Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Özet

Negatif leke EM makromoleküllerin yapısı görselleştirme için güçlü bir tekniktir, ancak farklı boyama teknikleri bir örnek bağımlı şekilde değişen sonuçlar üretebilir. Burada birkaç negatif boyama yaklaşım zorlu sistemleri görselleştirme mücadele için ilk bir iş akışı sağlamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

Negatif leke elektron mikroskobu (EM) nispeten basit ve hızlı gözlem oluştururlar ve makromoleküllerin kompleksleri kullanımı ile leke reaktif arttırmak karşıtlık sağlar. ~ 18-20 maksimum çözünürlükte sınırlı olmasına rağmen olumsuz Å, leke EM biyolojik sorunlar çeşitli için yararlıdır ve cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) için örnekleri değerlendirmek için hızlı bir yol sağlar. Negatif leke iş akışı basit yöntemdir; örnek bir substrat adsorbe, sonra bir leke uygulanan, deyimiyle ve elektron yoğun leke parçacıklar katıştırıldığı ince bir tabaka üretmek için kurutulmuş. Ancak, bireysel örnekleri boyama koşulları değişen altında belirgin farklı şekilde davranabilir. Bu yüzey hazırlama teknikleri, reaktifler ve yıkama ve kurutma teknikleri kılavuz boyama negatif, büyük bir çeşitlilik gelişmesine neden olmuştur. Tek tek her örnek için en uygun teknik belirleme bir harf tarafından ayrı ayrı yapmanız gerekir ve bir microscopist yüksek kalitede negatif leke sonuçlar elde etmek için farklı teknikler erişiminizin olması gerekir. İki farklı yüzey hazırlama yöntemleri ve üç farklı kurutma teknikleri için detaylı protokoller sağlanır ve belirgin farklı sonuçlar yöntemine bağlı olarak gösteren bir örnek bir örnek gösterilir. Buna ek olarak, bazı ortak negatif boyama reaktifler ve Lanthanide tabanlı iki roman lekeleri hazırlanması her kullanılmasıyla ilgili tartışma ile tanımlanır.

Giriş

Çözünürlük son dikkat rağmen güçlü bir teknik ve elektron microscopists araç önemli bir bileşenini EM kalır Devrimi cryo-elektron mikroskobu¹ (cryo-EM), negatif önemli gelişmeler sonucunda leke. Negatif boyama hızlı değerlendirme örneği daha önce cryo-grid koşulları²en iyi duruma getirme için en iyi yöntem kalıyor. Yüksek karşıtlık ve negatif lekeli örnekleri kılavuz hazırlanması hızını örnek saflık, konsantrasyon, heterojen ve konformasyon esneklik³değerlendirmek için ideal yapar. Bazı örnekler daha iyi sonuçlar verir ve biyolojik olarak bilgilendirici modellerinden tekniği'nın çözünürlük ~ 18 Å çözünürlük^4,5,6, sınırlı olmak rağmen olumsuz leke rekonstrüksiyonlar dan sonuçlandı cryo-EM nedenleri⁷çeşitli daha leke içinde.

Negatif leke EM, parçacık ilgi bir EM ızgara yüzeyine adsorbe ve elektron yoğun leke bileşik amorf bir matris tarafından saran. Yüksek bir göreli karşıtlık arka plan ve faiz, parçacık çevreleyen leke⁸' den daha az elektron yoğun olan parçacık ile arasında üretilmektedir. Parçacıklar aydınlık bölgelerde düşük Elektron Saçılım güçlerini göreli olarak daha fazla elektron scatters ve daha koyu görünür yoğun çevreleyen leke nedeniyle görünür. Leke herhangi bir çatlak nüfuz ve düzensiz kontrast ayrıntı⁹üretmek gibi parçacıkların substructural özellikleri sonuç görüntüleri ayrıntılı inceleme sonucuna.

Negatif boyama işlemi üzerinde örnek parçacıklar yakalanan bir destek substrat hazırlanması ve kurutulmuş leke desteklenen tabakası ile başlar. En sık kullanılan destek substrat şekilsiz karbon, bazen polivinil (örneğin Formvar) veya nitroselüloz (örneğin Kolloidon) polimer ince bir tabaka tarafından desteklenen bir katmandır. Bu yüzeylerde veya ticari olarak satın şirket içinde aşağıda açıklanan protokoller kullanılarak hazırlanan.

