Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Makale, birçok numuneyle yapılan çalışmalarda toprak mikrobik topluluk yapısını belirlemek için hem toplam lipidlerin hem de gösterge lipidlerinin göreceli olarak bolluğunun karakterize edilmesinde kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipidlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu denkleştirirken, verimliliği arttıran bir yöntemi açıklıyor.

Özet

Mikrobiyal topluluklar, ekosistem süreçlerinin önemli sürücüleri ve düzenleyicileri. Ekosistemlerin yönetiminin mikrobik toplulukları nasıl etkilediğini anlamak için, mikrobiyal topluluk kompozisyonunu belirlemek için nispeten hassas ama çaba harcayan bir teknik, fosfolipid yağ asidi (PLFA) analizidir. PLFA, mikrobik biyokütlenin göstergeleri ve mantarların ve bakterilerin geniş fonksiyonel gruplarının bileşimi olarak kullanılabilen fosfolipit biyolojik belirteçlerini analiz etmek için geliştirildi. Alternatif bitki toplulukları, ekoloji ve yönetim rejimleri altında toprakları karşılaştırmak için sıklıkla kullanılmıştır. PLFA metodunun mikrobiyal topluluk kompozisyonundaki değişimlerin saptanmasına duyarlı olduğu gösterilmiştir.

Toplam lipidlerin, fosfolipid fraksiyonunun ayrımı yapılmadan, saf kültürlerden, mikrobiyal tanımlama tekniği olarak hızla ekstraksiyonu için alternatif bir yöntem olan yağ asidi metil ester ekstraksiyon ve analiz (MIDI-FA) geliştirildi. Bu yöntemHızlıdır fakat toprak numuneleri için daha az uygundur, çünkü toprak parçacıklarını ayıran ilk adımdan yoksundur ve bunun yerine toprağın arka plan organik maddesinden artefaktlar üreten bir sabunlaşma reaksiyonu ile başlar.

Bu makale, birçok numuneyle yapılan çalışmalarda toprak mikrobik topluluk yapısını belirlemek için toplam lipidlerin ve gösterge lipidlerinin göreceli olarak bolluğunun karakterize edilmesinde kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipidlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu denkleştirirken, verimliliği arttıran bir yöntemi açıklamaktadır. Yöntem, birinci adım olarak toprak lipidlerini çıkarıp konsantre hale getirerek ve elde edilen organik materyali sabunlaştırarak ve ikinci adım olarak MIDI-FA yöntemiyle işleyerek, PLFA profillemesi yoluyla elde edilen doğruluğu bir araya getirir.

Giriş

Besin maddesi döngüsü 1'de mikroorganizmaların kilit rolü göz önüne alındığında, bitki topluluğunun kompozisyonunun değiştirilmesi 2 , bitki verimliliğinin düzenlenmesi 3 ve organik maddenin ayrışması 4 , toprak mikrobik topluluklarını anlamak karasal ekosistemlerin anlaşılması için yaşamsal önem taşır.

Toprağa nispeten yüksek miktarda verimi ve kimyasal işaretleri nedeniyle, lipid biyobelirteçleri, toprak mikrobik topluluklarından 5 oluşan baskın ekolojik grupları profillemek için kullanılabilir. Farklı mikrobiyal grupların karakteristik lipid biyobelirteçlerini belirleyerek total lipidleri tahmin edebilir ve daha sonra bu lipitleri Gram pozitif (Gm +) ve Gram negatif (Gm-) bakteriler, arbusküler mikorizal (AM) ve saprotrofik gibi ekolojik olarak ilgili gruplara ayırabiliriz Mantarlar ve aktinomisetler 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .

Mikrobiyal cemaatlerin özelliklerini tanımlamak için pek çok yöntem var. PLFA yöntemi, temel mikrobik topluluk yapısını anlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Mikrobiyal grupların görece bolluğunu ve toplam mikrobik biyokütleyi değerlendirmek etkili bir yoldur. Hızlı lipid ciroya bağlı olarak, PLFA profillemesi, toprak mikrobik topluluğundaki değişikliklerin nispeten hızlı bir şekilde tespit edilmesine izin verir ve ekosistem fonksiyonunun, örneğin fungal: bakteri oranlarının, besin maddesi sikluslarının oranlarını değerlendirmek için karşılaştırılmasını sağlayan bilgi verir 1 , 9 , 10 . Bununla birlikte, PLFA ekstraksiyon metodu zamanı geldi ve iyi saygı görürken, aynı zamanda zaman alıcıdır ve saha ölçeğinde tekrarlanan numunelerin çok sayıda gerektiren ekosistem ölçeğinde çalışmalara iyi bir şekilde uyum sağlamazF "> 11 , 12 .

