Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Özet

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Hücre membran yeniden şekillendirilmesi endositoz, kaçakçılık, filopodia, vboluşumu gibi birçok hücresel olayların ayrılmaz bir parçasıdır. Birçok farklı protein hissediyorum veya membran eğriliği ikna yeteneği nedeniyle eğri membranlar ile ilişkilendirin. Genellikle, bu onları hücreye kantitatif çalışmaya çok karmaşık hale proteinler çok sayıda ayrışmasını gerektirir. Biz bir eğri membran vitro, yeniden oluşturmak için bir protokol endositik boyun gibi kavisli bir hücresel yapısı taklit tanımlamak. Bir dev unilamellar vezikül (Şef) olan iç basınç ve yüzey gerilimi micropipette aspirasyon ile kontrol edilir bir hücre zarı modeli olarak kullanılır. Optik cımbız kullanarak Şef bir nokta çekerek güç uygulayarak Nanotüpün düz bir membran bağlı yüksek kavisi oluşturur. Bu yöntem, lipid membranlar, sertlik bükme gibi temel mekanik özelliği ölçmenin geleneksel olarak kullanılmıştır. Son yıllarda, proteinler membran eğriliği ve onlar şekli ve membranları mekanik etkiler yolu ile nasıl etkileşim kurduğu eğitim için genişletilmiştir. Embriyolardan, mikroenjeksiyon, optik cımbız ve confocal mikroskobu birleştiren bir sistem aynı anda ölçüm membran eğriliği, membran gerginlik ve proteinler, yüzey yoğunluğu sağlar. Bu ölçümler protein-membran sisteminin birçok önemli mekanik ve morfolojik özelliklerini anlaşılmaktadır olabilir. Buna ek olarak, biz fizyolojik tuz konsantrasyonu ve proteinler membran üzerinden Floresans yoğunluklarda etiketli proteinler ve yağlar üzerinde yüzey yoğunluğu miktarının bir yöntem GUVs oluşturma iletişim kuralı düzenleyin.

Giriş

Kaçakçılığı, endositoz, filopodia, enfeksiyon, vb, oluşumu gibi birçok hücresel süreçler hücre zarları^1,2şeklinde dramatik bir değişim eşlik eder. Hücre içinde bir dizi proteinler membran için bağlama ve onların şekil değiştirerek bu işlemlerde katılmak. Özünde etki alanı^3,4,5,6,7BAR kavisli bir özellik içeren depo gözü/Amphiphysin/Rvs (BAR) protein ailesi üyeleri en önemli örneklerdir. Tipik olarak, onlar BAR etki alanı yüzeye ve birçok durumda, aynı zamanda derin bilayer amfipatik sarmal ekleme kalarak tarafından membran ile etkileşim. Şekli, boyutu ve şarj amfipatik sarmal sayısı ile birlikte BAR etki alanının belirler: (1) membran eğriliği yönünü (Yani, invaginations ya da çıkıntılar neden) ve (2) membran büyüklüğü eğrilik^5,8. Belirtmek gerekirse burada dışbükey tarafı eğri membran, Yani, çıkıntı etkileşen parçacık doğru ve negatif olarak aksi takdirde olumlu eğriliği tanımlanır. Ayrıca, membran üzerindeki etkileri fiziksel parametreleri bir dizi bağlıdır protein BAR nicel çalışmalar ortaya: yüzey proteinleri, membran gerginlik ve membran şekli (düz karşı borulu karşı küresel yoğunluğu şekil)⁷. Bu parametreler protein BAR bağlı olabilir: (1) hareket sensörleri membran kavisi, (2) membranlar viraj veya (3) neden membran scission⁷.

Bileşenleri membran hücre, endositoz gibi olayları niceliksel yönlerini eğitim yeniden şekillendirilmesi olarak yer sayısının çokluğu nedeniyle vivo içinde son derece zordur. Vitro sulandırma eğri membranlar hücrenin taklit eden en az bileşenlerinin nasıl membran eğri proteinlerin faaliyet mekanik bir anlayış kazanmak için sağlar. Bu makalede membran nanotüp vitro Embriyolardan, confocal mikroskobu ve optik cımbız kullanarak yeniden oluşturmak için bir iletişim kuralı. Yaklaşım, proteinler, lipidler veya küçük moleküller eğri membranlar ile etkileşimini nicel bir şekilde çalışmak için kullanılabilir. Lipid GUVs olan eğrilik etkileşen moleküllerin membran eğri boyuta göre önemsiz bir hücre membran modelleri olarak kullanılır. Onlar hangi veziküller lipid film nemlendirici ve GUVs bir alternatif akım (AC)¹⁰altında şişlik tarafından kurulan electroformation yöntemi⁹ kullanılarak hazırlanır. En yaygın yüzeyler üzerinde GUVs yetiştirilen indiyum kalay oksit (ITO) ile kaplı ya da yarı iletken tabaklara veya Platin (Pt-telleri)¹¹teller. Bu yöntem tuzları arabellek¹²huzurunda GUVs yapımında alternatif daha iyi çalışması için gösterildiği gibi Bu eser, GUVs Pt-telleri üzerinde yetiştirilmektedir. Electroformation Protokolü burada onu çoğaltmak yeterince ayrıntılı bir biçimde anlatılan rağmen biz okuyucu içinde ayrıntı^13,14' GUVs yapma ve diğer benzer yöntemleri tarif edilmiştir önceki makalelerine bakın. Bizim ellerde electroformation Pt-telleri üzerinde başarıyla GUVs sentetik yağlar karışımı veya doğal lipid ~ 100 mM NaCl içeren bir arabellek özler vermiştir. Ayrıca, büyüme sırasında proteinler GUVs içinde kapsüllemek mümkündü. Bir örnek electroformation odası şekil 1A' gösterilir; iki ~ 10 cm uzunluğunda Pt-tel her iki cam coverslips ile mühürlenmiş politetrafloroetilin (PTFE) yapılmış bir tutucu eklenen oluşur ~ 1-2 cm arayla (şekil 1A).

