Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Özet

Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.

Özet

Luciferase tabanlı gazetecilere hücresel gen ifadesinin boyuna her ikisi için yaygın kullanılmayan ve biyolojik aktivitesini son nokta deneyleri. Sirkadiyen ritim araştırmada, örneğin, saat gen füzyon ile ateş böceği luciferase neden için sağlam ritimler birçok gün içinde kalıcı hücresel bioluminescence içinde olmaktadır. Teknik sınırlamalar photomultiplier tüp (PMT) ile ilişkili veya geleneksel mikroskobu tabanlı yöntemler bioluminescence miktar için genellikle hücre ve dokuların sırasında oldukça fizyolojik koşullarda muhafaza edilmesi talep var. kayıt, duyarlılık ve işlem hacmi arasında bir denge ile. Burada, uzun vadeli bioluminescence görüntüleme yüksek hassasiyet ve hangi kültür koşullar, değişken gaz ve nem kontrolü de dahil olmak üzere geniş bir dizi çekmek ve bu birçok kabul eden işlem hacmi ile farklı sağlar bir arıtma önceki yöntemlerden raporu doku kültürü tabak ve yemekler. Bu otomatik boyuna luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) ayrıca Imaging mekansal varyasyon gözlem luciferase ifadede hücre monolayer veya kolayca geleneksel tarafından gözlenen cant doku üzerinden sağlar yöntemleri. Biz nasıl timsah varolan yöntemleri ile karşılaştırıldığında luciferase aktivite tespiti için büyük ölçüde artan esneklik sağlar vurgulayın.

Giriş

Luciferases gazetecilere gen ekspresyonu ve protein etkinliği olarak kullanımı moleküler ve hücre biyolojisi araştırmalarında popüler bir teknik haline gelmiştir. Bu ateş böceği luciferase sentezi ve katalitik inactivation Kinetik nerede üzerinden yaklaşık 24 s sirkadiyen döngüsü meydana gen ekspresyonu boyuna değişimler raporlama için özellikle uygundur sirkadiyen alanında geçerlidir. Bu nedenle, luciferase Mantarlar, bitkiler, sinekler ve memeliler^1,2,3,4da dahil geniş bir aralığında sirkadiyen muhabir olarak istihdam edilmektedir.

Sirkadiyen gen ifade vitromiktarının, bir photomultiplier tüp (PMT) yaygın olarak kollarındaki sinyal kaydetmek için kullanılır. Devresel_ödeme tabanlı ölçümleri esneklik ancak, genellikle önceden belirlenmiş bir tabak ya da çanak boyutu sınırlı sınırlı olabilir. Ayrıca luciferase ifadede mekansal varyasyon gösteren örnekleri Imaging bilgi kaybına yol açabilir bir Devresel ödeme kullanarak izlenen örnekleri kayma herhangi bir bilgi toplamak mümkün değildir. Ayrıca, devresel_ödeme ve ilişkili elektronik oksijen Standart hücre kültür kuluçka ortamına maruz kaldığında arıza eğilimli olduğundan, boyuna luciferase kayıt PMTs kullanarak her zaman sigara nemlendirilmelidir İnkübatörler içinde gerçekleştirilir. Sonuç olarak, hücre kültürü yemekleri gerekir kapalı hava-buharlaşma yoluyla nem kaybını önlemek için sıkı ve kültür medya bu nedenle 3 - ile tamponlanmış olmalıdır (N- morpholino) propanesulfonic asit (paspas) veya 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit (HEPES), in vivo fonksiyonları ve memeli doku kültüründe rutin olarak kullanılan sistem tampon CO₂/bicarbonate yerine.

Bu sınırlamalar bir sonucu olarak PMTs tarafından bioluminescence ölçümü genellikle sıkı kısıtlamalar altında hücreler deneyler sırasında korunur koşulları üzerine yerleştirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için ve aynı zamanda olası deneysel koşullar aralığı artırmak için biz bir su soğutulmuş elektron-çarparak eklenmesi tarafından uyarlanmış bir standart CO2/n₂ 170 L doku kültürü kuluçka makinesi kullanın Anti-sis optik ve dijital kontrol sıcaklık ve gaz düzeyleri ile şarj kuplajlı cihaz (EMCCD) kamera. Bu bir otomatik boyuna Luciferase gaz görüntüleme ve Temperature-Optimized kaydedici ya da timsah dönüşmüş bulunuyor. Kollarındaki görüntüleme, standart doku kültürü plakaların yüksek üretilen iş görüntüleme için her ikisi de önemli ölçüde artan esneklik için timsah sağlar (6 x 96 - veya 384-da kadar tabaklar aynı anda) ve standart dışı doku kültürü sistemleri, için de böyle derin hücreler olarak mikrosıvısal aygıt içinde büyüdü. Bu araç aynı zamanda oksijen koşullar altında ve değişken kontrolünü hem CO₂ O₂ kısmi basınç ve sıcaklık ile gerçekleşmesi için görüntüleme için sağlar.