Aksine, yağ asidi metil ester ekstraksiyon yöntemi (MIDI-FA), hızlı üretimine izin verme potansiyeline sahiptir. Bu yöntemde örnekler sabunlaştırılır, FAME'lara dönüştürülür, çıkarılır ve analiz edilir. MIDI-FA yöntemi, lipidlerin ekstraksiyonunu farklı lipid sınıfları 13 (fosfolipitler, nötr lipidler ve glikolipidler) ayıran PLFA'dan daha hızlı fakat daha az ayırdedici niteliktedir.

Bu protokolde hem PLFA hem de MIDI-FA lipid profillemesinin unsurlarını bir araya getiren bir yöntemi açıklıyoruz. Modifiye Bligh ve Dyer yönteminin ilk kloroform ekstraksiyon adımlarını kullanarak lipidlerin ekstraksiyonunu ve ardından sabunlaştırma ve Fame'lere dönüşümü kullanır. Bu sigara mikrobik malzemenin 5, 14 arka plan gürültüsünün çok hariç ise mikrobik topluluk yapısını tespit etmek için sağlam bir yol sağlar . Bu yöntem hem PLFA hem de MIDI-FA protokolleri arasında bir denge kurmak için geliştirildi, yani pek çok numune ile büyük ölçekli çalışmalardan lipidleri analiz etmek için lojistik ve ekonomik olarak mümkün olan iş hacmini arttırırken doğrunun çoğunu muhafaza eder 15 . MIDI-FA'yi gerçekleştirmeden önce organik olarak çözünen bileşenlerin ( örneğin lipidlerin) izole edilmesi ve izole edilmesi ve bunu bir saflaştırma adımıyla tamamlayarak, protokol hız ve hassaslık arasında bir denge sunar.

Protokol

NOT: Usul boyunca her zaman uygun kişisel koruyucu ekipmanı (PPE) giyin. Olası örnek kirliliğini önlemek için, cam eşyalara çıplak elle dokunmayın. Kloroform gerektiren protokol adımlarında uygun eldiven takın.

1. Preparatlar (~ 40 numune için 2 Gün)

  1. Toprağı steril poşetlere toplayın ve tarladaki buz içeren bir soğutucuya nakledin. Taze toprağı eleyip derhal dondurmak mümkün değilse, analizleri başlatmaya hazır olana kadar örnekleri -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
  2. Homojenizasyon ile toprağı hazırlayın. Kökleri ve taşları çıkarın ve kalın eleklerle ( örn. 2 mm) çatlakları parçalayın.
  3. Dondurarak kurutma makinesinin talimatlarına uygun olarak alt kapları uygun bir kaba koyarak mümkün olduğunca çabuk dondurarak kurutun. Topraklar dondurularak kurutulduktan sonra, kurutulana kadar kurutucu ile kapalı bir kapta saklayın. En iyisiEn az -20 ° C'de, ancak tercihen -80 ° C'de dondu.
  4. Ekstraksiyona hazırlanırken, donmuş kurutulmuş toprakları depolamadan kaldırın ve un gibi bir kıvama getirin. Taşlama yöntemleri, bilyalı değirmen, top çırpıcı ve harç ve havlu içerir. Toprağı taşladıktan sonra dondurucuda saklayın (bkz. 1.3).
    NOT: Ekstraksiyon için kullanılan numune miktarı, organik madde içeriğine bağlıdır. Genel bir kılavuz, ağırlıkla% 12-18 karbon olan bir toprağın 0.5-1 g'ını ve ağırlıkça% 1-3 karbonlu bir toprak için 3-5 g kullanılmasıdır.
  5. 30 mL'lik santrifüj tüplerini hekzan ile önceden yıkayın. Tüplere yaklaşık 2 ila 3 mL heksan ilave edin ve 5 saniye boyunca girdaplayın. Başka bir boruya dekante heksan ve vorteks. Altı tüpü seri olarak durulamak için heksan (2 ila 3 mL) kullanılabilir. Heksan yıkanmış tüpleri duman kaputunda ters çevirin ve kullanılmış hekzan'ı uygun bir atık kabına atın.
  6. Camı 2-3 kat alüminyum folyoya sarın ve süret fırınına yerleştirin. fırında pişirmek(Mufle) camı 450 ° C'de 4.5 saat süreyle.
  7. Reaktifleri hazırlayın.
    1. CHCI3: fosfat tampon maddesi (p-tamponu) 2 hacim oranı 1: kullanılan toprak miktarı için, bir 0.8 kimyasal madde ilave MeOH.
    2. P-tampon çözeltisi hazırlayın: Fosfat-Tampon: 0.1 M, pH 7.0.
      1. 61 mL 1M K 2 HPO 4 stok, steril (kimyasal ACS sertifikalı veya daha iyi olmalıdır) ekleyin. 39 mL 1 M KH 2 PO 4 stoğu ekleyin, steril (kimyasal ACS sertifikalı veya daha iyi olmalıdır). Tip 1 su ile 1000 mL'ye doldurun. NaOH veya HC1 ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Kullanılmayan çözeltiyi ortam sıcaklığında 7 gün veya buzdolabında 30 gün depolayın.
      2. Alternatif olarak, K 2 10.62 g HPO 4 ve KH 2 PO 4, 5.31 g tartın; Tip 1 su ile 1 L'ye seyreltin. PH değerini kontrol edin, gerekiyorsa ayarlayın.
    3. Reaktif 1, Sabunlaşma Reaktifini hazırlayın.
      1. 300 mL Tip 1 suyunu boşaltın.CH3 OH 300 ml (HPLC sınıfı veya daha yüksek) ekleyin. 90.00 g NaOH (sertifikalı ACS veya daha iyi) ekleyin. Karıştırırken NaOH peletleri solüsyona ilave edin. Pellet çözülene kadar karıştırın. Bu çözeltinin en fazla 30 d depolanması önerilir.
    4. Reaktif 2, Metilasyon Reaktifini hazırlayın.
      1. CH3 OH 275 mL (HPLC derece ya da daha yüksek) koyun. Karıştırırken 325 mL onaylı 6,00 N HCL ilave edin. Bu çözeltinin en fazla 30 d depolanması önerilir.
    5. Reaktif 3 hazırlayın Ekstraktıon Reagent:% 50 C 6H 14 (Heksan),% 50 C5H 12 O (MTBE).
      1. Duman haznesinde, 200 mL C 6 H 14 (HPLC derecesi veya daha yüksek) ve 200 mL C 5 H 12 O (HPLC derecesi veya üstü) birleştirin. İyice karıştırın; Sıkıca kapa Yanıcı kabin veya davlumbazda 1 yıldan fazla saklayın.
    6. Reaktif 4, Taban yıkama Reaktifini hazırlayın.
      1. DağıtML Tip 1 suyun beherine ilave edin. Karıştırırken 10.80 g NaOH (Onaylı ACS veya daha iyisi) ilave edin. Pellet çözülene kadar karıştırın. Bu çözeltinin en fazla 30 d depolanması önerilir.
    7. İç standart stok çözüm hazırlayın.
      1. 100 mg 19: 0 EE standardını tartın. 50 mL heksan-yıkanmış hacimsel şişeye ilave edin. Şişeye ~ 15 mL Heksan-MTBE solüsyonu (reaktif 3) ilave edin, çözülmesi için döndürünüz. Heksan-MTBE çözeltisi (reaktif 3) ile 50 mL'ye dökülür. Kapak ve karıştırmak için girdap. PTFE kaplı kapaklar ile heksan ile durulanmış cam tüplere aktarın ve -20 ° C'de saklayın.