Şekil 1: deneysel Kur. (A) Şef electroformation odası ile elektrik konektörleri Pt-telleri için bağlı. (B) sol: mikroskop gösterilen deneysel sistem objektif ve iki MİKROPİPETLER (sol ve sağ) yukarıda deneysel odası için micromanipulators bağlı ve tüp çekerek ve protein için deneysel odasına eklenmiş enjeksiyon. Sağ: deneysel odası yakından görmek aspirasyon ve eklenen enjeksiyon MİKROPİPETLER gösterilen amaç monte. (C) A tenkıye arka tarafında bir micropipette takılan ince bir dağıtıcı ile donatılmıştır. Alt micropipette özetleyen mavi noktalı çizgi ile micropipette içinde dağıtıcı yakın çekim görülmektedir. Bu sistem micropipette kazein cam yüzey passivate ve mineral gerektiğinde yağ ile doldurun yedeklenmeyeceğini doldurmak için kullanılır. (D) A sistem protein çözüm miktarlarda µL Aspire eskiden. İğne bir şırınga ve iğne micropipette bağlı boru bağlıdır. Micropipette ipucu dikkatle protein çözüm içine dalmış ve çok micropipette ipucu doldurmak için Aspire. Micropipette sonra geri mineral panel C. gösterilen sistem kullanarak yağ ile dolu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

RADIUS 7 arasında değişen membran Nanotüpün nm için birkaç yüz nm, bir şef bir dış kuvvet tarafından çıkardı. Bu yöntem ilk hücre zarlarında ve veziküller, bükme sertlik^15,16gibi elastik özelliklerini ölçmek için tasarlanmıştır. En son eserlerinde yöntemi proteinler çekti nanotüp^7,17yakınındaki microinjecting tarafından proteinler arasındaki etkileşimin eğri membranlar ile çalışmaya uzatıldı. Diğer yöntemlerle proteinler membran eğri eğitimi için geliştirilmiştir. Bir yöntem, proteinler farklı ölçekli lipozomlar passivated yüzeye hayvan zinciri ile inkübe. Confocal mikroskobu protein bağlayıcı eğriliği kaynaklı sıralama^18,19belirtebilirsiniz lipozom çapı bir fonksiyonu olarak ölçmek için kullanılır. Başka bir yöntem, protein kendiliğinden tübüllerin^20,21ikna etmek için yeteneklerini ölçmek için bir mikro-Aspire Şef enjekte edilir. Bu protokol için açıklanan yöntemi nerede çoğu proteinler genellikle ön şekillendirilmesi membran nanotüpler kargo içeren membran invagination ile bağlanma karşılaşma membran eğri proteinler endositoz içinde yer alan eğitim için benzersiz olarak uygundur temel düz plazma zarı. Ayrıca, Bu yöntemde farklı olarak tahlil ile gergin küçük lipozomlar, membran nanotüp sürekli membran için bağlı; Bu nedenle, Şef, beklenen durum içinde vivoile mekanik denge bulunmaktadır. Bu nedenle, temel membran fizik uygular ve mekanik özellikleri bir bolluk bizim ölçümleri^22,23,24algılayın.