İletişim kuralı aşağıdaki memeli hücre ve doku kültürü sistemleri (bundan böyle 'bioluminescence kuluçka' adlandırılır) bir timsah kullanarak kollarındaki kayıt için bir yöntemi açıklar. Bu, ancak, sistem kollarındaki görüntüleme ve aynı zamanda, bazı değişiklik, Floresan, diğer biyolojik sistemleri ve bağlamlarda bir dizi Imaging ile uygun olması gerekmektedir.

Protokol

1. tohum ve sıcaklık sürüklenme hücre

Not: Bu protokol titizlikle PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) füzyon protein⁴ifade birincil ve ölümsüzleştirdi fare fibroblastlar kullanılarak test edilmiştir. Ayarlamalar için diğer hücre hatları kullanarak deneyler yapılması gerekebilir.

1. Hücre kültürü başlamadan önce ertesi gün ısıtmak için 37 ° C su banyosu içine yerleştirin: fosfat tamponlu tuz (PBS) (pH 7,4), PBS 0.68 mM ethylenediaminetetraacetic asit, pH 7.2 (PBS + EDTA), uygun hücre kültür ortamı, örneğin, ile desteklenmiş Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ve %0.25 tripsin çözeltisi ile desteklenmiştir.
2. Tripsin 1:3 Önceden ısıtılmış PBS + EDTA çözüm ile sulandırmak ve su banyosu dönün.
3. 125 cm² şişeye % 70-90 luciferase ifade hücre Konfluent al. Medya Aspire edin. 10 mL Önceden ısıtılmış PBS ekleyin.
4. PBS Aspire edin. Önceden ısıtılmış tripsin EDTA-2.5 mL ekleyin ve 5 min için 37 ° C kuluçka şişeye geri dönün.
5. Hücreleri kuluçka ve mikroskop altında görünüm kaldırın. Hücreleri çoğunluğu balonun altından ayırdıktan sonra sonraki adıma geçin. En hücreleri Balonun sonuna kadar bağlı kalır, çoğu hücre süspansiyon olana da kuluçka için dönmek.
6. Standart hücre kültür ortamının daha da 7.5 mL şişe için ekleyin. İsteğe bağlı olarak, bu daha fazla geçiş gerektiği gibi hücre için 1 mL kaldırın.
7. Bir hemasitometre ve trypan mavi kullanarak kalan hücreleri yoğunluğu saymak. Hücreleri daha fazla, o hücreyi satır için uygun olarak sulandırmak.
   Not: aşağıdaki deneyler için 6 x 10³ hücreleri/cm² ve 1 x 10⁴ hücreleri/cm² 96-şey plakaları, 35 mm yemekleri veya kanal slaytlar arasında PERIOD2::LUC fibroblastlar seribaşı.
8. Doku kültürü yemekleri veya kayıt için kullanılacak olan tabak üzerine tohum hücreleri.
   Not: Bu kayıt sırasında kuyular arasında girişime azaltmak iken kayıtları başlamadan önce değerlendirilmek kültür sağlık verir gibi siyah yüzlü, temiz popolu plakaları kullanılması önerilir. Bioluminescence düzeyleri çok düşük olduğu, lütfen birkaç saat için devam ederse arka plan sinyal Yakamoz yol açabilir Not artmış olmasına rağmen beyaz yemekleri/tabak ışık algılama, en üst düzeye çıkarmak için kullanılmalıdır.
9. Tabakları da kuluçka için dönün ve monolayers % 100 izdiham (yaklaşık 7 gün) ulaşmak izin.
   Not: koşuluyla medya düzenli olarak yenilenir sonra Konfluent, iletişim inhibe hücre hatları ilâ üç hafta önce deneme için korunabilir (her 5-7 gün).
10. Sonra Konfluent, hücresel ritimleri en az 72 h deneme^5,6 hemen önce uygulanan ısı devir (12 h 32 ° c, 12 h 37 ° C'de) kullanarak eşitleme (tarafından önceden programlanmış bir Bisiklete binme kuluçka makinesi kullanarak, kontrol bir bilgisayarın da kuluçka RS-232 seri bağlantı noktası üzerinden bağlı).
    Not: Hücresel ritimleri senkronizasyon için gereken ısı devir sayısı hücre satır aralarını değişebilir ve bu nedenle diğer hücre satırlarını optimize etmeniz gerekebilir. Akut farmakolojik stimülasyon Forskolin veya deksametazon kullanarak da daha önce hücresel ritimleri^7,8eşitlemek için kullanılmıştır.