2. GÜN 1 - Yağ Asitlerinin Topraktan Çıkarılması (~ 40 numune için 4-5 saat)

  1. P-tampon, kloroform ve metanol için üç ila 10 mL'lik dağıtma pipetlerini hazırlayın.
    NOT: Ekstrakt olarak kloroforma karşı daha az tehlikeli alternatifler önerilmiştir. Bunlar eşdeğer lipid geri kazanım oranlarına neden olabilir 16 , 17 , ancak bu protokolde değerlendirilmez.
  2. Dondurularak kurutulmuş topraklar 30 mL'lik santrifüj tüplerine tartılır ve toprağın kütlesi kaydedilir.
  3. İki boşluk yapın ve bir kontrol standardı ekleyin (daha önce ekstrakte edilen bir toprak).
  4. Davlumbaz, şu sırada santrifüj tüpüne toprağa reaktifleri ekleme: P-tamponu, CHCI3 ve MeOH (Tablo 1). CHCl 3 eklemeden önce toprakların P-tampon ilavesinden sonra ıslanmasını bekleyin. Santrifüj tüplerini sıkıca kapatın ve ışığı korumak için üzerini örtün.
  5. Yatırılmaları iyi düzenlenmiş olduğundan emin olarak yatay olarak çalkalayıcıya yerleştirin. 280 rpm'deki hız ayarı ile 1 saat boyunca çalkalayın 18 .
  6. Her numune için iki adet 16 mm x 150 mm cam tüp hazırlayın; tüp etiketleyin ve aynı miktarda CHCl 3 ve eşit miktarda P-tampon ekleyin.
  7. Santrifüj tüplerini çalkalayıcıdan çıkartın ve 1,430'da 10 dakika boyunca santrifüjleyinXg ve 25 ° C. Faz ayrımı cam tüpünde görülmelidir.
  8. Duman haznesinde, süpernatanı santrifüj tüpünden adım 2.6'da hazırlanan tüplerden birine boşaltın. 2.4 ile 2.5 arasındaki adımları tekrarlayın ve süpernatanı ikinci tüpe boşaltın.
  9. PTFE kaplı kapaklarla tüm 16 mm × 150 mm cam tüpleri güvenli bir şekilde kapatın ve karıştırmak için 10 x ters çevirin.
  10. İki fazın ayrılmasını tamamlamak için numunelerin gece boyunca rahatsız edilmemesine izin verin. Bunu yapmak için örnekleri karanlık bir kabin / alana koyun veya oda sıcaklığında alüminyum folyo ile örtün. Ekstraktların hafta sonu boyunca ayrılmasına izin vermek kabul edilebilir.
    1. Alternatif olarak, doğrudan bir sonraki adıma geçmek veya numuneler ertesi gün rahatsız edilirse, 1000 xg ve 25 ° C'de 10 dakika süreyle numuneleri santrifüjleyin.
      NOT: Bir karşılaştırma grubu içindeki tüm numuneleri, aynı faz ayrımlı durma süresine tabi tutun.