Bu yöntem tam uygulanması için gerekli ekipman confocal mikroskop, optik cımbız ve su deposu (şekil 1B) bağlı bir veya iki MİKROPİPETLER içerir. Üçü bir araya getirerek, aynı anda ölçmek membran gerginlik, membran eğriliği, proteinlerin yüzey yoğunluğu ve kuvvet²⁵tüp mümkündür. Micropipette aspirasyon esastır ve kolayca içine aspirasyon basınç²⁶hidrostatik basınç kontrol eden bir su deposu için bağlı bir tutucu bir cam micropipette ekleyerek oluşturulur. Micropipette ve tutucu bir micromanipulator tarafından ve ideal olarak, bir yönde bir piezo-aktüatör hassas hareket için tarafından kontrol edilir. Nanotüpün çekeceğim, Şef microaspirated kısa bir süre uzakta Nanotüpün oluşturma sonra çekti bir mikron büyüklüğünde boncuk için sıkıştı. Bu uygulama, boncuk bir yayımlanmış protokolü²⁷takip ederek inşa optik cımbız tarafından düzenlenmektedir. Bu doğru kuvvet ölçümleri rağmen pahasına optik cımbız ve çekme nanotüpler farklı şekillerde dağıtmak mümkündür. Bir optik tuzak kurmak çok zor olması veya kuvvet ölçümleri bir sadece proteinler tercih için eğri membranlar, kontrol istiyorsa gerekli değil, gibi bir tüp ikinci bir micropipette²⁸ucunda Aspire bir boncuk kullanarak çekilebilir. Yerçekimi kuvveti²⁹ kullanarak tüpler çekme veya^30,31akışı mümkündür. Ayrıca, confocal mikroskobu da önemli değil; Ancak, bu yüzden proteinler yüzey yoğunluğunu ölçmek için tercih edilir. Ayrıca nanotüp RADIUS floresan yoğunluğu lipidler tüp, böylece bağımsız olarak membran kuvvet ve gerginlik üzerinden ölçüm sağlar. Bu miktarları arasındaki ilişkiyi proteinler membran yapıştırılır²⁵varlığı nedeniyle köklü denklemleri sapma üzerinden Floresan Tüp RADIUS çıkarım özellikle önemlidir. Tüp eğriliği ölçmek mümkün olmayacak gibi önemlisi, bir optik tuzak ve confocal mikroskobu dağıtmak değil.

Bu protokol için açıklanan yöntemi eğrilik kaynaklı çeşitli periferik membran proteinlerinin nanotüpler, çoğunlukla bu BAR aile^{25,32,33,34 üzerinde sıralanması eğitim için kullanılan} . Bu aynı zamanda KvAP üzerinde zenginleştirilmiş conically şekilli transmembran potasyum kanal proteinler³⁵gibi BAR aynı şekilde nanotüpler kavisli gösterilmiştir. Proteinler GUVs içinde kapsüllemek için yöntemini optimize ederek, proteinler arasındaki etkileşimin negatif eğriliği ile son zamanlarda iyi³⁶araştırmış. Ayrıca, bu yöntem protein iskele^25,37 oluşumu aydınlatmak için ve her iki satır gerginlik³⁸, protein dynamin³⁹, veya BAR membran scission mekanizması çalışmaya kullanılmıştır proteinler^40,41. Ek olarak proteinler, küçük moleküllerin veya iyonların eğriliği de tetikleyebilir. Bu yöntemi kullanarak, kalsiyum iyonları pozitif eğriliği tuzsuz koşulları⁴²altında ikna etmek için gösterilmiştir. İlginçtir, aynı zamanda lipidler bir demixing noktası^43,44olan sadece besteleri rağmen için sıralama, eğrilik geçirmek için gösterilmiştir. Toplum olarak, yöntem araştırmacılar nasıl ya integral membran bileşenler (örneğin, lipitler veya transmembran proteinler) soruşturma baktılar tarafından kullanılabilir veya periferik molekülleri bağlama (ya içinde veya dışında GUVs) ile etkileşim cylindrically eğri membranlar, mekanik ve nicel Puan bakış. Ayrıca^22,23,45membran kendisi mekanik özelliklerini ölçme ilgilenenler için amaçlanmıştır.

