella 1.
      NOTA: A bassa temperatura piatto del campione, condensa sulla piastra campione può verificarsi se la porta della camera aperta per lungo tempo. In caso di condensa di acqua, chiudere la porta e NON depositare qualsiasi campione su di esso fino a quando la formazione di condensa è asciugata.
3. Preparazione di Matrix e Analita Solutions
   1. Preparazione delle soluzioni matrice
      1. Preparare 0,1 soluzione M THAP con il 50% acetonitrile (ACN): 50% soluzione acquosa DDW.
   2. Preparazione di analiti
      1. Preparare 10 ^-4 soluzione maltotriosio M con DDW.
      2. Preparare 10 ^-5 M frammento bradichinina (1-7) soluzione nel 50% acetonitrile(ACS): 50% soluzione acquosa DDW.

2. Deposizione del campione e asciugatura

1. Premix 0,25 ml di soluzione di THAP 0,1 M e 0,25 ml di 10 ^-4 M maltotriosio o 10 ^-5 M frammento bradichinina (1-7) soluzioni in una provetta.
2. Agitare la soluzione mista per 3 sec.
3. Centrifugare la soluzione mista per 2 sec (2.000 xg) per raccogliere la soluzione al fondo della provetta.
4. Aprire la porta della camera di essiccazione, accuratamente depositare 0,1 ml di soluzione sul piatto del campione con pipetta e chiudere immediatamente la porta.
5. Attendere che la goccia del campione si asciughi.
   . NOTA: I tempi di essiccazione tipicamente osservati con differenti temperature piatto del campione sono elencati nella tabella 1 per la temperatura della piastra campione di 5 ° C, il tempo medio di asciugatura è di 800 a 1.000 sec; per temperatura della piastra campione di 25 ° C, il tempo medio di essiccazione è da 100 a 150 sec.
6. Dopo l'essiccazione, aprire la porta della camera di essiccazione.
7. Impostare la temperatura dell'acqua circolatore a temperatura ambiente (25 ° C).
   NOTA: Saltare questo punto se la piastra campione viene mantenuta costantemente a temperatura ambiente (25 ° C) durante il processo di essiccazione.
8. Dopo la temperatura della piastra campione ritorni a temperatura ambiente (25 ° C), rimuovere la piastra campione dalla camera di essiccazione.
9. Esaminare la morfologia del campione allo stereomicroscopio 5X e prendere l'immagine in campo chiaro un'istantanea.
   NOTA: Se le morfologie cristalline non sono come previsto, è necessario preparare un nuovo campione con la stessa procedura. Morfologie cristalline tipiche sono illustrate nei pannelli superiori della figura 2.
   NOTA: Nei casi con temperature piastra campione basse, ad esempio 5 ° C, è importante riscaldare il piatto del campione a temperatura ambiente, mette fuori dalla camera di essiccazione. All'atto del deposito dei campioni, non mantenere la solutio premiscelaton nella punta della pipetta di oltre 10 secondi. NON usare di nuovo la soluzione premiscelata dopo aver depositato i campioni. I pannelli superiori della figura 2 mostrano immagini in campo chiaro di campioni preparati con diverse temperature della piastra del campione.