3 GÜN2 - Lipidlerin izolasyonu (~ 40 numune için 3-4 saat)

  1. Buharlaştırma aparatını ve çözücü tuzağını açın. Buharlaşma cihazını 33 ° C'ye ayarlayın ve ön ısıtın.
  2. Davlumbazın içine vakum aspiratörü ayarlayın: Vakum pompasına bağlı yan kollu bir şişe, bir miktar yüksek saflıktaki boru ve bir cam pipet.
  3. Sulu tabakayı koruyarak iki cam borunun üst tabakasını ve ara yüzeyini (aşağı doğru yaklaşık 2/3) aspire edin. Her numune için temiz bir pipet kullanarak işlemi tekrarlayın.
  4. İkinci tüpteki ekstraktın sulu tabakalarını birinci tüpteki sulu tabakaları dikkatli bir şekilde süzülerek birleştirin. Çıkartılan tüpün çizik veya çatlaksız olduğundan emin olun.
  5. CHCl 3 ekstraktları birleştirildikten sonra sıvıyı muayene edin - temiz olmalıdır. Eğer temizlenene kadar MeOH ilave etmeyin.
  6. Vakum buharlaştırma aparatı kullanarak tüm numuneleri kurutun. Sıcaklık 33 ° C, girdap hızı% 26 ve basınç 400 mbar ayarlarıyla başlayın.
  7. PÖrnekleri buharlaştırma sistemine bağlayın ve 10 dakika sonra basıncı 350 mbar'a düşürün.
  8. İlerlemeyi izleyin ve tüp içindeki sıvı seviyesi ısıtma bloğunun seviyesine ulaştığında basıncı 300 mbar'a düşürün.
  9. Kalan sıvının yüksekliğini izlemeye devam edin ve yaklaşık 1 cm derinlikte basıncı 200 mbar'a düşürün.
  10. Numuneler kurutulduktan sonra örnekleri alın ve buharı temizlemek için pompayı 10 dakika daha çalıştırın.
  11. Tüpleri sıkıca kapatın ve lipidleri -80 ° C'de bir dondurucuda saklayın.
  12. Emilen sıvıyı yürürlükteki kimyasal güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak elden çıkarın.