Protokol

1. GUVs Electroformation Pt-telleri üzerinde tarafından hazırlanması

1. Electroformation odası temiz (bkz: giriş ve şekil 1A) ve Pt-tuz silsin için telleri ile etanol veya lipidler silsin için aseton gibi organik bir çözücü ve su ile.
   Not: Biz iyice uzağa kalıntı etanol bulanmış doku ile silinerek sonra aseton, etanol, o zaman su, her biri için 5 dk sonicating öneririz.
2. 1 mg/mL kloroform bir istenen lipid bileşimi lipid karışımı hazırlar. Mix içermelidir ~ % 0.05 molar bir lipid kısmını Birleşik biotin ile (örneğin, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) ve ~ % 0.5 molar bir lipid kısmını Birleşik bir fluorophore () ile örneğin, BODIPY-TR-C5-ceramide).
   Not: deneyim, daha--dan %30 içeren bir yüksek verim GUVs üretmek zor lipidler ücret.
   Dikkat: Kloroform uygun eldiven giymiş bir kimyasal başlık içinde ele alınmalıdır.
3. Pt-telleri bir çift electroformation odanın içine yerleştirin. Damla tarafından ayrılmış lipid mix Pt-telleri üzerine havale ~ 2-3 mm (Toplam ~ 4 µL Mix).
4. Teller, oda sıcaklığında 30-60 dk için vakum altında kuru.
5. Alt odasının coverslip silikon gres kullanarak odası üzerinde kalarak tarafından mühür. Odası NaCl, sukroz ve bir arabelleğe alma Aracısı (örneğin, 70 mM NaCl, 100 mM sukroz ve 10 mM Tris, pH 7,4) içeren tamponlu bir çözüm ile doldurun. Bu orta GUVs deneyinde içinde olacak. Bu orta Osmolarite içinde deneysel orta Osmolarite maç esastır ~ % 10. Sükroz Osmolarite ayarlamak için kullanın. Eğer amaç onları GUVs içinde kapsüllemek için belgili tanımlık eriyik vasıl istenen bir konsantrasyon proteinler ekleyin.
   Dikkat: Çeşitli tuzlar ve şeker arabellek bükme sertlik ve membranlar^24,42,46,47spontan eğriliği etkileyebilir.
6. Odasının üst silikon gres odası içindeki en düşük hava sağlanması ile bir coverslip kalarak tarafından mühür. Pt-telleri 500 Hz ve 280 aracılığıyla bir sinüs AC akım uygulamak mV.
   Not: Büyüme zaman ve sıcaklık lipid kompozisyon ve protein duyarlılığını bağlı olarak optimize edilmiş olması gerekir. Doğal lipid özleri, kullanırken ve aynı zamanda GUVs proteinleri Kapsüllenen zaman, en iyi verim GUVs 4 ° C'de geceleme büyüyen elde edildi. Proteinlerin ve sentetik lipit kompozisyonları, büyüme için oda sıcaklığında için yokluğunda ~ 2s yeterli.