2. NS21 hazırlık

Not: NS21 bir serum ücretsiz bakım için nöronal ve diğer hücre kültürleri ekidir. Piyasada bulunan ve bir serum yerine sirkadiyen bioluminescence kayıtları⁹sırasında kullanılan B27 olarak bilinen benzer bir ek bir arıtma olduğunu. Her iki ek aşağıda açıklanan deneysel protokoller için kayıt ortamı içinde birbirlerinin yerine kullanılabilir. Oldukça mümkün ve uygun maliyetli NS21 içi, Chen ve ark. olduğu gibi yapmak ¹⁰ve burada açıklandığı gibi.

1. Tablo 1 ' de, oda sıcaklığında başlamadan 1 h için açıklanan tüm bileşenleri equilibrate.
2. 324 mL Bazal orta (örneğin, neurobasal) 50 gr sığır albümin buza geçiyoruz. Mümkün olduğunca az karışımı ilave edin.
3. En az her bileşenin sonra karıştırma ama hala ayrıntılı karıştırma sağlamak daha tüm bileşenleri ekleyin. Tüm bileşenleri başlayan 90 dk içinde erimesi hedefliyoruz.
4. Aliquot son karışımı ve mağaza-20 ° c kadar gerekli. Tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri kaçının.
   Not: Karışımı bu aşamada filtre uygulamak için çok viskoz, ama steril hücrelere eklemeden önce medya ile seyreltilmiş zaman filtre uygulanır.

3. kayıt medyası hazırlama

Not: Boyuna bioluminescence kayıt için diğer ekipman bir birincil avantajı bioluminescence İnkübatör kuluçka makinesi nemlendirmek ve O₂ ve CO₂kısmi baskısı çeşitlendirmek güçlü olmak sayesinde bu olmasıdır ortam koşulları kayıt bioluminescence için daha geniş bir aralığı kullanmak mümkün — daha yakından farklı hücre tarafından işgal fizyolojik niş yaklaşık koşulları da dahil olmak üzere türleri vivo içinde. Aşağıda tarif biz Hastings ve ark. adapte kayıt birimleri formülasyonu Biz düzenli olarak kullandığınız kültürlü fibroblastlar ve diğer hücre tipleri ile ⁹. İlk mühürlü kültür koşulları (olmadan gaz değişimi) için ve ikinci için fizyolojik ilgili koşulları ve % 5 CO₂ile oksijen koşulları altında kullanılmalıdır.Hem mümkün hem de tavsiye, tam uygulama ve hücre tipi bağlı olarak birçok diğer çeşitleri vardır.

1. Yüksek glikoz BEZLERİ tamponlanmış medyası hazırlama
   Not: Stok çözüm (1 L): DMEM tozu (8.3 g/L), 0.35 mg/mL sodyum bikarbonat, 5 mg/mL glikoz, 0,02 M MOPS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin.
   1. 8.3 g DMEM toz 900 mL ultrasaf su 1000 mL ölçüm silindir geçiyoruz ve için 30 dk tüm parçacıklar eriyene kadar karıştırın.
   2. 50 mL glukoz çözeltisi (100 g/L), BEZLERİ (1 M, pH 7,6), 20 mL 100 kalem/strep çözüm x 10 mL ekleyin ve başka bir 10 min için karıştırın.
   3. 4.7 mL % 7.5 sodyum bikarbonat çözüm ekleyin ve bir daha fazla 5 dakika karıştırın.
   4. Ortam pH 7,6 (oda sıcaklığında Eğer) veya 7,4 (37 ° C) HCl/NaOH ile ayarlayın.
   5. Son hacmi 1000 mL üretmek için ultrasaf su ekleyin.
   6. Bir 0,22 µm filtre ve mağaza gerekli kadar 4 ° C'de filtrasyon tarafından sterilize.
   7. Deney öncesinde % 10 serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, bir çalışma stok yapmak için % 2 NS21 ve 1 mM biyoluminesans ile hisse senedi çözüm uygun bir hacmi ek. Bu hisselerin bir 0,22 µm steril filtreden geçmek.
   8. Osmolalite, bir osmometer kullanarak, medyada ölçmek.
      1. Osmometer üzerinde açın.
      2. Ultrasaf su ile ilk osmometer kalibre. 50 µL su ölçüm bir gemi altýna ekleyin. Sıvı hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Gemi üzerinde sonda küçük. 'Sıfır' tuşuna basın ve dikkatle osmometer kol en alçak noktası için daha düşük. Okuma işlemi tamamlanıp kol yetiştirme ve gemi kaldırma önce 'sonuç' yeşil ışık yaktı kadar bekleyin.
      3. Osmometer 300 mOsmol/kg 50 µL kalibrasyon standardı kullanılarak kalibre için yineleyin. 'Cal' kol düşürücü önce basın.
      4. Örnek osmolalite yukarıdan aşağıya doğru bir ölçüm gemi ve ölçü yukarıdaki gibi Medya 50 µL ekleyerek ölçmek. 'Osmometer kol düşürücü önce örnek' tuşuna basın.
   9. Osmolalite 350 mOsmol 5 M NaCl kullanarak için ayarlayın.
2. HCO₃-düşük glikoz medya (perfüzyon orta) hazırlık arabelleğe alınmış
   Not: Stok çözüm (1 L): DMEM tozu (8.3 g/L), 3.7 mg/mL sodyum bikarbonat, 1 mg/mL glikoz, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin.
   1. 8.3 g DMEM toz 900 mL ultrasaf su 1000 mL ölçüm silindir geçiyoruz ve için 30 dk tüm parçacıklar eriyene kadar karıştırın.
   2. 50 mL glukoz çözeltisi (100 g/L), 10 mL 100 x kalem/strep çözeltisi ekleyin ve başka bir 10 min için karıştırın.
   3. 49,4 mL % 7.5 sodyum bikarbonat çözüm ekleyin ve bir daha fazla 5 dakika karıştırın.
   4. Ortam pH 7,6 (oda sıcaklığında) veya 7,4 (37 ° C) HCl/NaOH ile ayarlayın.
   5. 1000 mL son bir hacim vermek için ultrasaf su ekleyin.
   6. Solution'ı 0,22 µm steril filtre ve mağaza 4 ° c kadar kullanmak geçmek.
   7. Deneme önce hisse senedi çözümü ile % 2 serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, NS21% 2 ve 1 mM biyoluminesans bir çalışma stok yapmak için uygun bir hacmi ek. Bu hisselerin bir 0,22 µm steril filtreden geçmek.
   8. Ölçmek ve osmolalite 350 mOsmol BEZLERİ tamponlanmış medya gelince 5 M NaCl kullanarak için ayarlayın.