Destek substrat hazırlanır sonra örnek uygulanabilir ve kapalı fazla çözüm deyimiyle. Örnekleri negatif boyama için uygun bir tampon askıya. Fosfat tampon ve bu örnek karanlık kristal precipitates çıkmasına neden olabilir yüksek tuz konsantrasyonları kullanımını önlemek en iyisidir. Ayrıca leke kaliteli⁴etkiler azalan bakiyeli ajanları, deterjanlar, sukroz, gliserol ve nükleotid yüksek konsantrasyonları da kaçınılmalıdır. Su ile EM kılavuzunun yüzey yıkama arabellek oluşturma değiştirilemez veya daha uygun bir tampon boyama önce ve sonra adsorpsiyon azaltabilir arabellek oluşumu eserler ile ilgili ve genellikle leke arka plan geliştirmek. Arabellek eserler şüphelisiniz, arabellek bileşenleri gözlenen eserler kaynağı olup olmadığını belirlemek için bir salt arabellek kılavuz leke bilgilendirici olabilir.

Örnek adsorbe ve Imha ve gerekirse yıkanmış bir boyama reaktif uygulanır. Reaktifler çeşitli etkili negatif lekeleri (Tablo 1) olmak bulundu ama leke örneğe uygun olarak seçilmelidir. Bir '' leke formlarının etrafında halo parçacık nedeniyle her iki yerinden leke molekülleri hidrofobik bölgeler tarafından protein ve itme tarafından grupları kullanılıyorsa. Bu nedenle, protein herhangi bir potansiyel dolu gruplarında protonation durumunu çalışma pH leke aynıdır böylece leke seçilmelidir. Bir olumlu boyama için ücretleri proteinin yüzeyinde karşısında katkıda bulunabilir etkisi, hangi kendi doğru¹⁰ yararlı bir yöntem bu kağıt kapsamında olmamasına rağmen. En sık kullanılan negatif boyama reaktifler uranyl asetat ve uranyl Format vardır. Bu lekelerin bir nispeten ince taneli boyutu var (4-5 Å)⁹ ve diğer lekeleri fosfo-volframatler (8-9 Å tane boyutu)^9,11, amonyum molibdat¹¹ve bazı gibi üzerinden yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlamak lanthanide tabanlı ¹²lekeleri. Uranyl asetat ve format leke ve fizyolojik pH çökelti onun eğilimi düşük pH bazı örnekler^{14 zararlı olabilir, ancak bir milisaniye zaman ölçeği13, birçok protein-protein etkileşimleri koruyarak bir sabitleştirici olarak hareket} . Onların yarar rağmen uranyl tuzları da hangi özel taşıma, depolama, gerektirebilir olan toksik ve hafif radyoaktif ve radyoaktif olmayan alternatifler aramaya bazı kullanıcılar neden bertaraf gereksinimleri olarak onlar lojistik sorunlar mevcut.

Yüzey Hazırlığı, örnek uygulama, açıklanan ve EM Izgaralar, boyama yöntemleri büyük bir çeşitlilik vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi örnek bağımlı ve yeni bir sistem mücadele zaman tespit etmek zor olabilir. Bu el yazması iki substrat hazırlık ve üç kurutma yöntemleri açıklar; yan kurutma, flicking⁵ve¹⁵kızarma hızlı. Yan kurutma açıklanan yöntemlerinin en basit olanıdır. Flicking yöntemi ve hızlı reçeteye göre sarf yöntemini uygulamak ama örnek fiksasyon önce destek film ile ilgili zaman sınırı ve iyileştirmek için bazı örnekleri⁵leke yapıların oluşumu gösterilmiştir daha zordur. Böylece bu el yazması hedefidir zorlu sistemleri negatif-leke EM tarafından görselleştirme mücadele için ilk bir iş akışı sağlamak için.