2. deneysel odası ve MİKROPİPETLER hazırlanması

1. MİKROPİPETLER hazırlamak için bir cam kılcal bir pipet çektirmenin kullanarak çekin. Bu bir cam kılcal sırasıyla, 0.7 mm ve 1 mm, iç ve dış yarıçapı ile kullanmak için önerilmektedir. Böylece onun iç çapı 5-sonra micropipette ucu rafine bir microforge kullanarak 7 µm. Proteinler veya diğer molekülleri denemede enjekte, başka bir micropipette çekin ve ucu iç çapı 8-15 µm için rafine.
2. Şekil 1' de gösterildiği gibi iki dikdörtgen mikroskopi coverslips metalik bir temel üzerine yerleştirerek bir deneysel odası inşa. Coverslips tarafından ayrılmalıdır ~ 1 mm. Odası açıklıklar (bkz. şekil 1) uzun kenarları boyunca olmalıdır. Açık tarafı micropipette ucu nereye belgili tanımlık uç en az odanın ortasına ulaşmak gerekir büyüklükte olmalı.
3. Kimin Osmolarite fazla % 10 oranında GUVs büyümek için kullanılan arabellek üzerinden farklı değil deneysel arabellek hazırlayın. OSMOLARİTE glikoz ile ayarlayın. 100 ile Tris pH 7.4 arabelleğe mM NaCl, 40 mM glikoz, endophilin etkileşim nanotüpler eğitim içinde kullanılan deneysel bir arabellek bir örnektir. Sükroz içinde bir arada / glikoz dışında sağlar: (a) yeterli faz kontrast parlak alan mikroskobu ve onları odası dibinde yerleşmek neden olur (b) daha yüksek yoğunluk GUVs içinde GUVs gözlemlemek için. Tuz konsantrasyonu deneysel şartlarına göre ayarlayın.
   Not: bizim deneyim, membran'ın mekanik özellikleri etkileyen yanı sıra yüksek glikoz konsantrasyonu (> 300 mM) olumsuz streptavidin-biotin tahvil, Nanotüpün çekmek için gerekli etkiler. Ayrıca, çok az tuz streptavidin-biotin Tahvil engeller, iken, çok yüksek bir konsantrasyon protein-membran etkileşimleri ekranlar. Protein kapsülleme, çok yüksek tuz konsantrasyonu dış arabellekte kullanarak durumunda (örneğin, > 200 mM NaCl) bir numara dış broşür³⁶protein ayırmak için kullanılabilir. Tuz konsantrasyonu faiz molekülünün en iyi bağlama koşullarını bulmak için bir dizi deney gereklidir.
4. 30-60 dk GUVs deneme için toplama önce cam yüzeyler (deneysel arabellekte çözünmüşörneğin,) bir son derece saf β-kazein, 5 mg/mL solüsyon ile deneysel odası ve aspirasyon micropipette doldurarak passivate. Β-kazein onları patlamaya neden olacak bir koruyucu tabaka GUVs güçlü, uygun önleme cam yüzeylerde oluşturur. β-kazein 30-60 dk ile kuluçkaya.
   Not: Hiçbir kabarcıklar membran gerilim kontrol ile müdahale micropipette içinde olmalıdır.
   1. Bir dağıtıcı MİKROPİPETLER doldurmak için oluşturmak için bir şırınga iğnesi plastik konnektör yakın kırmak ve içine ince silis kılcal (örneğin, sıvı Kromatografi için) tutkal (şekil 1 c).
5. Kuluçka β-kazein ile sırasında mikroskobunun odası dağ ve o hedefi merkez. Uzun kenarı boyunca delikten aspirasyon micropipette ucunu takın ve belgili tanımlık uç üstünde mikroskop objektif getirmek. Aspirasyon basınç (herhangi bir ağır akışı içinde ya da mikroskop altında görülebilir pipet dışında olmalıdır) sıfıra yakın olması için su tankı düzeyini ayarlayın.
6. Proteinler veya diğer molekülleri deneme sırasında enjekte diye, enjeksiyon micropipette istenen molekül ile çözünmüş seçim, bir konsantrasyon, deneysel arabellekte dolgu mount bir micromanipulator içinde micropipette ve deneysel odası karşı tarafında ekleyin.
   1. Proteinlerin en az miktarda kullanmak için sadece micropipette ipucu aspirasyon tarafından protein ile doldurun. Bunu yapmak için bir şırınga plastik boru ile bağlı bir iğne sonuna şal. Tüp enjeksiyon micropipette arkasına takın.
   2. Çok dikkatli bir şekilde micropipette ucu protein çözüm içine sokmak ve bu micropipette ucu doldurmak için Aspire edin.
      Not: Bu basit kurulum gösterilir şekil 1 d ve, bizim deneyim, protein çözüm kadar az birkaç µL alıyorum sağlar.
   3. Protein çözüm ve ( şekil 1 ciçinde Kurulumu kullanarak) su deposu su karıştırma önlemek için enjeksiyon micropipette mineral yağ ile kalan tamamlanmıyor.
   4. Hava kabarcıkları enjeksiyon pipet tanıtmak değil kararsız enjeksiyon basıncı neden gibi ilgilen. Protein miktarı yeterli ise, alternatif olarak, micropipette proteinler ile doldurma β-kazein ile aynı şekilde 2.4. adımda anlatıldığı gibi doldurun. Enjeksiyon pipet aspirasyon basıncı en aza indirmek için su tankı düzeyini ayarlayın.
      Not: Enjekte molekül veya iyon nanotüp yakınındaki konsantrasyonu nedeniyle seyreltme daha düşük olacak ve pipet çıkış⁴²mesafeden bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğu azalma ölçerek tahmin edilebilir. (Bkz: Bölüm 4) tam olarak ölçülebilir enjekte molekül bilayer-bağlı yoğunluğu bilmek ancak daha önemlidir.
7. Kuluçka β-kazein ile sonra çözüm odasından kaldırın ve deneysel arabellek ile birkaç defa durulayın. Deneysel arabellek ile doldurun.
8. GUVs electroformation durdurmak ve onları doğrudan Pt-teller toplamak. Şef çözüm birkaç µL deneysel odasına ekleyin. Taze GUVs hazırlanan kullanabilmeniz gerekir.
9. Birkaç µL streptavidin kaplı boncuk boncuk 0.1 x 10^−3% (w/v) veya daha az etrafında odasında son bir konsantrasyon deneysel odasına ekleyin. Polistren boncuk ~ 3 µm çapında önerilir (su geçirmezlik boncuklar var optik tuzak saçılma yürürlükte göre degrade gücü en üst düzeye çıkarma konusunda yakınındaki optimum Kırılma indisi kontrast). Boncuk toplama dayalı deneme olarak ayarlanabilir: çok düşük konsantrasyon odasında bulmaya zorlaştırır ve çok yüksek bir konsantrasyon birden fazla boncuk optik cımbız düşme riski çalışır.