Not: Biyoluminesans konsantrasyon ampirik olarak her hücre tipi ve bağlam için tespit edilmelidir. Daha fazla bilgi için bkz: Feeney vd. ¹¹ serum ve NS21 (ya da kullandıysanız B27) konsantrasyonları uygulamaya bağlı olarak farklı olabilir. Bunlar hücre hayatta kalma ve eki tanıtmak gibi Ancak, biz başka türlü göstermek için ampirik olarak test sürece, serum ve NS21 (ya da alternatif serum-Alerjik ilave) kullanılması, tavsiye edersiniz. İletişim kurabilirim hücre hatlarında de inhibe, serum konsantrasyonu serum tarafından Ayrıca yükselen yayılması karıştırıcı etkilerini önlemek için kayıt ortamı içinde düşürmek gerekli olabilir.

4. kayıt

1. Kayıt başlamadan önce uygun çalışma ortamı stok (Kimden adım 3.1 ya da bağlı olarak deneme 3.2) ısıtmak için bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin.
2. Medya ısınma iken bioluminescence kuluçka kamera odaklama.
   1. Su geçirmez, ısıtmalı nötr yoğunluk filtresi sökün ve bir kenara koyun.
   2. Yüksek satın alma oranı ile bir video kaydetmek için yazılım ayarlayın. Tıklatın "satın alma | Edinme Kur". 'Çekim hızı' 0.2 s ve Kinetik döngü süresi 0,3 saniyeler için ayarlayın. EM kazanç kapalı olduğundan emin olun.
   3. 'Satın alma ayarları' penceresini kapatın ve "görüntülerini" simgesini tıklatın.
   4. Kaydedilecek yükseklikte rafta açıkça odak video maddelerinin kadar odaklama silindir kullanarak, kamera objektifi döndürün.
   5. Video 'videoyu durdurun' simge tıklayarak durdurabilirsiniz.
   6. Vida ısıtmalı nötr yoğunluk filtresi geri içine konum. Aksi halde EM-CCD kamera ve/veya amacın yoğuşma nedeniyle sisleme zarar görmesine neden.
3. O₂, CO₂ve sıcaklık bioluminescence kuluçka ön kontrol panelini kullanarak istenen deneysel koşullar için ayarlayın.
   Not: perfused performans, hücre kültürü devam doğrudan Bölüm 5'e bu aşamada.
4. Hücreleri doku kültürü kuluçka ve basına kapalı aspiratı kaldırın. Ortamı Önceden ısıtılmış çalışma hisse senedi ile değiştirin.
5. Bioluminescence kuluçka makinesi deneme sırasında nemlendirilmelidir değil ise, bir gaz geçirmez mühür ile yemekler ve tabak kapatın.

Bioluminescence kuluçka nemlendirilmelidir için ise, yemekleri 96-şey Kaplamalar, buharlaşma küçük bir miktar aksi takdirde mümkün olduğunca gaz geçirgen bir mühür kullanarak gibi küçük bir birim ile mühürlemek için tercih edilir, ancak sonra bu yemekleri, mühür kesinlikle gerek yoktur hala oksijen İnkübatörler bile oluşur.
Not: Nemlendirme kuluçka makinesi dibinde su tepsisi doldurarak elde edilir.