Analisi 3. Spettrometria di massa dei dati

1. Spettrometria di Massa Data Acquisition
   NOTA: Dopo la preparazione, il campione può essere analizzato utilizzando la spettrometria di massa imaging. Nel corso di studio, gli esperimenti di imaging MS sono condotti utilizzando un sincronizzato TOF doppia polarità laboratorio integrato (DP-TOF) spettrometro di massa di imaging. ¹⁵ Commercial MALDI-TOF spettrometri di massa con capacità di imaging sono adatti a tali esperimenti anche. Lo spettrometro di massa è gestito in estrazione lineare e modalità di ioni positivi con ritardi di estrazione ottimizzate. L'energia cinetica degli ioni è di 20 kV. La dimensione del fascio laser è di 35 micron di diametro sulla superficie del campione, e lo spettro di ogni punto è la avela rabbia di 5 colpi laser.
   1. Inserire la piastra del campione nello spettrometro di massa MALDI.
   2. Eseguire l'imaging spettrometria di massa per il campione preparato nei passaggi 2.1-2.9.
   3. Selezionare un picco di massa caratteristica dall'elenco di massa mostrato nella finestra dei risultati e fare clic su "2D" per tracciare un'immagine ioni bidimensionale.
      NOTA: Per maltotriosio mescolato con THAP, i picchi caratteristici sono sodiated maltotriosio, THAP protonata e sodiated THAP. Per frammento bradichinina (1-7) miscelato con THAP, i picchi caratteristici comprendono protonati frammento bradichinina (1-7), protonata THAP, e sodiated THAP.
   4. Fare clic sui pulsanti di regolazione nella finestra pop-up per determinare i limiti superiore e inferiore della intensità del segnale e fare clic su "salvare un'immagine". Questa impostazione definisce il contrasto delle immagini di ioni.
      NOTA: in ogni set individuale dei dati, le regioni e le macchie screpolate nulli mostrano bassa luminosità sono eliminati.
   5. Osservare e confrontare lo ioneimmagine l'immagine in campo chiaro che è stata presa al punto 2.9 con.
      NOTA: imaging con spettrometria di massa e costruzione di immagini di particolari ioni può essere realizzato con strumenti commerciali. A causa della varietà di acquisizione dati e software di analisi, gli utenti devono seguire le istruzioni software forniti dal fornitore dello strumento per ottenere immagini di alta qualità.
2. Analisi dei dati
   NOTA: L'eterogeneità dei campioni viene analizzato quantitativamente. In questa dimostrazione, ogni campione viene diviso in più zone concentriche di software sviluppati internamente per analizzare la distribuzione spaziale degli ioni. L'analisi può essere eseguita anche utilizzando software di analisi dati stand-alone.
   1. Clicca i punti nulli e le regioni incrinate l'immagine di ioni mostrata nella finestra dei risultati in per rimuovere aree non importanti.
      NOTA: Questa procedura definisce l'area essenziale dell'immagine ionico.
   2. Fare clic sul pulsante "edge trovare" per trovare strato esterno dell'immagine di ioni.
   3. Fai clic su "dedurre" per salvare le informazioni ioni abbondanza dello strato esterno in un database e rimuovere questo strato dall'immagine ioni contemporaneamente. Una casella di controllo che rappresenta questo strato più esterno apparirà nel "dati di uscita" lista della finestra dei risultati.
   4. Ripetere i punti 3.2.2 e 3.2.3 fino viene definito il centro dell'immagine ione.
   5. Fare clic e selezionare tutte le caselle di controllo nella lista "dati di uscita" e fare clic su "Esporta" per esportare i dati.
   6. Aprire i dati esportati utilizzando il software foglio di calcolo per calcolare l'abbondanza media di ioni di ogni livello per ottenere le informazioni distribuzione spaziale degli ioni.

Risultati

Le immagini in campo chiaro e le immagini MS di maltotrioso e bradichinina frammento (1-7) preparato con temperatura della piastra campione di 5 e 25 ° C sono mostrati in Figura 1. Nel caso di maltotriosio sodiated, il segnale ione principalmente popola alla periferia dell'area campione quando viene preparato con una temperatura della piastra campione di 25 ° C. Diminuendo la temperatura della piastra del campione a 5 ° C, il segnale popola omogeneamente su tutta ...

Discussione

Sulla base di precedenti previsioni teoriche, temperatura indotta flussi idrodinamici all'interno gocce possono superare verso l'esterno flussi capillari indotte da evaporazione del solvente. L'efficacia di tale ricircolo interno delle molecole è maggiore quando la temperatura gradienti di un aumento gocciolina. Secondo i risultati previsti, quando mantenendo la temperatura della piastra campione sotto 5 ° C, mantenendo l'ambiente circostante a temperatura ambiente, la velocità media dei flussi di ric...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)	Sigma-Aldrich	T64602
Bradykinin fragment (1-7)	Sigma-Aldrich	B1651
Maltotriose	Sigma-Aldrich	47884
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 ml beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Centrifuge	Select BioProducts	Force Mini
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	this lab
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS)	this lab
MALDI-TOF stainless steel sample target	this lab