3. çekerek membran Nanotüpün bir şef

1. GUVs izin ve boncuk odası altına yerleşmek. Biraz izin vererek GUVs havasını boşaltmak deneysel arabellek buharlaşır, için yaklaşık ~ 15 dk. GUVs dönmeye micropipette ile Aspire biraz fazla alan üretmek için esastır. GUVs gözle görülür dalgalanmaya (örneğin, disket görünür) ışık mikroskop altında. Onlar gergin görünüyorsa, buharlaşma zaman tanıyın.
   Not: Osmolarite değişim oranı bağlıdır buharlaşma yüzey alanı, sıcaklık, vbve yakından takip edilmelidir. Prensip olarak, Osmolarite fark baştan Sükroz/glikoz konsantrasyonu ayarlayarak ayarlamak, ancak, bir ozmotik şok değil ikna etmek için özen gösterilmelidir.
2. Bir disket Şef bulmak ve pipet Aspire edin. Aspirasyon dil (membran pipet içinde parçası) uzunluğu pipet RADIUS ilgili^15,16,22,23 (olmak teorik analizi için daha büyük veya eşit olmalıdır Şekil 2). Birkaç GUVs deneyin. GUVs hiçbiri yeterince uzun bir dil üretmek için Aspire, birkaç dakika daha bekleyin. GUVs yeterince disket varsa, sonraki adıma geçin.
3. Odası ile madeni yağ daha fazla arabellek buharlaşma önlemek için mühür. Bunu dikkatlice deneysel odası açık kenarları boyunca petrol pipetting tarafından.
4. Aspirasyon basınç sıfır konumunu ayarlamak için ilk olarak, bir boncuk odasında arayın ve aspirasyon pipet çıkış boncuk yakınında konumlandırın. Boncuk sucked de aspirasyon pipet tarafından üflenir su deposu yüksekliğini ayarlayın. Her ne kadar buharlaşma ve bu nedenle daha fazla basınç değişiklikleri odası içinde mineral yağ engeller, aspirasyon basınç her Şef ölçme önce sıfır.
5. Bir şef bulmak ve bu Aspire edin. Micropipette yukarı ve dışarı odak (odası hareket ettiğinde nerede bu pipet dışarı kesme stres tarafından çekilmiş Şef yüzey uzak tutmak için) taşımak.
6. Bir boncuk için dikkatle odası hareket ettirerek bak. Ani bir hareket Şef e çıkartabilirsiniz. Optik cımbız bir mesafe ile tuzağa ~ 20 µm odası alt uzak. Bölgenin ilgi başka bir boncuk veya görünürde membranlar ile temiz olduğundan emin olun. Boncuk dışında optik cımbız düşen bir şey ölçüm bozabilir olacaktır.
7. Şef e geri optik tuzak (Şekil 2) ile uyumlu micropipette ile boncuk uzakta ve odak haline getir.
8. Boncuk (kuvvet ölçümleri için gerekli) denge konumu ölçmek 1-2 min için hareket kaydetmek.
9. Bu yüzden membran gerginliği azaltmak için Şef e kaybetmeden micropipette mümkün olduğu kadar içinde basıncı azaltmak. Dikkatle için boncuk streptavidin-biotin bağlar, kurulması biraz etrafında ile temas Şef e getirin sonra yavaşça çekin Nanotüpün oluşturma geri. Şef boncuk uzak ya da doğru hareket ile en az optik cımbız boncuk bozmaya bir piezo aktüatör ideal olarak yapılmalıdır.
   Not: nanotüp formu değil, bu zavallı streptavidin kaplama boncuk, Şef, glikoz deneysel arabellek veya membran tuz veya aşırı konsantrasyon yetersiz konsantrasyon biotinylated lipidler yetersiz miktarda nedeniyle olabilir Şef gerilim çok yüksek⁴⁸gösteriyor.
10. Bu yüzden aspirasyon dilini yeniden aspirasyon basınç artışı. Aspirasyon pipet ve sonuna kadar tüp (Şekil 2) odaklanmak eksenindeki yalan için tüp hizalayın.
11. Şef Ekvator ve tüp odakta olduğundan emin olun. Birkaç dakika için parlak alan mikroskobu Boncukla hareketinin kayıt (kamera satın alma hızı 30 Hz burada). Yüksekliği, h, su deposu sıfır konumu ile ilgili olarak kaydedin. Sisteminin (Şekil 2) bir kaç confocal görüntülerini almak.
12. Farklı aspirasyon baskılar, örtülü olarak membran gerginlikler, önceki adımı yineleyin. Tipik gerginlik aralıktır 0,015 – 0,2 ile bir adım büyüklük-in çevrede 0,02 mN/m/m, mN.
13. Proteinler veya molekül sistem yakınındaki enjekte optik tuzağına boncuk değil üzgün emin nanotüp yakınındaki enjeksiyon micropipette getir. Yavaşça bir basınçta enjekte 1 – 2 baba.
14. Protein bağlayıcı (floresan yoğunluğu Şef üzerinde sabit kalan membran üzerinde enjekte protein) equilibrated sonra step-wise ölçümleri çıplak membran gibi (Adım 3.11 ve 3.12) ile yineleyin.
    Not: bu yana ölçümleri proteinler sabit basınçta Şef e yakın enjekte ederken gerçekleştirilir, toplu konsantrasyonu protein Şef kabaca değişmeden kalır; Böylece, protein desorpsiyon ölçüm sırasında ihmal edilebilir olmalıdır.
    1. Alternatif olarak, bir sürekli protein toplu konsantrasyon sağlamak için tüp çekme deneyleri gerçekleştirmeden önce GUVs proteinleri birlikte kuluçkaya mümkündür. Verilen bu proteinler tüp ve Şef göreli membran kısmını ölçülür, proteinler teslim edilir şekilde eğriliği sıralama hesaplama etkilemez (Bölüm 4 bakınız).

Şekil 2: deney tüpü çekerek. (A)şemaları deneme. Bu iletişim kuralı açıklandığı gibi çekti bir tüp (B) A confocal görüntüsü. Ölçek çubuğu 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. ölçümleri ve veri analizi

1. Membran gerilim ölçme
   1. Her adımda sürekli aspirasyon basınç için hidrostatik basınç Hesapla:
      ΔP pgh =
      p su yoğunluğu, g yerçekimi ivmesi ve h adım 3.11 su tankından yüksekliğini nerede.
   2. Confocal görüntülerden, Şef, r_Şef, yarıçap ve aspirasyon pipet, r_PIP (Resim 2) RADIUS ölçmek.
   3. Membran gerginlik, σ, Laplace denklemi⁴⁹kullanarak hesaplar:
      
2. Membran güç ölçme
   1. Optik cımbız, k, sertliği birkaç ayarlama yöntemleri²⁷birini kullanarak belirleyin. Bu kurulum, ölçü k viskoz kullanarak yöntemi²⁷sürükleyin.
   2. Boncuk, ₀,denge konumunu tüp (Adım 3.8) çekerek önce bir ölçüm üzerinden ortalama olarak hesaplayın.
   3. Her sabit gerilim ölçümü için denge membran Kuvvetleri, F, ' Hooke'un Kanunu Hesapla:
      F = k(bir - bir₀)
      Burada bir ortalama boncuk bu ölçüm sırasında konumudur.
3. Ölçüm tüp RADIUS
   1. Çıplak membran (hiçbir ekledi membran eğri moleküller) söz konusu olduğunda, güç olarak gelen tüp yarıçapı, R, Hesapla:
      R F/(4πσ) =
      (^22,23başvuruyor).
   2. Tüp RADIUS bağımsız olarak adım 4.3.1 ve huzurunda moleküllerin membran eğri ölçmek için ilk, lipid floresan yoğunluğu ben_küvet, tüp uzunluğu boyunca ve Şef kontur, ben_Şefboyunca yazmak. Bir fluorophore içinde veya membran için sınır ortalama Floresans yoğunluğunu bir tüp veya Şef kontur parlak çizgi boyunca ortalama bir yoğunluk olarak ölçmek. Şef kontur veya tüp yatay bir bölümünü içeren bir dikdörtgen kutu seçin ve floresan yoğunluklarda kutusunda Yatay her satırın toplamı hesaplayın.
      1. Her toplam piksel yatay çizginin (Yani, kutusunu genişlik) sayıya bölme. Seçilen kutu diğer membran mevcut olmalıdır unutmayın. Seçilen kutu uzunluğu boyunca floresan yoğunluğu profil elde edilir.
      2. Arka plan yoğunluğu çıkarılarak sonra ortalama piksel floresan yoğunluğu en parlak satırından alın. Tüp RADIUS Floresan Tüp ve Şef kontur boyunca oranını doğrusal olarak ilişkilidir:
         R K_küvetküvetben= /ben_Şef
         nerede K_küvet bir kalibrasyon faktörü²⁵' tir.
         Not: Bu yöntem (tüp içinde bir confocal Voksel genişliği yalan söylemek dar olduğunda) 10-80 nm aralığında tüp RADIUS ölçmek için kullanılabilir ve 80 nm ve yüksek aralığı biraz daha büyük bir belirsizlik ile. Ölçüm hassasiyeti ayarlarına bağlıdır.
   3. K_küvet adım 4.3.1 ve 4.3.2 doldurulmamış lipidler kullanarak basit membran kompozisyon üzerinde bağımsız RADIUS ölçümler gerçekleştirerek belirlemek. Böyle basit membran kompozisyon yarıçapı ve kuvvet 4.3.1 adımda verilen basit ilişki sahip olabilirsiniz. Birkaç kez denemeyi tekrarlamak ve R ben_küvetkarşı kuvvet (Adım 4.3.1) üzerinden sonuca vardım, arsa /ben_Şef (Adım 4.3.2). K_küvet uygun üzerinden hesaplamak. Bu kurulum, K_küvet içinde 200 = ± 50 nm kullanarak yumurta L-α-phosphatidylcholine (yumurta-PC) membran ve floresan bir lipid kimin floresan en az polarizasyon²⁵üzerinde bağlıdır.
      Not: K_küvet onların farklı confocal Voksel birimleri nedeniyle farklı amaçlar için ölçülen gerekir. Lipid fluorophore enjekte proteinler/molekülleri ile etkileşim değil. Burada, BODIPY TR ceramide, önerilen floresan lipid proteinler ile herhangi bir etkileşim olması beklenir değil. Bu varsayım BAR önceki çalışmalar ile teyit edildi ve hangi yüksek protein yüzey kapsama, tüp RADIUS göstermiştir ben-BAR etki alanları^25,36,37, proteinler tarafından bağımsız olarak sabit Şef gerginlik. Proteinler ile lipid fluorophore etkileşim, çeşitli yüksek protein yüzey kesirler, tüp azalması veya fluorophore zenginleştirme gözlenir.
4. Proteinlerin yüzey yoğunluğu ölçme
   1. Lipid karışımları bir floresan lipid (Toplam protein, örneğin, etiketlemek için kullanılan boya olarak aynı dalga boyu yaklaşık beş farklı köstebek kesirler ile desteklenmiş bir basit doldurulmamış lipid (örneğin, yumurta-PC) kullanarak hazırlamak BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (HPC *) örneğiniçin Alexa488 etiketli protein) aralığı: X_{HPC *} = 0,01-%1. GUVs (1 bir önceki yayın¹³bölümündeki) plakalar ITO tarihinde electroformation tarafından 100 mM Sükroz hazır olun.
   2. GUVs toplamak ve β-kazein ile düzgünleştirilecek deneysel bir odasına aktar. Örneğin, 100 mM glikoz deneysel çözüm için kullanın. Yerleşmek GUVs için birkaç dakika bekleyin.
   3. GUVs confocal floresan görüntülerini almak ve kayıt Şef boyunca ortalama Floresans yoğunluğu floresan lipid köstebek kısmını bir fonksiyonu olarak kontür (bkz. Adım 4.3.2). Her kompozisyon için floresan lipid, φ alan yoğunluğunu hesaplamak_HPC*. Örneğin, alan başına lipid 0.7 nm², φ olduğu varsayımıyla tarafından_HPC* 1.43 x 10 =⁶ X_{HPC *} belgesi başına. Şef, ben_{HPC *, Şef}, φ karşı floresan yoğunluğu HPC * arsa_HPC*. Uygun verir φ tarafından belirtilen kalibrasyon sabit, A,_HPC* = AI_{HPC *, Şef}. A bağlıdır mikroskobu ayarlar üzerinde lazer güç ve Dedektör hassasiyeti (Yani, kazanç), bu nedenle kayıt öyle aynı derecede A çeşitli yaygın olarak kullanılan (bkz: şekil 3örnekte) mikroskopi ayarları için.
   4. Aralığında farklı konsantrasyonlarda HPC * deterjan içinde örneğin, Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), çözünmüş çeşitli çözümler hazırlamak ~ 1'e 10-50 µM. floresan yoğunluğu her çözümün toplu olarak kaydetmek ve yoğunluk eğimini hesaplayın karşı konsantrasyonu (şekil 3). Ölçüm için benzer bir konsantrasyon aralığı protein Birleşik fluorophore ile tekrar ( şekil 3' te Alexa488 ile örneğe bakın). Bu ölçüm Floresans yoğunluklarda protein etiket ve lipid etiket, ben_{A488, toplu} ilişkilendirmek için gerekli / ben_{HPC *, toplu}, mutlaka aynı toplu toplama, aynı şekilde yaydıkları değil gibi.
   5. Fluorophores bir fluorospectrometer kullanarak protein molekül başına sayısını ölçmek. Örneğin, Alexa488 durum için Alexa488 molekülleri protein, n_A488, başına sayısı aşağıdaki ilişkisi kullanılarak hesaplanabilir:
      n _A488 = (A₄₉₄/ε_A488) / ((A₂₈₀ - 0,11bir₄₉₄) / ε_prot)
      A₄₉₄ ve A₂₈₀ nerede Absorbans değerleri birim uzun uzadıya 494 başına nm ve 280 nm, sırasıyla ve ε_A488 ve ε_prot Alexa488 moleküler Absorpsiyon katsayıları ve protein, anılan sıraya göre.
   6. Şef, protein yüzey yoğunluğu hesaplamak φ_{prot, Şef}, aşağıdaki formüle göre:
      