Protokol

1. EM Izgaralar hazırlanması

1. Karbon sayfası yöntemi
   1. Bir taze i ciddi Mika sayfası hazırlamak.
      1. Yavaşça Mika levha, katmanları arasında bir kaç mm bir köşesinde bir hassas şırınga iğne veya jilet yerleştirin. Aracı olarak yaklaşık olarak eşit kalınlıkta iki parça üretmek mümkün olduğunca sayfasının dikey merkezine yakın yerleştirin.
      2. Dikkatle Mika sayfası iki yarısını ayrı halledeceğiz. Bu göz veya diseksiyon mikroskop altında yapmak.
      3. Her yeni i ciddi Mika sayfaların köşeler birini kes. Vakum yayın sırasında karbon Evaporatör sayfayı çevirir olay bu kağıdın karbon kaplı yan tespit edilebilir.
   2. İ ciddi Mika sayfası/s yukarı dönük olacak şekilde taze i ciddi yüzeyli bir karbon Evaporatör odasında yerleştirin.
   3. Karbon Evaporatör set-up düzgün hazırlanmış karbon elektrot ile düzgün olduğundan emin olun.
      Not: karbon çubuklar hazırlama yöntemi karbon Evaporatör özelliklerine bağlı olarak değişir. Bir araç için bir protokol adım kadar 1.1.5 gibidir.
      1. Bir karbon çubuk ile keskin bir ipucu var ve o zaman herhangi bir kaba çapak kaldırmak için bir kağıt havlu ile Lehçe bir kalemtıraş keskinleştirmek.
      2. İnce zımpara kullanarak ikinci bir çubuk sonuna dümdüz edip tekrar pürüzsüz bir kağıt havlu ile Lehçe.
      3. İki karbon çubuklar üreticinin yönergelerine uygun Evaporatör içine koyun. İlk çubuk üzerinde keskinleşmiş sonunda ikinci çubuk basık yüzlü firma iletişim yapar olun.
   4. Karbon kalınlığı görsel olarak gauged olabilir Eğer temiz, Kuru filtre kağıdı kısmen Mika altında küçük bir parça yerleştirin. Alternatif olarak, karbon kalınlığını ölçmek için Mika yanında vakum yağ küçük bir kurulamak beyaz buzlu mikroskop slaytla yerleştirin.
   5. Üreticinin yönergelerine uygun Mika üzerine karbon Kasası.
      1. Aşağı vakum pompası ve 10^-5 mbar tamamlanana kadar bekleyin. Elektrot gerilimi V 4.0 ayarla (en çok 5 V karbon çubuk kaynağına bağlı olarak gerekli olabilir).
      2. Yaklaşık 3.5 ve birden çok kısa darbeleri çalıştırmak süresi boyunca 1-2 nm kalın evaporations karbon Mika yüzeyinde yatırmak için elektrot s.
         Not: Olarak geçerli o kırmızı kızdırma ve o zaman beyaz karbon çubuk uygulanır. Bu gözlerini zarar verebilir gibi parlak ışıklardan dik dik değil.
      3. Karbon istediğiniz kalınlıkta ulaşılıncaya kadar Mika üzerinde karbon Buharlaştırıcı'nın kalınlık ölçer veya filtre kağıdı ya da mikroskop slayt yatırılır karbon görsel gözlem tarafından ölçülen yatırmak izin. Son karbon tabaka 5-10 nm kalın olduğundan emin olun.
         1. Karbon kalınlığı görsel olarak ölçülür Eğer açık alan için vakum yağıyla kaplı mikroskop slayt buzlu cam parçası karşılaştırmak, o-ecek var olmak daha fazla karbon yatırılır gibi daha koyu.
            Not: Bu yöntemi kullanırken karbon kalınlığını belirlemek için nicel yöntem vardır.
   6. Vakum odası delik ve karbon kaplı Mika karbon Buharlaştırıcı kaldırın.
      Not: Sonraki adımlara geçmeden önce gecede yerleşmek için karbon kaplı Mika bırakılabilir
   7. Karbon film EM Izgaralar üzerine float için iki su kapsayıcı birini kullanın: bir kap su drene olabilir bu yüzden alt ve karbon tabaka tahliye Vanalı indirdi bekliyor kılavuzlar veya Izgaralar su altında ayarlanabilir bir kaldırma teçhizat yüzey, daha sonra su yüzeyinde karbon film kadar Izgaralar yükseltebilirsiniz.
   8. Böylece suyun yüzeyine yaklaşık 5 mm üst kapsayıcı ultrasaf distile su ile doldurun. Bir sayfa veya iki objektif doku herhangi bir kayan parçacıklar kaldırmak için yüzey üzerinde sürükleyerek su yüzeyini temizlemek.
   9. Temiz paslanmaz çelik kafes bir parça yerleştirin (1 inç x 2,5 inç ise uygun bir boyut) su yüzeyinin altında.
   10. Bir çift güzel cımbız kullanarak, temiz, Kuru EM Izgaralar yüz kadar (göre üreticinin açıklaması) paslanmaz çelik kafes üzerinde yatıyordu. Izgaralar birlikte mümkün olduğunca sıkı bir şekilde paketi ama örtüşmesi izin vermeyin.