4. GÜN 3. Sabunlaşma ve Metilasyon (~ 40 numune için 6-7 saat)

  1. Su banyolarını açın. 1 ila 95 ° C banyo ve 2 ila 80 ° C banyo yapın.
  2. Pipet dağıtıcılarını ayarlayın ve doğru miktarı dağıttıklarından emin olun.
    Reaktif 1: Numune başına 1 mL
    Reaktif 2: numune başına 2 mL
    Reaktif 3: Numune başına 1,25 mL
    Reaktif 4: Numune başına 3 mL
    NOT: Isıtma işlemi tüpte basınç oluşturacaktır. Çizilmiş, kırık veya yontulmuş tüpleri kullanmayın.
  3. Bir pipet dağıtıcı kullanarak kurutulmuş lipidlere 1.0 mL Reaktif 1 ekleyin. Sıkıca kavrayın, 5 saniye vorteksleyin ve rafa koyun.
  4. Numune tüpünün rafını 5 dakika boyunca 95 ° C su banyosuna yerleştirin. Tüplerin rafını banyodan çıkarın ve tüplerde yükselen baloncuklarla belirtilen sızdırmazlık açısından tüpleri kontrol edin. Sızdıran tüplerin kapaklarını sıkıştırın veya değiştirin ve çatlak veya yongaları tekrar kontrol edin. Su banyosundaki tüpleri 10 dakika daha ısıtmaya devam edin.
  5. Banyodan 1 numuneleri çıkarın ve banyoda 2 (80 ° C) yerleştirin ve kuluçka işlemine 15 dakika daha devam edin.
  6. Tüpleri çıkarın ve rafı soğutmak için musluk suyuna koyarak örnekleri soğutun.
  7. Her numuneye 2 mL Reaktif 2 ekleyin. Sıkıca kapayın ve 5 ila 10 saniye vorteksleyin.
  8. Rafı 80 ° C su banyosuna yerleştirin ve 10 dakika inkübe edin.
  9. Tüplerin rafını su banyosundan çıkarın ve soğutmak için musluk suyuna koyun. Soğutma işlemini hızlandırmak için tüpleri karıştırın.
    NOT: Zamanı ve sıcaklığı aşmayın. Çok fazla ısıtma FAME'leri bozabilir.
  10. Pipet dağıtıcı kullanarak, yağ asidi metil esterlerini çıkarmak için her numune tüpüne 1.25 mL Reaktif 3 ekleyin. Sıkıca tutun ve tüpleri çalkalayıcıya 10 dakika boyunca koyun.
  11. Çalkalandıktan sonra, fazların ayrılması için tüplerin rafının 10 dakika beklemesine izin verin. Cam pipet kullanarak organik fazı (üst tabakayı) 16 mm x 100 mm cam test tüpüne aktarın.
  12. Ekstraksiyon işlemini tekrar Reaktif 3 ilave ederek, çalkalayarak, fazların ayrılmasına izin vererek ve üst fazı aktararak tekrarlayın.
    NOT Alt fazın hiçbirini aktarmayın. Tüp içinde az miktarda üst faz bırakmak iyidir.
  13. Pipet dağıtıcısını kullanarak, 3 mL Reaktif 4'ü ekleyin.E 16 mm x 100 mm tüpler.
  14. Test tüplerini sıkıca kapatın ve 20-30 sn boyunca girdaplayın.
  15. Vorteks uyguladıktan sonra, 1,000 x g'de 3 dakika santrifüjleyin.
  16. Temiz bir cam pipet kullanarak üstteki organik fazı aspire edin ve 4 mL amber flakona aktarın.
  17. Buharlaştırma aparatını ve çözücü tuzağını açın. Buharlaşma cihazını 30 ° C'ye, girdap hızını% 26'ya, vakumu 200 mbar'a ayarlayın ve ön ısıtmaya basın.
  18. Gelişimi izleyin. Numuneler kurutulduktan sonra örnekleri alın ve buharı temizlemek için pompayı 10 dakika daha çalıştırın.
  19. Reaktif şişeleri 1 ve 4'ten pipet çıkarın ve seyreltik asitle ( örn. % 1 HC1) pompalayın, bunu DI su ile pompalayın. Reaktif 2'de kullanılan pipeti su ile pompalayarak durulayın. Başlıkta, Reaktif 3 için kullanılan pipetten çözücüyü uygun bir kaba boşaltın ve çözücü kalıntıları buharlaşıncaya kadar kaputun içinde tutun.
  20. Pipetleri ters çevrilmiş olarak saklayın, stickinler önlemek için pistonları çıkartınG çek valfler.
  21. Cam pipetleri bir kez kullanın ve uygun bir kaba koyun.
  22. Kaputun içinde, cam eşyalar üzerindeki solvent tortularının buharlaşmasına izin verin.
  23. Camı temiz su ve deterjan çözeltisi ile yıkayın.

5. GÜN 4 - Çalışma Solüsyonunun Hazırlanması ve Şöhretlerin GC Şişelerine Aktarımı (yaklaşık 40 numune için 2-3 saat)

  1. Malzemeler toplayın: 4 mL amber flakonları kuru numunelerle; Amber 2 mL GC şişeleri; 400 μL düz tabanlı cam ekler ve kapaklar; 500 mcL cam şırınga; 50 mL hacim şişesi; Stok çözeltisi - 50/50 heksan / MTBE'de (Reaktif 3) etil nonadekanoat (19: 0 EE dahili standart).
  2. Cam şırıngayı kullanarak, 50 mL hacimsel bir şişeye 500 uL etil nonadekanoat (19: 0 EE) stok solüsyonu ilave edin.
  3. Şişeyi Reaktif 3 ile hacimsel skora doldurun.
  4. Kap şişesi ve karıştırmak için 5x ters çevirin.
  5. Çalışan bir solüsyon deposu için 3 mL'lik temiz bir 4 mL'lik şişeye aktarın.
  6. Th kullanmaE cam şırınga ile kurutulmuş yağ asidi metil esterleri ve kapakları içeren 4 mL tüplerin her birine 300 μL çalışma çözeltisi ekleyin.
  7. Numuneyi 15 saniye vorteksleyin ve 15 dakika bekletin.
  8. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, süspansiyon haline getirilmiş yağ asidi metil esterlerini, 400 μL ek içeren 2 mL'lik bir GC şişesine dikkatle aktarın.
  9. Analiz öncesinde kapalı GC şişeleri -20 ° C dondurucuda saklayın.
  10. GC analizi için örnekler gönderin.
    NOT: Analiz spesifik bir GC sütunu ve İlave Dosya S1'de tanımlanan koşullar kullanılarak gerçekleştirilmelidir. GC analizinin metilasyondan sonraki 2 hafta içinde tamamlanması en iyisidir.