      Protein polimerizasyon durumunu göz önünde bulundurun. Örneğin, protein BAR dimerize, bu nedenle hesaplanan yoğunluk alan başına BAR monomer monomeric formu yok olma katsayısı kullanarak olacak.

Resim 3: bir örnek protein yüzey yoğunluğu kalibrasyon. Ölçülen HPC * lipid floresan yoğunluğu toplu (solda) ve GUVs (ortada) vardır. Ayrıca, ölçülen (BAR etki alanına bağlı) Alexa488 toplu floresan yoğunluğu vardır (sağda). Floresan yoğunluğu konsantrasyon ile doğrusal olarak ölçeklenir. Gösterilen ölçümler için özel algılama kazanç vardır ve güç çıkışı lazer. Başvuru³⁷gelen verileri esas oluşturulan çizer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonuçlar

Tüp çekme deneyi membran hakkında hayati mekanik bilgi verebilir. Proteinler veya Çift zar eğriliği, membran ile kuvvet ve tüp RADIUS ile membran gerginlik Canham Helfrich Hamilton uygulayarak ilgili diğer moleküller yokluğunda bir şef^{50,51 bir tüp denkleme çekti}

(Denklem 1)...

Tartışmalar

Tüpler GUVs çekme yöntemi yalnızca membran temel mekanik özelliği ölçmenin anlamına gelir değil ama protein ve membran arasında bağlantı ışık tutacak yardımcı olur gibi membran protein sistemi hakkında zengin bilgi verir eğriliği. Giriş bölümünde açıklandığı gibi alt mikron lipozomlar yüzey düzgünleştirilecek^18,19 ' a hayvan zinciri ile proteinler kuluçka veya gözlemleyerek proteinler membran eğme, etkilerini ölçmek için ba...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5