   11. Bir kez Izgaralar düzenlenir, sıkıca karbon kaplı Mika sayfası cımbız veya maşa gelişmekte olan film bir çift kavrama.
   12. Mika sayfası suya tanıtmak. Bu çok sığ bir açıyla (~ 10 derece) yapılır emin olun.
       Not: Mika su yüzey kırmak ve daldırın, karbon film Mika ayırmak ve su yüzeyine float gerekir. Bu adımı hasar ve/veya kontaminasyonu önlemek için doğrudan Izgaralar üzerinde gerçekleştirilmesi gereken değil.
       1. Mika sacdan ayıran değil karbon film olasılığını en aza indirmek için bir tıraş bıçağı ile Mika levha kenarındaki Puan edinildi veya suya tanıtımı önce bir köşesinde küçük makasla kesilmiş.
   13. Karbon film müstakil, Mika sayfası kaldırmak veya kapsayıcı altına düşmesine izin.
   14. İnce uçlu cımbız kullanarak, çok hafif basınç uygulayın ve yavaş hareketleri ile karbon film Izgaralar üst üzerinde Kılavuzu.
   15. Karbon gökyüzünde yavaş yavaş su boşaltma veya kullanılan aparat türüne bağlı olarak kaldırma yüzüğü yükselterek ya Izgaralar yüzeyi ile temas halinde getir.
   16. Bazı filtre kağıt kullanarak aşırı su (şimdi ile Izgaralar karbon kaplı) paslanmaz çelik kafes aparatı ve fitil uzakta çýkýntýdan. Bu filtre kağıdı çelik kafes çok kenarına dokunmak ama Izgaralar veya karbon film ile temas gelmiyor tarafından yapılır emin olun.
   17. Izgaralar mesh kuru bir filtre kağıt parçası içeren bir kabında yerleştirin ve için tamamen kuru sağlar.
       Not: Bu en iyi gece oda sıcaklığında kurutma tarafından etkilenir, ama adım yanında duvar ilanı Izgaralar bir fırında yaklaşık 60 ° C'de hızlandırılmış olabilir
2. Float ve ceket (doğrudan karbon birikimi). Bu yöntem daha önce ayrıntılı olarak tarif edilmiştir¹⁶
   1. Tamamen üst kısmında bir Menisküs oluşturur böylece ağzına kadar temiz büyük cam kase distile su ile doldurun.
   2. Dağılın ve tamamen kuru damlacık izin, Kolloidon çözüm (nitroselüloz amil asetat) tek bir damla temiz pasteur pipet kullanarak su yüzeyine uygulanır. Kuru bir kez ince bir tabaka halinde su yüzeyi üzerinde yüzen Kolloidon görünür hale gelir.
   3. Yavaşça su yüzeyinden toz veya diğer kirlenme kaldırmak için bir kürdan kullanarak Kolloidon katmanı kaldırın.
   4. İkinci Kolloidon damlacık su uygulamak ve dağılın ve 2-3 dakika kuru sağlar.
      Not: adımları 1.2.3-1.2.4 Kolloidon bir düz ve kırışık ücretsiz levha elde edilir kadar yineleyin.
   5. İyi cımbız yer EM Izgaralar yüz aşağı (göre üreticinin açıklaması) bir çift üzerinde kayan Kolloidon sayfasını kullanarak. Izgaralar birlikte sıkıca altıgen bir dizide paketi ama örtüşmesi izin vermeyin.
      Not: bir kılavuz misplaced ya da baş aşağı yerleştirilir Kolloidon sayfayı taşımak çalışırken zarar riski yerine yerde bırakmak genellikle en iyisi.
   6. Bir kez tüm kılavuzlar yerleştirilir, yavaşça bir filtre kağıt onlar üzerinde yatıyordu. Kağıt kılcal eylem tarafından doymuş olmak için izin verir.
      Not: Herhangi bir boyut veya filtre kağıt kalınlığı tam Izgaralar kapsıyorsa uygundur.
   7. Filtre kağıdı uzanan Kolloidon filmin kaldırmak için bir kürdan kullanın.
   8. Filtre kağıdı kenarındaki kavrama ve su yüzeyinden soyma.
      Not: Kılavuzlar için kağıt yapıştırılır kalmalı.
   9. Düz kağıt ve Kolloidon suratlı bir petri kabına yerleştirin ve tamamen kurumasını bekleyin.
   10. Filtre kağıdı ile 1.1.2 detaylı olarak düzgün hazırlanmış karbon elektrot ile karbon Evaporatör TMMOB kılavuzlarda yer.
   11. Karbon sayfası yönteminde için açıklandığı gibi karbon buharlaşma yordamı izleyin
3. Aşırı ısınma ve nitroselüloz levha zarar önlemek için bakliyat arasında birkaç saniye izin vermek.
   Not: polimer katman her ne kadar bu adımı nadiren gereklidir Izgaralar boyalı, karbon edildikten sonra kaldırılabilir isterseniz. Izgaralar karbon yan taze bir filtre kağıt parçasına yerleştirin ve kağıt, ama üzerinde Izgaralar aseton birkaç damla koy. Aseton altında Izgaralar yayılmış ve dağıtılması ve polimer tabaka absorbe sağlar.

2. negatif boyama reaktifler hazırlanması

1. Uranyl asetat hazırlanması
   1. Küçük hacimli ultrasaf su kaynatın ve iyice degas için 10 dakika kaynamaya sağlar. Biraz soğumasını bekleyin ve daha sonra uranyl asetat (UA) 1-%2 (w/v) dağıtmak için kullanabilirsiniz.
      Not: bir duman dolabında ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile bu yordamı gerçekleştirin.
   2. Çözüm soğuduktan sonra 0.2 µm şırınga filtre veya filtre kağıdı ile filtre.
   3. Işık ve 4 ˚C korumalı UA saklayın. Çözüm 1 yıla kadar stabil.
2. Uranyl Format toz üzerinden hazırlanması. Bu yöntem daha ayrıntı önce içinde açıklanan⁸
   1. 20 mg uranyl Format (UF) toz 2 ml haşlanmış degassed ultrasaf su (aynı derecede içinde adım 2.1.1) tarafından karıştırma geçiyoruz.
   2. Karıştırmaya devam ederken, 5 M NaOH, çözüm 8 µL bir koyu sarı renk değiştirmek gerekir ama yok çökelti oluşturması gerektiğini ekleyin.
   3. Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre.
   4. UF leke ışıktan korunan mağaza. Herhangi bir çökelti veya renk değişikliği kahverengi leke gerekir atma görülmektedir. Çözüm sadece 1-2 gün boyunca stabildir.
3. Uranyl Format Uranyl asetat üzerinden hazırlanması
   1. %1 (w/v) UA leke 1 mL 100 µL 1 M NaOH ekleyerek çökelti.
   2. Karışımı benchtop santrifüj maksimum hızda 2 dk santrifüj kapasitesi.
   3. Herhangi bir süpernatant atın ve 100 µL % 5 (v/v) formik asitin çökelti tarafından dinç vortexing geçiyoruz.
   4. %0,5 (v/v) formik asit UF leke vermeye 900 µL ultrasaf su ile 1 ml son hacim oranında seyreltin.
   5. UF leke ışıktan korunan mağaza. Hiç acele veya kahverengi renk değişikliği gözlem yapılırsa leke atın.
4. Diğer boyama reaktifler hazırlanması
   1. Lanthanide asetat lekeleri hazırlanması
      1. Samaryum asetat (şaplak atmak), gadolinyum asetat (GdAc), Thulium asetat (TmAc) veya Erbiyum asetat (ErAc) 1-%2 (w/v) ultrasaf su geçiyoruz.
         Not: Eğer örnekleri olumlu boyama veya kılavuza zavallı bağlılık Bu lekeler kullanırken göstermek, onlar ilâ %0,5 (v/v) ile acidified formik asit. Pozitif boyama beyaz bir hale tarafından çevrili bir karanlık nesnesi olarak beliren örnek sonuçlanır. Izgarayı zavallı bağlılık beklenen kılavuzda gözlenen daha az sayıda molekülleri neden olur.
   2. Amonyum molibdat ve sodyum Phosphotungstate hazırlanması
      1. 1-%3 (w/v) ultrasaf su lekesi geçiyoruz. PH 7.0 istenirse 5 M NaOH kullanarak ayarlayın.