Sonuçlar

Raporlardaki veri tabloları bir elektronik tabloya veya veritabanına harmanlanabilir. Yanıt faktörü (farklı zincir uzunlukları için cevabı normalleştiren bir düzeltme faktörü) ayarladıktan sonra, pik alanlar ekstre konsantrasyonuna ulaşmak için dış veya iç standartların pik alanı ile karşılaştırılabilir. Ayıklanan toprak kütlesi ile bölünerek veriler, toprak gramı başına FAME kütlesi olarak veya her bir FAME molekül ağırlığı kullanılarak toprak gramı başına daha sık bildirilen nmol olarak ifade edilebilir. Mikrobiyal FAME'lerin toplamı toplam mikrobik biyokütleyi gösterir ve tedaviler arasında kıyaslanabilir ( Şekil 1 ). Bazı AYAKLAR ayrıca Gram-pozitif veya Gram-negatif bakteriler, aktinomisetler, arbusküler mikorizal mantarlar ve saprotrofik mantarlar 19 , 20 , 20 gibi belirli mikrobik gruplarla ilişkili olabilir. 21 , 22 , 23 , 24 . Belirli biyolojik belirteçlerin kütlesinin oranları, bu grupların görece bolluğunu yansıtabilir ( Şekil 2 ). Genel FAME bolluk kalıpları, koordinasyon gibi çok değişkenli teknikler yoluyla mikrobiyal topluluk farklılığının karşılaştırılmasına olanak tanıyan topluluk düzeyinde parmak izleri oluşturur ( Şekil 3 ). DNA tabanlı yaklaşımların çoğunun aksine, toplum düzeyindeki lipid verileri ya göreceli veya mutlak bolluk olarak analiz edilebilir. Toplam biyokütle numuneler arasında büyük farklılıklar gösteriyorsa, bu iki yaklaşım çok farklı sonuçlar verecektir; Deneyin altında yatan ekolojik sorular hangi yaklaşımı kullandığını belirlemelidir.

figure-results-1930
F Şekil 1 : Toplam Fame biyo kütlesi . Sürekli mısır, gübrelenmiş çayır ve unfertilize çayırdan toplam FAME biyomarker biyokütlesinin (nmol g -1 toprak) karşılaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-2498
Şekil 2 : Bakteri ve mantarların FAME biyokütlesi. Sürekli mısır, döllenmiş çayır ve unfertilize prairie. Bakteriyel ve fungal FAME biyomarker biyokütle (nmol g -1 toprak) Muamele karşılaştırma Mutlak bolluktan Fungal ve bakteri kütlesi. Ortalama (toplam f / toplam b). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figure-results-3134
Şekil 3 : FAME lipid biyobelirteçlerinin metrik dışı Boyutsal Ölçeklemesi. Tüm mikrobik FAME lipid biyobelirteçlerinin mutlak bolluk profillerini kullanarak toplam mikrobiyal toplumun karşılaştırılması. Bu örnekte, sürekli mısır ve feragat edilmemiş çayır toplulukları ayrılmış ve çok uzakta iken bazı döllenmiş çayır örnekleri mısırdan gelen mikrobik topluluklara sahipken, diğerleri de fermente edilmemiş çayırlara benzemektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-3928
Tablo 1: T h e so sol ven t türü, s ile oransal ti g-1 toprak, o f n O Iti eklemek bir d t h EIR orde r ilave edildi. Bu, organik ve sulu fazların doğru ekstraksiyonu ve ayrılması için önemlidir.

Tartışmalar

Birçok çoğaltan ve / veya deney birimi bulunan deneylerden alınan çoklu numunelerin incelenmesi için, araştırmacılar fosfolipid yağ asidi analizi (PLFA) zaman ve materyal bakımından yasaklayıcı bulabilir 25 . PLFA yöntemi ile, hücre zarı fosfolipidleri modifiye Bligh and Dyer 26 iki fazlı sulu organik ekstraksiyon kullanılarak özütlenir, saflaştırılır ve tanımlanır. Bunu, polariteyle lipidleri ayırmak için katı-fazlı silika kromatografisi ve yağ asit metil esterlerine fosfolipid yağlı asitlerin alkalin metilasyonu izler. PLFA profillemesinde lipid verimi düşük olabilir, ancak çok yüksek saflıkta olabilir. Mikrobiyal ID, yağ asidi metil ester prosedürü (MIDI-FA) alternatif bir yöntem getirdi. MIDI-FA yönteminde, tüm lipidler doğrudan saf kültürlerden veya topraktaki / sediman örneklerinden 11 , 12 , 27'densabunlaşma. Bu yöntem düşük lipid kaybına sahiptir ve hızlıdır, çünkü PLFA yönteminin konsantrasyon veya saflaştırma adımlarından hiçbirine sahip değildir. Bununla birlikte, saf kültürde organizmaları tanımlamak için orijinal olarak tasarlandığından, MIDI-FA yöntemi hızlı ve daha ucuz olmasına rağmen, başlangıç ​​ekstraksiyonu veya saflaştırma adımları yoktur. Bu nedenle, toprağın organik maddesinden birlikte ekstrakte edilen lipit benzeri bileşikler topluluk imgesini bozan 27 , 28 , 29'u içerebilir. Bu kapsama biyokütle ölçümlerini de bozabilir, çünkü MIDI-FA sadece tipik olarak toprak lipidlerini kabaca niteliksel olarak tanımlamak için kullanılmıştır 13 .