Hücreleri kuluçka kapı ve güvenli kuluçka formu bir ışık geçirmez mühür yere kapak bioluminescence kuluçka makinesi, yakın aktarın.

Uygulama için uygun kayıt parametrelerini seçin.

1. Tıklatın "satın alma | Edinme Kur".
2. 'Kamera Setup' panelinde ayarlayın: 'Satın alma moduna' 'Kinetik'; 'Pozlama süresi' için (aşağıdaki nota bakın) saniye pozlama süresi, istenen; 'Birikimleri' 1'e; 'Kinetik serisi uzunluğu' edinme döngü sayısı için istenen; 'Kinetik döngü süresi' için istediğiniz görüntüleme aralığı (Bu çekim hızı büyük olduğundan emin olun); 'Hız kayması için 4,33 µsecs'; 'Elde etmek için 1'; ve onları kazanmak ' için istenen seviye (aşağıdaki nota bakın)
3. 'Otomatik kaydetme' panelinde, dosya türü .sif veya .tif olarak ayarlayın. Bir dosya adı ve konumu uygun.
4. 'Biriktirme' panelinde tiff için dosya türünü ayarlayın. Bir dosya adı ve konumu uygun. Edinme Kurulumu penceresini kapatın.

'Almak sinyal' düğmesini tıklatarak kayıt işlemini başlatmak.
Not: olarak bioluminescence kuluçka makinesi çok sayıda farklı hücre ve doku türleri, her biri farklı düzeylerde bioluminescence olacak, için kullanılabilir arasında uygun bir kollarındaki sinyal toplamak için gerekli çekim hızı değişir deneyler. Toplanan sinyal büyüklüğü artırmak için görüntüleme elektron teksir makinesi (EM) kazanç olarak değiştirmek mümkündür. Bilinmeyen parlaklık yeni uygulamalarda, öneririz ilk istenen kayıt koşulları kadar kazanç nispeten kısa maruz kalma süresi (yaklaşık 10 dakika) ile tek bir görüntü olmadan EM kazanç alarak ve daha sonra çekim hızı ve EM ayarlama ulaştı. Çoğu durumda, en büyük olası piksel yoğunluğu % 10-20'si kötü bir sinyal kamera için için amaç için iyi bir düzeydir. Bir kez kayıt parametrelerini uygun bir dizi ulaştı, görüntüleri, boyuna edinimi yukarıda açıklandığı gibi başlatın.

5. derin doku kültürü (isteğe bağlı)

Not: giriş bölümünde açıklandığı gibi bioluminescence kuluçka makinesi standart dışı doku kültürü sistemlerinin görüntüleme için uygundur. Bu derin hücre kültürü için bir sistem geliştirme örneklenir.

1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi radarı bağlantısı 0,6 veya 0.8 mm, DMEM %10 FBS ve kalem/strep, kanal derinliği olan tohum hücreleri tek kanal üzerine slaytlar. Perfüzyon medya 3.2 adımda anlatıldığı gibi olun.
2. Kayıt önce boru 1 mm iç çapı (kimlik) kullanarak gerekli perfüzyon sistemi için hazırlamak ETFE boru ve 1 mm kimlik silikon tüp, dirsek, kadın ve erkek radarı aksesuarlar, şekil 2Agösterildiği gibi.
   Not: ETFE kablo kanalları, kanal slaytlar daha sonra bağlantı bağlantı elemanları radarı ETFE boru bağlamak için kullanılan silikon tüp bölümlerini 2 cm ile tüp uzunluğu çoğunluğu var.
3. Tüp % 70 etanol, steril PBS tarafından takip ile temizlenerek sterilize.
4. Hücre kültürleri kanal slaytları kuluçka makinesi kaldırın. Medya Aspire edin ve Önceden ısıtılmış perfüzyon ortamı ile değiştirin.
5. 20 mL şırınga Önceden ısıtılmış perfüzyon medya ile doldurun.
6. Tüp için arabellek bağlamak (bkz. Şekil 2) slayt ancak hücre içeren slayt ve boru ve slayt ile perfüzyon kitle iletişim araçları (3-5 mL).
7. Hücreyi içeren slayt bağlanmak ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için medya ile daha fazla 1 mL sistem bütün floş.
8. Tüm sistem bioluminescence kuluçka aktarın.
9. Şırınga için medya dolu şırıngalar boru üzerinden kesmeden pompa ve medya aracılığıyla pompa kullanarak emin olmak için orada tüm sistemi bir daha fazla 1 mL sifonu uyum içinde belgili tanımlık sistem hiçbir hava kabarcıkları vardır.
10. Bu kullanılan şırınga pompa üzerinde çapı.
    Not: Burada kullanılan 20 mL şırınga için çapı 19.13 mm olduğunu.
11. Pompa debisi 50 µL/h için ayarla ve başlatma çalışır.
12. Hücre monolayer karşıdan karşıya geçerken bunlar luciferase ifade etkileyecektir gibi herhangi bir slayt veya boru başlamadan önce kayıt, hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Daha fazla medya gerekirse, bunu başarmak için hücreler boyunca sifonu çek.
13. Bioluminescence kuluçka kapıyı kapat ve olduğu gibi adım 4.7-kaydetmeye başlamak için devam edin.

6. kayıt sırasında tedavi

Not: Bazen bu farmakolojik veya hormonal aracıları ile olmak bir kaydı aracılığıyla hücreleri midway tedavisi için tercih edilir. Bu gibi durumlarda, bu hücreleri tedavi sırasında sıfırlamayı gelen hücresel salınım önlemek özenle işlenir zorunludur. Bu büyük bir entraining işaret hücresel sirkadiyen ritim^5,6için olduğu gibi bu nedenle, bu belirli hücreleri sabit bir sıcaklıkta tutulur önemlidir.

1. Kayıt durdurma önce tedavinin tüm bileşenleri hazırlayın.
2. Bir kimyasal izotermal yastık 37 ° C'de hazırlamak
3. Aygıt kaydı durdurmak, tedavi edilebilir ve yerleştirmek için yemekler çıkarmak izotermal ısı panelindeki.
4. Kültürler bioluminescence kuluçka makinesi aynı yerde daha önce için gerekli ve dönüş olarak işleme.
5. Kaydı yeniden başlatın.

7. analiz

Not: Bioluminescence kuluçka makinesi tek tek görüntüleri bir dizi şeklinde veri üretir.Biz öncelikle bu görüntüleri yönetmek için Fiji¹² kullanın ve her bölge-in-ilgi (ROI) daha fazla analiz için ortalama piksel yoğunluğu verileri dışa aktarın.

1. Görüntü yığını Fiji'de açın ve yanında tıkırtı parlaklık ve karşıtlığı ayarlama "görüntü | Ayarlamak | Parlaklık/Kontrast"ve kollarındaki sinyal görüntülemek için uygun bir aralık içinde görüntülerdir kadar sürgülü Bar ayarlama.
2. Altında ROI Yöneticisi'ni kullanarak ilgi alanları seçin "Analyze | Araçlar | ROI Yöneticisi".
3. Tıklatarak seçilen alanla ilgili kötü sinyal verme "ROI Yöneticisi | Daha | Multimeasure".
4. Elde edilen verileri analiz yazılımı kopyalayın.
5. El ile veri görüntüleme, (Yani, 0,25, 0,5 veya 1 s açıklanan 15, 30 ya da 60 dk aralıklarla) zaman aralığının süresi temeli ayarlamak yerine görüntü numarası Fiji tarafından sağlanan.
   Not: Daha fazla çözümleme Şimdi, dönem tayini gibi gerçekleştirilir. Bunun için aşağıdaki denklem doğrusal olmayan regresyon çözümlemesi yapma için kullanılır:
   
   y sinyali nerede x karşılık gelen, m eğilim satır degrade zamanı c eğilim satır y kesişimi, genlik eğilim çizgisinin üstündeki dalga zirvesine yüksekliğidir, k çürümesine sabit veya sönümleme oranını (öyle ki 1 /k yarı ömrü), x kosinüs dalgasının vardiyada aşamasıdır ve¹³gerçekleşmesi tam bir döngüsü için geçen süre dönemdir. R² değeri uygun iyilik bir göstergesi olarak kullanılır.  Diğer analiz yöntemleri da mümkündür. Hücresel bioluminesence geçici, sirkadiyen olmayan değişiklikler bu süre içinde sergilemek gibi ilk 24 h edinimi analizinden, çıkarılmalıdır. Bu akut bir yanıt olarak medya değişiklik sonucudur.

Sonuçlar

Bu makalede bir timsah (bioluminescence kuluçka) kullanarak memeli hücrelerinin kollarındaki görüntüleme için bir protokol özetlenmektedir. Bu teknik görüntüleme kollarındaki sistemleri zaman için fiziksel kurulum ve ekstraselüler koşullara esneklik sağlar. Basit statik doku kültürü (şekil 1, ek Video 1) ve derin hücre kültürü (Şekil 2, ek Video 2) yöntemleri açıklanan, ama birçok diğer kurulumları bu sistemi kullanarak yansıma. Tüm veri Bölüm 7'de açıklanan yöntemleri kullanarak sayısal.

Şekil 1A PER2::LUC fibroblastlar⁴içeren 6 x 96-şey plakalar kayıt bioluminescence video gösterilmektedir. Bunlar bu deneme için gerekli değildi olarak en dıştaki wells hücreleri içermez. Hücreleri farklı sıcaklık sürüklenme, mademki 12 h 37 ° C 72 h veya converse (37 ° c 32 ° c 72 h 12 h ardından 12 h), ardından 32 ° C'de 12 h her iki sıcaklık döngüsünü geçmesi kayıt için sürekli 37 ° C'de tutulan önce geçmiştir. 60 dk Etkilenmeler her saat çekildi. Bu koşullar iki şekil 1Badımında sayısal.

Şekil 2A derin doku kültürü için bir sistemi kurulumunun şematik gösterir. Bu boru ile bağlı iki kanal slayt oluşur. Medya hücreler arasında bir enjektör pompası tarafından tahrik edilmektedir. Bu slaytları ilk gaz geçirgen kabarcık tuzak (arabellek slayt) olarak işlem görür ve ikinci ile hiçbir hücre içerir bioluminescence kaydedilir hücreleri içeren. Bu sistem video kaydı bir temsilcisi şekil 2Biçinde gösterilir. 15 dk Etkilenmeler her 15 dakikada çekildi. Burada, hücreleri standart perfüzyon koşullar altında veya kazein kinaz inhibitörü daha önce sirkadiyen süresini uzatmak ve kültürlü saat gen ifade ritimler genliğini azaltmak için gösterilmiştir PF670462 huzurunda korunur memeli hücre¹⁴. PER2::LUC ifade etkisi şekil 2C içinde (üst panel) uyuşturucu şekil 2C içinde (alt paneli), gösterilen standart statik hücre kültür koşullar altında aynı konsantrasyonu ile dönemin miktar ile tedavi hücrelere karşı gösterilen şekil 2Bolarak gösterilir. Bu net PF670462 ile tedavi PER2::LUC ifadesi altında her iki koşul kümesinden birini etkiler bu. Hücreleri periosteum koşulları Haritayı dönem yaklaşık 3 h (3 ±0.9 h) uzatma altında PF670462 ile tedavi ederken, ancak, hücreleri statik koşullarda ilaç ile tedavi daha fazla dönem için bir süre uzatma gösterir > 48 saat. Bu damped kosinüs tarafından Bölüm 7'de açıklandığı gibi uygun olabilir (ekstra toplamı, kareler F test karşı düz bir çizgi, p < 0.0001). İlginçtir, dönem perfüzyon altında uzatma büyüklüğü Bu vivo içinde¹⁴gözlenen çok daha yakın.

Şekil 1: veri örneği. (A)örnek bioluminescence ölümsüzleştirdi PER2::LUC 6 x 96 dan video görüntüsünü de bioluminescence kuluçka makinesine tabaklar. Kuyu sayısal için tamamlayıcı Video 1sarı vurgulu olarak gösterilmiştir. (B) miktar bioluminescence A. üzerinden İki setleri 3 hücre entrained Anti-PER2 protein ifade aşamalarını üretmek için birbirleriyle phasic sıcaklık döngüsü (12 saat 32 ° C'de; 12 saat 37 ° C'de) kullanarak (n = 6 ± SEM demek). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: CK1δ inhibitörleri ile perfüzyon. (A)şeması perfüzyon sistemi. (B) örnek PER2::LUC kayıt bioluminescence anlık görüntü altında perfüzyon hücreleri. Miktar bir örnek alan Sarı renkle vurgulanır. PER2::LUC perfüzyon altında ve statik koşullarda ve 3 µM CK1 inhibitörü PF670462 olmadan fibroblast biyolüminesans (C) miktar (n = 3, ± SEM demek). Bioluminescence için minimum ve maksimum değerleri normalleştirilmiş. (D) analiz dönemi (Two-way ANOVA, Holm-Sidak'ın birden fazla karşılaştırma testi).Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşen	Son orta konsantrasyonu (mikron)	Hisse senedi (mg/mL)	400 mL NS21 için
Sığır albümin	37	-	50 gr
Katalaz	0,01	-	50 mg
Glutatyon	3.2	-	20 mg
İnsülin	0,6	10	8 mL
Süperoksit Dismutaz	0.077	-	50 mg
Holo-transferrin	0.062	-	100 mg
T3 (triiodo-L-thyronine)	0.0026	2	20 ΜL
L-karnitin	12	-	40 mg
Etanolamin	16	Sıvı (1 g/ml)	20 ΜL
D (+)-galaktoz	83	-	300 mg
Putrescine	183	-	322 mg
Sodyum selenit	0.083	1	280 ΜL
Corticosterone	0.058	2	0.2 mL
Linoleik asit	3.5	100	0.2 mL
Linolenik asit	3.5	100	0.2 mL
Lipoik asit	0,2	4.7	0.2 mL
Progesteron	0,02	3.2	0,04 mL
Retinol asetat	0,2	20	0.1 mL
Retinol, tüm trans	0,3	10	0.2 mL
D, L-alfa-tokoferol	2.3	100	0. 2 mL
D, L-alfa-tokoferol asetat	2.1	100	0.2 mL

Tablo 1: NS21 hazırlık.

Ek Video 1: örnek video bioluminescence iyi plakalar üzerinden. Örnek video anlık görüntüsünü bioluminescence 6 x 96 iyi plakaları bioluminescence kuluçka ölümsüzleştirdi PER2::LUC üzerinden. Sayısal için kuyu Sarı renkle vurgulanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Video 2: PER2::LUC kayıt bioluminescence örnek video görüntüsünü hücreleri perfüzyon altında. Miktar bir örnek alan Sarı renkle vurgulanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada açıklanan memeli hücre kültürü, derin ve statik koşullarda her ikisi de iletişim kuralıdır. Ancak, timsah kolayca diğer sistemleri modellemek için adapte edilebilir. Gerçekten, o zaten aynı anda hareket, uyku ve sürekli karanlık¹⁵altında. tutulan Drosophila melanogaster periferik gen ifade ritimler izlemek için mükemmel bir platform sağlamaktadır gösterilmiştir Ayrıca uygulamaya bağlı olarak, burada açıklanan dışındaki kamera türleri uygun olabileceğini kaydetti. Biz uygun filtreleriyle, geçerli ayarı değiştirilmiş bir sürümü prensipte Floresans miktar için kullanılan olabileceğini öngörmektedir.

Özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük görüntüleme memeli dilim organotypic PER2::LUC ifadede kronolojik zamanmekansal organizasyon gibi gerekli olduğu için timsah uygun olmayabilir uygulamalar yalnızca bunlar suprachiasmatic çekirdeği, ya da diğer küçük dokusu dilimlerin.

Timsah şimdiye kadar geleneksel kayıt teknikleri tarafından kolayca ulaşılabilir olmamıştır gerçekleştirilecek birçok deney sağlar. Bioluminescence ölçümü için geçerli yöntemleri ile karşılaştırıldığında, timsah her iki tip hücre kültür çanak veya kullanılabilir slayt, dış ortam koşulları, duyarlılık ve processivity düzeyde esneklik sağlar.

Bu özellikle ilgili bir anda ne zaman standart 2D hücre kültür modelleri 3D organoid ve akış kültür sistemleri doğru uzak dur. Bu nedenle, timsah bioluminescence hangi birçok gün ve hafta çok çeşitli koşullar altında üzerinde ölçülebilir uyarlanabilir bir yöntem sağlayacaktır tahmin edilmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021
Hyclone FetalClone III Serum	GE Healthcare	SH30109.03
Neurobasal medium	Thermofisher	21103049	basal medium
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4919
Catalase	Sigma	C40
Glutathione	Sigma	G6013
Insulin	Sigma	I1882
Superoxide Dismutase	Sigma	S5395
Holo-transferrin	Calbiochem	616424
T3 (triiodo-L-thyronine	Sigma	T6397
L-Carnitine	Sigma	C7518
Ethanolamine	Sigma	E9508
D (+)-Galactose	Sigma	G0625
Putrescine	Sigma	P5780
Sodium Selenite	Sigma	S9133
Corticosterone	Sigma	C2505
Linoleic Acid	Sigma	L1012
Linolenic Acid	Sigma	L2376
Lipoic Acid	Sigma	T1395
Progesterone	Sigma	P8783
Retinol Acetate	Sigma	R7882
Retinol, all trans	Sigma	95144
D,L-alpha-Tocopherol	Sigma	95240
D,L-alpha-Tocopherol acetate	Sigma	T3001
Sodium Bicarbonate Solution	Sigma	S8761-100ML
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-038
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Galaxy 170R incubator	Eppendorf	CO17301001
Luciferin	Biosynth	L-8220
D -(+)-Glucose solution	Sigma	G8644-100ML
DMEM powder	Sigma	D5030
MOPS	Sigma	PHG0007
1 mm I.D. silicone tubing	GE Healthcare	19-4692-01
Elbow luer connector	Ibidi	10802
Male luer fittings	Ibidi	10826
Female luer fittings	Ibidi	10825
µ-slide luer I 0.6	Ibidi	80196
BD plastipak 20ml syringe	Becton Dickinson	300613
1mm I.D. ETFE tubing	GE Healthcare	18-1142-38
PF670462	Sigma	SML0795
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher	17504044
iXon Ultra EMCCD camera	Andor	iXon 888
Fiji	ImageJ	N/A
Prism 7.0	Graphpad Software	N/A
Trypan blue	Sigma	T8154
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific	39DP
Heated neutral density filter	Cairn Research	Custom item
Osmomat 030	Gonotech	Discontinued
300 mOsmol/kg calibration standard	Gonotech	30.9.0020
Measuring vessel	Gonotech	30.9.0010
Focusing cylinder	Cairn Research	Custom item
NE-1600 programmable syringe pump	Pump Systems inc.	NE-1600
Andor Solis Software	Andor	N/A