3. karbon örnekleri adsorbing substrat ve boyama

1. Hydrophilic işleme tarafından hazırlanması ızgara yüzeyi için örnek uygulama
   1. Yukarı bakacak şekilde bir ışıma deşarj biriminde mikroskop slayttaki kılavuz yerleştirin.
   2. Izgarayı 30 en az tedavi s 10 mA.
      Not: Kızdırma deşarj kesin yöntem kullanılan ekipmanın belirli özelliklerine bağlıdır.
   3. Alternatif olarak bu UV ışınlama 10 dakika benchtop UV lamba⁴kullanarak tarafından başarılı.
2. Yan Blot yöntemi. Bu yöntem daha ayrıntı önce içinde açıklanan⁸
   1. Kılavuz kenar negatif basınç cımbız bir çift ile kavrama ve 3-5 µL örnek destek yüzey için geçerlidir.
   2. Örnek 10 için kılavuz yüzeye absorbe izin s 1 dk. Optimize için adsorpsiyon zaman gerekir için bireysel örnekleri.
   3. Bir filtre kağıt kılavuzuna kenarına dokunmak ve kılcal sıvı çekmek eyleme izin.
   4. İsteğe bağlı: ızgara yıkayın. Ultrasaf su veya uygun geçici arabellek çözüm laboratuvar film bir sayfada yer 50 µL bırakır. Hafifçe ızgara karbon yüzeye damlasına dokunun ve kapalı ızgara yüzeyine küçük damlacık kaldırın. Bir filtre kağıt kılavuzuna kenarına dokunmak ve kılcal sıvı çekmek eyleme izin.
   5. İstediğiniz gibi birçok kez bu yıkama tekrarlayın.
   6. Laboratuvar film sayfadaki reaktif boyama yer iki 50 µL damla.
   7. Hafifçe ızgara karbon yüzeye damlasına dokunun ve kılavuzun üst yüzeyine küçük damlacık kapalı kaldırın.
      Not: Eğer leke geçirir kılavuz sonra kılavuz arkası atılmalıdır.
   8. Bir filtre kağıt kılavuzuna kenarına dokunmak ve kılcal sıvı çizmek eyleme izin. İki kez boyama bu adımı gerçekleştirin.
   9. Hava kılavuza kuru veya kuru bir akkor lamba altında izin.
3. Flicking yöntemi
   1. Kılavuz kenar negatif basınç cımbız bir çift ile kavrama ve 3-5 µL örnek destek yüzey için geçerlidir.
   2. Böylece ızgara yaklaşık 45 ° uzakta karşı karşıya açılı cımbız bir elinde tutarak, hızla 'fiske kapalı ızgara üzerine damlacık çoğunluğu için ' Bu el bilek hafifçe vur.
   3. İsteğe bağlı: bir cam Pasteur pipet kullanarak yıkama çözüm bir damla destek yüzeye uygulamak ve 'kapalı fiske 3.2.2 olduğu gibi'. Gerektiği şekilde yineleyin.
   4. Bir cam Pasteur pipet kullanarak destek yüzeye reaktif boyama bir damla uygulama ve 'kapalı fiske 3.2.2 olduğu gibi'. Numune görselleştirme için gerekli leke derinliği 1 - 3 kez bağımlı yineleyin.
      Not: Bu son leke derinlik için öznitelikleri tek etken değildir (konuya bakın).
   5. Fazla leke filtre kağıt kılavuz kenarına yırtık kenar dokunarak kaldırın.
   6. Hava kılavuza kuru veya kuru bir akkor lamba altında izin.
4. Hızlı reçeteye göre sarf yöntemi
   1. Leke, 30-70 µL çizmek (% 1'ua genellikle kullanılan) 200 µL pipet ucu hava 5 µL kadar çizmek, o zaman kadar reaktif yıkama/karıştırma (5-30 µL), eğer gerekli, başka bir küçük hava boşluğu tarafından takip ve sonra örnek 5 µL kadar çizmek çizmek için birim kadranını.
   2. Kavrama negatif basınç cımbız, böylece kılavuz araştırmacı uzak karşı karşıya yaklaşık 45 ° açılı cımbız tutan bir çift ile bir kılavuz kenar karbon kaplı EM kılavuz suratının ortasına pipet ucu tüm içeriğini dışarı atmak.
   3. Fazla leke filtre kağıt kılavuz kenarına yırtık kenar dokunarak kaldırın.
   4. Hava kılavuza kuru veya kuru bir akkor lamba altında izin.
      Not: tüm yöntemleri için bu çözüm bir kez onlar are hangi kurutulmuş kılavuz forseps çene indirebiliriz forseps, iki taraf arasında sıkışıp kaldırır gibi ızgara ulaşıncaya kadar yırtık forseps boyunca filtre kağıdın kenarına slayt için tavsiye edilir açıldı. Cımbız kılavuzunda da kuru bir duman hood kenarında yerleştirilebilir. Sabit hava akımı daha fazla üretmek yardımcı olabilir hatta boyama.

Sonuçlar

Tüm test boyama reaktifler negatif bir dereceye kadar boyama örnekleri en iyi kontrast ve keskin, en ayrıntılı parçacıkları ile verimli UF ile üretilen. TmAc ile üretilen ErAc ve TmAc belirgin kontrast ve netlik lekeli parçacıkların tarafından değerlendirilecektir olarak UA için eşdeğer kalitede negatif boyama derin gömülü örnekleri (şekil 1) göre lanthanide lekeleri için üreten daha net, daha net görüntüler ErAc. Tütün mozaik virüsü (TMV) partikülleri % 1 TmAc ~ 23 Å tekrar TMV parçacık lekeli TmAc büyük tane boyutu yüksek büyütme oranında belirgin hale gelir, ancak¹⁷ hala açıkça göz ve a güneyden tabaka satır olarak görünür Fourier dönüşümü ham görüntü. Test, diğer lanthanide lekeleri ErAc, şaplak atmak veya GdAc, bu özellik çözmeniz mümkün değildi. Sınıf ortalamaları TMV parçacıkları nerede Helisel tekrar görünür örtüşen kesimleri ayıklayarak üretildi. Ayıklanan kesimleri sonra uyumlu ve düzenli özelliği (Şekil 2) daha iyi görmek için RELION¹⁸ kullanarak gizli.

C-protein kas türetilmiş gibi bazı örnekleri boyama, yöntem için özellikle duyarlıdır. C-protein, IG ve Fn benzeri etki alanları esnek bir dizi oluşur, negatif-leke EM boyama kullanılan (şekil 3) yöntemi üzerinde bağımlı tarafından önemli ölçüde farklı görüntüleri üretir. Yan-Blot yöntemi kullanarak çöktüğünde ne zaman hızlı yıkama veya yöntemleri flicking tarafından lekeli, C proteinli bir dize üstündeki benzer etki alanları bir dizi olarak görülmektedir, ancak yüzük benzeri yapılar gözlenir.

Reaktif	Konsantrasyon	pH	Türü
Amonyum molibdat	1 - %2	5-7	Anyonik
Erbiyum asetat (ErAc)	1-%2	6	Katyonik
Gadolinyum asetat (GdAc)	1-%2	6	Katyonik
Methylamine tungstate	% 2	6-7	Anyonik
Samaryum asetat (şaplak atmak)	% 1	6	Katyonik
Sodyum silicotungstate	1 – % 5	5-8	Anyonik
Sodyum phosphotungstate	1 -3%	5-8	Anyonik
Thulium asetat (TmAc)	1-%2	6	Katyonik
Uranyl asetat (UA)	1-% 3	3-4	Katyonik
Uranyl Format (UF)	0.75-%1	3-4	Katyonik

Tablo 1: Bazı ortak negatif boyama reaktifler.

Şekil 1: örnek Filmler Tütün mozaik virüsü ile çeşitli olumsuz leke reaktifler lekeli (A) % 1 UF (B) % 2.5 TmAc (C) % 2.5 ErAc. (D) % 1'ua (E) % 2.5 GdAc ve (F) % 2.5 şaplak atmak. Ölçek çubukları vardır 100 nm. Birden çok alanı REPLICATE görüntüsü ile birden fazla çoğaltır temsilcisi görüntülerden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Tütün mozaik virüsü Thulium asetat ile boyama (A) yüksek büyütme TMV bir test üzerinden alanının yüzde 1'lekeli TmAc. Ölçek çubuğu olduğunu 20 nm. Ayıklanan TMV kesimleri ortalama sınıf (B) . (C) Fourier dönüşümü paneli A gösteren katman çizgi yansımaları ~ 23 görüntünün Å. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: kurutma yöntemi C-protein biçimi üzerinde etkileri. (A) C-protein yan blot yöntemi ve (B) flicking yöntemi kullanarak UA ile lekeli. Üst panel ölçek çubuğu olduğunu 50 nm, alt paneli ölçek çubuğu olduğunu 20 nm. Birden çok alanı REPLICATE görüntüsü ile birden fazla çoğaltır temsilcisi görüntülerden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu el yazması için elektron mikroskobu boyama reaktifler, iki roman lanthanide reaktifler (TmAc ve ErAc) dahil olmak üzere çeşitli kullanarak örnekleri negatif boyama için birden çok yöntem açıklanır. Negatif boyama işlemi adımların çoğu, leke tutmayan, varsa gerekli yıkama ve blotting tekniği seçimi de dahil olmak üzere tek tek örnekler için optimize edilmiş olması gerekir. Bu el yazması böylece microscopists negatif boyama zorlu sistemlerinin mücadele için kendi iş akışı geliştirmek için bir temel sağlar.

Leke son derece bağımlı örnek seçimdir. Düşük pH için özellikle hassas örnekleri UA ve/veya UF, bu lekeleri¹⁹sabitleştirici özellikleri rağmen bozulmuş. Bu gibi durumlarda, lanthanide bazlı lekeleri rağmen hazırlık genel pH olumlu boyama önlemeye yardımcı olmak için örnek protein isoelectric noktasını altına tutulmalıdır TmAc veya ErAc daha uygun olabilir. Bu gerekirse Asetik asit ile leke acidifying tarafından gerçekleştirilebilir. Özellikle düşük pH duyarlı örnekler için Anyonik tungstate veya molibdat lekeleri daha etkili olabilir. Gibi her ne kadar bu lekeler eserler bazı durumlarda oluşumu teşvik tespit edilmiştir, lipoprotein rouleaux oluşumu²⁰örnekler. Yine, leke, pH, bu kez olumlu boyama önlemek için örnek, isoelectric noktası yukarıda ayarlanması gerekebilir.

Yıkama boyama önce örnek numune tutulan arabellek yüksek tuz veya fosfat bileşeni varsa gerekli olabilir. Birçok durumda, çamaşır ultrasaf su ile yapılabilir ama aşağılamak veya su yalnız maruz kaldığında yapısal değişiklikleri meydana, daha duyarlı örnekleri için çamaşır düşük iyonik gücü⁸uçucu bir arabellek ile yapılması gerekebilir. Dikkatle kontrollü şartlar altında bile, çamaşır karbon yüzey²¹bazı yapısal yeniden neden olabilir.

Hangi kurutma ve boyama örnek adsorpsiyon açısından bir kılavuz hazırlanmıştır yöntemi ne görülmektedir de önemli ölçüde etkileyebilir. En uygun yöntemi olduğunu böylece, yeniden, son derece örnek bağımlı. C-protein, örneğin, yan-leke boyama takip küresel bir yüzük benzeri yapı olarak gözlenen, ama bu bir obje boyama işleminin Izgaralar flicking yöntemi (ya da hızlı reçeteye göre sarf yöntemi tarafından) hazırlanan ortaya gibi görünüyor (şekil 3 ). Fiske ve hızlı reçeteye göre sarf yöntemi içinde karbon ile etkileşim için örnek vardır zaman destek fiksasyon önce simge durumuna küçültülmüş¹⁵yüzeydir. Örnek ayrıca daha az önce fiksasyon kurutma üzerine basık Menisküs kuvvetlerden deneyimleri. Bu üzerine uzun süreli emme zamanı karbon film veya kılcal eylem yoluyla oluşabilir numune yapısal değişiklikleri en aza indirgemek anlamına gelir. Hızlı reçeteye göre sarf yöntemini örneklerin analiz zaman karar vermek için de kullanılabilir. Örnek bir ligand ya da bir pipet ucu kümesi içinde katkı ile karışık ızgara yüzeyi fiksasyon milisaniye içinde önce ne kadar süre uygulama bir kılavuza veya sadece bir an önce dönem.

Belirli bir örnek en iyi görüntüleri yeniden örnek bağımlı²sağlamak için gerekli leke derinliği. Leke çok sığ ise, moleküller elektron ışını tarafından zarar görebilir ancak leke çok kalın ise yapısal özellikleri kaybolabilir. Leke derinlik hydrophilicity ızgara yüzeyi, Rastgelelik karbon tabaka, leke leke ile temas halinde ızgarayı kurutma, kurutma ölçüde ve zaman önce o süreyi kılavuza ta uygulanan tutar gibi çoklu faktörlerden etkilenir Kes için kılavuza tamamen kuru. Bir kılavuz hiç leke eşit dağılımı bütünüyle arasında olacak ve bu nedenle ızgarayı görüntüleme için uygun alanları dikkatle seçilmesi gerekir. Nitekim, Izgaralar kez zaman bile aynı gün aynı koşullarda hazırlanan kalite değişir. Görüntüleme Burgess tarafından sağlanır varyasyon leke derinlemesine molekülleri ve uygun leke derinlik görünümünü etkilemesi iyi bir örnek ve ark⁵.

Negatif boyama çok hızlı, çok yönlü ve basit bir yöntem olmasına rağmen tüm biyolojik örnekler görselleştirme bu yöntem tarafından mükellef bulunmaktadır. Kırılgan derlemeler daraltmak veya boyama veya EM kılavuz²²tarihinde kurutma adsorpsiyon sökmeye. Negatif boyama da molekülleri düzleştirme için yol ve molekülleri karbon destek film⁷tercih edilen yönelimleri teşvik.

Olumsuz örneklerin kendi başına ve aynı zamanda cryo-EM analiz öncesi değerlendirme için değerli bir araç olmuş ama birçok örnek işlemi sırasında karşılaştığı fiziksel güçlerinin kötü anlaşılır. Bu nedenle, kullanmak için en iyi yaklaşım olduğunu son derece bağımlı örnek ve deneme yanılma yerine sabit bir iletişim kuralı aşağıdaki öğretti tarafından belirlenmelidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh copper EM grids	Sigma-Aldrich	G4776-1VL	Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate	Sigma-Aldrich	277908
Carbon evaporator	Ted Pella Inc.	9620	Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate	Sigma-Aldrich	9817
Dumont #5 negative pressure tweezers	World Precision Instruments	501202	Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate	Sigma-Aldrich	325570
Gadolinium Acetate	Sigma-Aldrich	325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm.	AGAR Scientific	AGG250-1
Microscope slides, white frosted	Fisher Scientific	12607976	Or equivalent
Parafilm	Fisher Scientific	10018130	Or equivalent
Pasteur pipette (glass)	Fisher Scientific	10343663	Or equivalent
Razor blade	Fisher Scientific	11904325	Or equivalent
Sandpaper	Hardware store		Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate	Sigma-Aldrich	325872
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1.06462
Sodium Phosphotungstate	Sigma-Aldrich	P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size).	AGAR Scientific	AGG252
Thulium Acetate	Sigma-Aldrich	367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods	Ted Pella Inc.	57-10	Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22450
Vacuum grease	Fisher Scientific	12719406	Or equivalent
Whatman #1 Filter paper.	Fisher Scientific	1001 090	Or equivalent
Whatman #40 filter paper	Fisher Scientific	10674122	Or equivalent