Burada açıkladığımız prosedür, iki ayrı ekstraksiyon prosedürünün en iyisini birleştirir: 1) Modifiye Bligh ve Dyer 26 metodunu kullanarak lipidlerin ekstraksiyonu ve konsantrasyonu ve 2) yağ asidi metil esteri saPonifikasyon, metilasyon, ekstraksiyon ve baz yıkama prosedürü. Bu yöntem, dezavantajları en aza indirirken bu protokollerin her ikisinin de faydalarını elde etmek için geliştirilmiştir 15 . İlk ekstraksiyonu gerçekleştirerek ve MIDI-FA yapılmadan önce organik olarak çözünen bileşenleri ( örneğin lipidleri) izole ederek ve bunu bir saflaştırma adımıyla tamamlayarak, bu protokol hız ve hassaslık arasında bir denge sağlıyor. Bu yöntem yüksek saflığın gerekli olduğu durumlarda ( örn. , 13 C PLFA analizi için) veya fosfolipidleri ve nötr lipidleri ayrı ayrı analiz ederken uygun olmayabilir, ancak çoğu durumda DNA temelli olgulara kıyasla çevresel koşullara mikrobiyal topluluk yanıtlarının saptanmasına olanak tanır Yöntemler 30 , 31 , 32 , 33 . Membran lipidleri hücre ölümünden sonra hızla parçalanarakÖlü veya inaktif organizmalardan gelen bilginin çoğunun bulunduğu çevresel DNA'nın aksine, 5 , 7 numuneleri alınırken yaşayan mikrobik topluluğu yansıtın 34 . Toprak mikroorganizmaları 35 arasında gözlemlenen uyuşukluk yüksek oranda göz önüne alındığında, canlı biyokütle karakterizasyonu, nispeten ince bir zamansal ölçekte zamansal Bitki Mikrop Etkileşimleri anlamak için kullanılabilir ve lipid biyolojik mikrobiyal eden 7 fizyolojik durumunu tahlil etmek için kullanılabilir. Büyük alan ayarları 25'te mikrobik cevabı değerlendirmek için yüksek verimli yöntemlerin gerekli olduğu ve burada önerdiğimiz yöntem PLFA biyolojik işaret profillemesinin doğruluğunu tekrarlamasa da, verimliliği artırırken, MIDI-FA ile gerçekleştirilen değişkenliği asgariye indirdiği gösterilmiştir prosedür. Yöntemin, adreslemede etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 büyük ölçekli tarımsal ve ekosistem çalışmalarında çok çeşitli topraklarda mikrobiyal toplum dinamikleri ile ilgili sorular.

Lipid sınıfları bu yöntem ile birleştirilir ve bu ayrı sınıf 22 , 39'da yer alan bilgilerin bir kaybı olabilir, ancak lipit sınıflarının birleştirilmesi, her iki fosfordan 16: 1 ω5c arbusküler mykorizal mantar kökeni tespit etme gücünü güçlendirebilir - ve nötr lipidler 40 . Buna ek olarak, tBilinmeyen yağ asitleri sayısının (canlı olmayan organik maddelerden türetilebileceği) bu yöntemle daha yüksek olabileceği, bunun MIDI-FA'dan daha düşük olduğu gösterildi ve örneklerin çoğunda örneklerin lipid profillerinin karşılaştırılmasına izin verildi Üretim kapasitesi bir endişe 15 . Nötr fraksiyonun mantar tarafından üretilen depolama lipidlerinden türetildiği düşünülürse de, toprak faunasından biraz daha az katkıda bulunulabilir 41 . Bunun ışığında, burada açıklanan yöntem, PLFA'ya göre fungal lipidlerin 18: 2 ω 6,9c ve 18: 1 ω 9c'ün daha büyük bir katkısını gösteren sonuçlar verebilir. Nötr fraksiyonda ortaya çıkma eğiliminde olan diğer lipidler, doymuş yağ asitlerinin bazılarını, örneğin 16: 0, 18: 0, 20: 0'u içerir.

Lipid verisinin ifade edilip analiz edilebileceği farklı yollar vardır. En yaygın gösterimler bolluk (nmol g -1 toprak), molekül fraksiyonuN (nmol bireysel lipid nmol- 1 toplam lipid) ve mol yüzdesi (mol fraksiyonu * 100). Bir örnekteki toplam lipidlerle normalize edilen mol fraksiyonu ve mol yüzdesi belirli bir lipitin göreceli bolluğunun ölçüsüdür. Uygun bir dönüşümün ardından, örneğin arsine kare kökü, mol fraksiyonu, ana bileşenler veya fazlalık analizi düzenlenmesiyle analizde kullanım için uygundur. Bolluk, toprak gramı başına verilen belirli bir lipitin mutlak miktarıdır. Hücre başına lipit miktarı makul derecede sabit olduğu ve lipit ekstraksiyonunun son derece verimli ve kapsamlı olduğu için toplam bolluk toplam lipidlerin iyi bir tahmini ve anahtar göstergelerin bolluğu, temsil ettiği ekolojik grubun biyokütlesini yansıtır 17 . Son olarak, mikrobiyal topluluk kompozisyonuna bakmanın iyi bir yolu çok değişkenli analiz yöntemlerini kullanmaktır 16 , örneğin , nonmetrik çok boyutlu ölçekleme (NMDS -Veri dönüşümüne ihtiyaç duymayan) veya ana bileşen analizleri (PCA), tüm lipid biyolojik belirteçlerinin göreceli bolluğunu karşılaştırmak için yararlı olabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen DOE Büyük Göller Biyoenerji Araştırma Merkezi (DOE BER Bilim Ofisi DE-FC02-07ER64494) ve DOE OBP Enerji Verimliliği ve Yenilenebilir Enerji Ofisi (DE-AC05-76RL01830) tarafından finanse edildi. Yazarlar Anders Gurda'ya videografi ve düzenleme konusundaki sabırlı ve ustalıklı katkılarından ötürü teşekkür etmek istiyorlar.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RapidVapLabconco7900000Evaporative system
RapidVapLabconco7491400Sample block
Chem-resistant vacuum pumpLabconco7584000Vacuum pump
Chemical trap cannisterLabconco7815300Trap cannister
Solvent insertLabconco7515200Solvent trap insert
Diaphragm pumpWelch7398000DryFast vacuum pump
Water bathFisher15-462-15Q2 well water bath
Gas chromatographVariousN/AFor sample analysis
CentrifugeVariousN/AFor sample separation
Freeze DryerVariousN/AFor sample lyophilization
Repipet (6)BrandTech4720440For dispensing reagents
VortexFisher02-215-365Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubesThermo/Nalgene3114-0030Teflon sample tubes
CapsThermo/NalgeneDS3131-0020Caps for teflon tubes
Test tubeCorning9825-1616x100mm tubes
Test tubeCorning9825-16xx16x150mm tubes
CapsCorning9998-1515-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipetsFisher13-678-20B14.6cm
500 uL glass syringeFisher13684106LCHamilton 81217
Amber vialsAgilent5182-07164mL Amber vials
CapsAgilent5182-0717Blue screw caps
InsertsAgilent5181-3377400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate)VWRTCN0459-5GAnalytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better)VariousN/AFor making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better)VariousN/AFor making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better)VariousN/AFor making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better)VariousN/AFor making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL)VariousN/AFor making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better)VariousN/AFor making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better)VariousN/AFor making Reagent 3

Referanslar

  1. Van Der Heijden, M. G. a., Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).
  2. Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25 (8), 468-478 (2010).
  3. Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36 (2), 137-144 (2013).
  4. Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
  5. Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66 (1), 145-157 (2013).
  6. van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363 (1-2), 1-5 (2013).
  7. Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69 (5), 1412-1421 (2005).
  8. Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81 (1-4), 509-520 (2002).
  9. Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22 (3), 261-264 (1996).
  10. Frostegård, &. #. 1. 9. 7. ;., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43 (8), 1621-1625 (2011).
  11. Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60 (7), 2483-2493 (1994).
  12. Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
  13. Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
  14. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf (2004)
  15. Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. , (2017).
  16. Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55 (11), 2888-2893 (1989).
  17. Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118 (6), 1251-1263 (2015).
  18. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24 (4), 317-323 (1992).
  19. Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3605-3617 (1993).
  20. Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24 (3), 365-374 (1986).
  21. Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39 (8), 535-541 (1989).
  22. Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. , 299-488 (1988).
  23. Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37 (3), 601-604 (2005).
  24. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  25. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
  26. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
  27. Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
  28. Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
  29. Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
  30. Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
  31. Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43 (10), 2184-2193 (2011).
  32. Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49 (2), 191-205 (2004).
  33. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53 (9), 1689-1699 (2013).
  34. Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9 (2), 119-130 (2011).
  35. Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
  36. Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
  37. Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
  38. Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45 (4), 373-383 (2003).
  39. Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807 (2012).
  40. Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
  41. Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
  42. Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2 (2), 131-137 (2011).
  43. Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9 (12), 1-14 (2014).
  44. Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87 (3), 570-579 (2006).
  45. Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39 (2), 517-525 (2007).
  46. Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284 (1-2), 85-100 (2006).
  47. Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40 (10), 2699-2702 (2008).
  48. Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7 (1), 27-49 (2005).
  49. Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 125Fosfolipid Ya Asidi PLFAYa Asidi Metil Ester FAMEMIDI FAlipid biyomarkerimikrobiyal toplumbakterimantarkoordinasyontoprak mikrobiyolojisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır