Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Özet

Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.

Özet

Uzun bir tanımlanmış okuma çerçeve olmadan 200'den fazla nükleotit dizilerinin olan RNA (lncRNA), kodlamayan düzenleyici kodlamayan RNA'ın ailesine ait. Her ne kadar biyolojik işlevleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır, bu lncRNAs sayısı giderek artmıştır ve bu şimdi insanlar 10.000'den fazla tür transkript olabilir tahmin edilmektedir. Bunlardan bazıları transkripsiyon düzeyi, fakat aynı zamanda RNA co - ve çoğu olgunlaşma farklı adımları gerçekleşecek önemli yasal yollar gen ifadesinin yer olduğu bilinmektedir. İkinci durumda, tespit edilmesi lncRNA tarafından hedef RNA'ların var. Bu neden kimlik RNA'ların doğrudan ilişkili olan ya da dolaylı olarak bir lncRNA ilgi ile sağlayan bir yöntem geliştirmek yararlıdır nedenidir.

Bir lncRNA ile birlikte, ilişkili Kromatin dizileri izolasyon sağlar daha önce yayımlanmış iletişim kuralları tarafından ilham kaynağı oldu, bu iletişim kuralını ilişkili RNA'ların yalıtım izin vermek için uyarlanmıştır. Biz iki adım bu protokolünün etkinliği için kritik belirlenir. İlk belirli DNA Anti-anlamda Oligonükleotid probları faiz lncRNA için melezlemek mümkün tasarımıdır. Bu amaçla, lncRNA ikincil yapı Biyoinformatik tarafından tahmin edilmiştir ve anti-anlamda Oligonükleotid probları iç baz eşleşmesi düşük bir olasılık görüntülemek bölgeler için güçlü bir yakınlık ile tasarlanmıştır. İkinci önemli adım yordam doku veya tüm moleküler ortakları arasında ağ korumak için olan kültürlü hücreleri sabitleştirici koşulları kullanır. Yüksek işlem hacmi RNA sıralama ile birleştiğinde, bu RNA açılan iletişim kuralı bir lncRNA ilgi tüm RNA interactome sağlayabilir.

Giriş

Burada açıklanan yöntemi genel amacı uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA moleküler ortakları belirlemektir. LncRNA tanımlanmış okuma çerçeve olmadan 200'den fazla nükleotit dizilerinin karşılık gelir. Bazıları gen ifade düzenlemesi, transkripsiyon düzeyinde, hem de RNA co - ve çoğu olgunlaşma farklı adımlar dahil olmak için göstermiştir. İkinci durumda, moleküler lncRNA, belirlenecek olan RNA'ların ortağız. RNA'ların doğrudan ilişkili olan ya da dolaylı olarak bir lncRNA ilgi ile kimlik etkinleştirme yöntemi daha sonra geliştirmek için gerekli olacaktır.

Kromatin yalıtım RNA arıtma (cıvıltı)^1,2 ve yakalama hibridizasyon analizi, RNA hedefler (grafik)^3,4, tarafından izin yüksek üretilen iş keşfi olarak daha önce yayınlanan yöntemleri, RNA bağlı proteinler ve genomik bağlama sitelerin belirli bir lncRNA. Bu iki yöntem, faiz lncRNA ilk biotinylated tamamlayıcı oligonucleotides melezleşmiştir ve karmaşık sonra streptavidin boncuklar kullanılarak izole. Bu iki teknik arasındaki temel fark lncRNAs hedef probları için tasarım ilgilidir. Cıvıltı, strateji RNA balık tarafından lncRNA tüm uzunluğu döşemek için kısa Tamamlayıcı DNA Oligonükleotid probları bir havuz tasarımı oluşuyordu, ilham. Buna karşılık, GRAFİKTE, site hibridizasyon için mevcut soruşturma için lncRNAs bir RNase H eşleme tahlil yazarlar uyarlanmış.

Burada önerilen tasarım Anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid iç düşük bir olasılık görüntülemek bölgeler için güçlü bir yakınlık ile seçmek için lncRNA ikincil yapı⁵ / Biyoinformatik modelleme probları probları kullanır yordamı baz çifti. Bu yordam döşeme Oligonükleotid probları² takımlık üzerinde dayalı olanlar daha ucuz ve daha az zaman alıcı RNAse H duyarlılık⁴üzerinde dayalı olanlar daha olmanın avantajı vardır.

Kanıt lncRNAs⁶tarafından çoğu gen düzenlemesi için büyüyen bir vücut gibi bir lncRNA hedefler RNA'ların yakalama etkinleştirme bir yaklaşım geliştirmek çok yararlıdır. Ayrıca, çoğu uygulama için kullanılabilir olması için yaklaşım hem kültürlü hücre ve doku özleri optimize edildi.

Protokol

Tüm yordamları Avrupa Ekonomik Topluluğu ile sıkı uygun bakım ve laboratuvar hayvanlarının (86/609/EEC ve 2010/63/UE) ve bir lisans altında kullanımı için verilen ö. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, yetkilendirme No 13-002) yapıldı.

1. sonda tasarım

1. Faiz lncRNA birincil dizisini kullanarak, "RNAstructure Web sunucusu"⁵ikincil yapısı oluşturmak.
   Not: Bu sitede farklı algoritmaları kullanılabilir. Sonda tasarımlar için en iyi sonuçları vermek üç tahmin araçları: "Kat" (en düşük fiyat serbest enerji yapısı), "MaxExpect" (son derece olası baz çifti) ve "Probnot" (muhtemel baz çifti pseudoknots de dahil olmak üzere). Bu üç analizleri gerçekleştirilen ve karşılaştırıldığında. Viyana RNA websuite⁷gibi diğer web sunucuları da kullanılabilir.
   1. İç baz eşleşmesi düşük bir olasılık görüntüleyen ve anti-anlamda Oligonükleotid probları bu bölgeler için güçlü bir ilgi ile 25 üslerinin tasarım bölgeleri seçin.
      Not: Bu sondalar GC içeriğini 40 ile % 60 arasında oluşan. Bir hizalama arama aracı (patlama) kullanarak, seçili Anti-anlamda Oligonükleotid probları seçilen hücre sisteminde ifade diğer RNA nükleotit dizilerinde tanıyor musunuz emin olun.
2. Ayrıca ben de benzeşme faiz lncRNA için ne de diğer RNA serileri için faiz genom görüntüleyen bir non-spesifik DNA Oligonükleotid sonda 25 üslerinin tasarımı.
3. Probları biotin ile 3'-sonunda sipariş.
   Not: steric engel azaltmak için Oligonükleotid ve Biotin arasındaki mesafe triethyleneglycerol rondela ile arttırılması gerekir. Bir en iyi sonuç için ve açılan sonuçlarını özgüllük değerlendirmek için bu tasarım için 3 farklı Anti-anlamda Oligonükleotid probları tavsiye edilir ve daha sonra onların verimliliği deneysel olarak karşılaştırmak için.

2. cross-linking

1. Kültürlü hücre cross-linking
   1. Kültür GH4C1 sommatolactotroph hipofiz hücreleri Ham'ın F10 orta % 15 at serum ve % 2 fetal buzağı serum ile desteklenmiştir. İzdiham 78.5 cm² kültür tabak içinde kadar hücreleri büyümek. Bu yaklaşık 1 x 10⁷ hücrelere karşılık gelir.
   2. Hücre kültür orta Konfluent GH4C1 78.5 cm² kültür tabağı kaldırmak, durulama 1 fosfat orta hacmi x ile serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış
   3. PBS (10 mL) 78.5 cm² yemekler için; %1 paraformaldehyde çözeltilerine ile hücreleri tamir Bu çözüm %4 paraformaldehyde hisse senedi eriyik--dan taze hazırlanmalıdır. Ajitasyon (RT) oda sıcaklığında 10 dakika altında çapraz.
      Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) toksik ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.
   4. Glisin 1.25 M (10 mL paraformaldehyde çözeltisi başına 1 mL); 1/10 hacmi ekleyerek paraformaldehyde eylem gidermek 5 dk RT. az tahrik
   5. Medya tarafından aspirasyon ve durulama iki (5 dk) 1 X PBS orta hacmi ile atmak.
   6. PBS 1'e karşılık gelen bir birim eklemek/medya, toplamak hücreleri hücre kazıyıcı ve sonra aktarmak için bir santrifüj tüpü hacmi 10.
   7. 5 min için 4 ° C'de 510 g de spin.
   8. Mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın.
   9. Süresiz olarak-80 ° C'de gerektiği gibi granül depolamak
2. Doku Cross-linking
   1. 5 mg taze elde edilen fare hipofiz dokusunun PBS (yaklaşık 10 x cilt dokusunun) içinde seyreltilmiş %1 paraformaldehyde bir çözüm koymak, RT, 10 min için kışkırtmak
   2. Paraformaldehyde eylemi bir 1,25 M glisin çözüm (10 mL paraformaldehyde çözeltisi başına 1 mL) ekleyerek gidermek ve 5 dk RT. az tahrik
   3. Medya tarafından aspirasyon atın ve PBS (yaklaşık 10 doku hacmi x) ile iki kez durulayın. Mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın.
   4. Çapraz bağlı doku-80 ° C'de süresiz olarak depolamak

3. hücre veya doku lizis

1. Lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 200 U/mL RNAse inhibitörü çözeltisi ve proteaz inhibitörü 5 µL/mL bir kokteyl ile tamamlanan % 1 SDS) hazırlayın.
2. Önceki çözdürme olmadan lysed örneklerini almak için hücre topakları veya bu arabelleği (yaklaşık 1 mL başına hücre Pelet veya doku 100 mg) ile çapraz bağlı doku yeniden askıya. 1 x 10⁷ hücrelerinden elde edilen bir hücre Pelet artış yaklaşık 20 mg protein içeren bir lysed örnek ver.
   Not: kullanılan doku bağlı olarak, bir adım mekanik bozulma eklenmesi gerekir. Bu durumda, bu ek adımı sırasında örneklerin Isıtma önlemek önemlidir.

4. sonication

1. Sonication koşullardan en iyi duruma getirme
   1. Program 30 s ON 2-5 serisi ile sonicator ve 30 s OFF.
   2. Seyreltilmiş lysed örnekleri (seyreltme faktörü ½ veya protein yaklaşık 10 veya 5 mg için karşılık gelen ¼) sonication koşullara en iyi duruma getirmek için sınamaları gerçekleştirin. Yer lysed 4 ° C su banyosu örneklerinde seyreltilmiş ve sonication seri başlatmak.
   3. RNA'ların bir RNA arıtma kiti ile veya bir RNA izolasyon reaktif (örneğin, Trizol) ile arındırmak.
   4. % 1'özel Jel Elektroforez TBE tampon üzerinde saf RNA bütünlük yük, RNA parçaları uzunluğunu denetleyin. Bu uzunluk 200 ve 800 bp mesafe.
      Not: Anti-anlamda Oligonükleotid probları verimliliği RNA parça boyutuna bağlı olarak değişebilir. O zaman sonication farklı koşullar altında probları verimliliğini kontrol etmek için tavsiye edilir.
2. Lysed örnekleri sonication
   1. 4 ° c (-den sonra adım 3.2 elde edilen) proteinlerin 20 mg karşılık gelen yer lysed örnekleri banyo su ve 4.1 adımda en iyi duruma getirilmiş gibi sonication seri başlatmak.
   2. Hemen sonication, santrifüj, 12.000 g 4 ° C'de 5 dakika sonra Supernatants yeni santrifüj tüpler aktarın.
      Not: homojenliği emin olmak için çoğaltma supernatants getirilebilir havuza alınmış ve bu adımda yeniden dağıtılabilir.

5. RNA aşağı açılır

1. Gün 1 – hibridizasyon adım
   1. Hibridizasyon arabelleği (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, % 1 SDS, Formamide eklendi altercations % 15) 2 cilt eklemek sonication adımdan sonra toplanan supernatants için. Girdap.
   2. Bir santrifüj tüpü (giriş örnekleri) her örneğinin 20 µL aktarın ve -20 ° C'de depolayın
   3. 100 pmol biotinylated Oligonükleotid problar (özel ya da non-spesifik; bkz. Tablo 1), her örnek için ekleyin. 4-6 h altında orta ajitasyon RT. tüp rotator üzerinde kuluçkaya
   4. Manyetik streptavidin boncuk 50 µL 200 U/mL RNAse inhibitörü çözeltisi ve proteaz inhibitörü 5 µL/mL bir kokteyl ile desteklenmiş ekleyin.
   5. Gecede altında orta ajitasyon RT. tüp rotator üzerinde kuluçkaya
2. 2. gün-RNA izolasyon adım
   1. Hücre lysate boncuk ayrı süpernatant atmak ve boncuk 900 µL yıkama arabelleği ile yıkamak için manyetik desteğini kullanın (SDS % 0.5, SSC 2 x). Tekrar 5 kere 5 dk ajitasyon RT. rotator üzerinde serpiştirilmiş
   2. Son yıkama sonra son bir kez dikkatle boşaltmak ve Proteinease K arabelleği (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, % 0.5 SDS) 95 µL ekleyin ve 5 µL İndinavir-k (20 mg/mL) örnekleri.
   3. Buz üzerinde giriş örnekleri (20 μL) çözülme ve Proteinease K arabelleği 75 µL ve 5 µL İndinavir-k (20 mg/mL) ekleyin.
   4. Tüm örnekleri ile İndinavir K 50 ° c sonra 10 min 95 ° C'de 45 dk için kuluçkaya
   5. Örnek 3 dakika buzda boncuk RNA'ların manyetik desteğiyle ayıran önce sakin ol. Süpernatant tutmak ve boncuk atın.
   6. RNA'ların DNA sindirim adımı içermelidir bir RNA arıtma kiti ile arındırmak. RNA'ların-80 ° C'de depolayın
   7. Ters transkripsiyon qPCR (RT-qPCR) belirli primerler (Tablo 1) kullanılarak qPCR tarafından izlenen bir RT kit kullanarak gerçekleştirin.
   8. Her belirli Neat1 sondalar (Tablo 1) ile elde edilen iki RNA havuzlarına karşılık gelen iki DNA kitaplığı oluşturun. Sıralama yeni nesil sıralama sistem üzerinde gerçekleştir.

Sonuçlar

Birkaç son çalışmalar göstermiştir lncRNAs hemen hemen her önemli biyolojik süreç içinde önemli bir rol oynamak ve bu rolün hem transkripsiyon ve çoğu düzeylerinde meydana gelen gen ifadesinin denetimi yoluyla elde edilir Bu ikinci durumda RNA'ların lncRNAs⁶hedefi olabilir gösterilen.

LncRNA nükleer zenginleştirilmiş bol transkript 1 (Neat1) içinde farklı neuropathologies da demans, amyotrofik lateral skleroz veya epilepsi^8,9,10karıştığı ve aynı zamanda misregulated farklı kanser^11,12'.

Bu lncRNA da bilinir yapısal bileşeni belirli nükleer organları, paraspeckles olarak ve çoğu sirkadiyen gen ifade¹³yönetmelikte dahil olmak. Her hücre çekirdeğinde bulunan ve sadece birkaç RNA bağlayıcı protein (RBP)¹⁴, ama aynı zamanda etrafında onların oluşumu için gerekli olan Neat1, etrafında oluşan Paraspeckles gerçekten de^{15 çekirdeği içinde RNA hedefler korumak mümkün olduğu bilinmektedir} . Paraspeckles oluşumu farklı bileşenleri Derneği elde edilir. Bu oluşumun sirkadiyen bir ritmik desen RNA hedef¹³ritmik bir nükleer tutma sürüş görüntülemek için gösterildi. RNA hedeflerini paraspeckles göre nükleer tutma RBP için bağlama aracılığıyla veya doğrudan RNA/RNA Derneği aracılığıyla ortaya çıkabilir, ama belirlenecek RNA'ların paraspeckles tarafından hedeflenen ölçüde vardı. Hedef RNA tanımlamak için doğrudan veya dolaylı olarak Neat1 tarafından yalıtım ve kültürlü hücreler de ( şekil 1 bir grafik için bkz: doku örnekleri olduğu gibi bütün Neat1 RNA hedefleri tanımlaması sağlayan bir RNA açılan protokol tasarlanmıştır sunum tekniği).

Protokol bir başka bir lncRNA metastaz ilişkili akciğer adenokarsinom transkript 1 (Malat1) RNA hedefleri tanımlaması da başarıyla uygulandı. Malat1 ile birlikte birkaç RNA faktörler Uçbirleştirme nükleer speckles bulunan son derece korunmuş ve ifade lncRNA var. Malat1 birkaç yeni doğmakta olan pre-mRNA^16,17ve yapıştırma yönetmelikte yer olduğu bilinmektedir.

Özel (SO) ve non-spesifik Oligonükleotid (NSO) sondalar burada açıklanan soruşturma tasarım stratejisini kullanarak oluşturulan. Bu strateji iç Bankası eşleştirme düşük bir olasılık olarak tahmin lncRNA ikincil yapı tarafından görüntülemek bölgeleri seçimi ve bu bölgeler için güçlü bir ilgi ile belirli probları tasarım dayanmaktadır. Bu Biyoinformatik tahminler, tahmin edilen ikincil yapı, Neat1 bir dizi resmi temsilcisi bir sonucu olarak (nukleotid 1.480-2000) ile birlikte iki probları Şekil 2' de verilen bu yüzden tasarlanmış konumunu.

Tasarlanmış probları kültürlü GH4C1 hücreleri ve hipofiz doku özleri (Tablo 1) için fare Neat1 için Neat1 veya Malat1 sıçan için yönetildi. Neat1 veya Malat1 göreli zenginleştirme için belirsiz ve belirli probları giriş örnekleri göre hesaplanır. Şekil 3 için açılan Neat1 sıçan GH4C1 hipofiz hücre kültürünü (şekil 3A) içinde belirli probları verimliliğini gösterir ve fare hipofiz doku (şekil 3B) ayıklar. Sonda tasarım Protokolü (böylece Malat1 için probları yönetmen) belirli Oligonükleotid oluşturmak için kullanırken, bir süre başka yeterince verimli değildi ve verimli sonda elde edildi (şekil 4A) atılır.

Sonra bir RNA RT-qPCR deneyleri, bazı RNA'ların belirli astar (Tablo 1) ile değerlendirildi ve ardından açılan yordamı GH4C1 özler Neat1 veya Malat1 ile ilişkili olduğu gösterildi. GH4C1 hücre özler Neat1 ile ilişkili RNA'ların da hipofiz doku özler Neat1 ile ilişkilendirilmesi gösterilmiştir. Gerçekten de, Neat1 RNA aşağı açılır sonra Malat1 Neat1 tarafından GH4C1 hücre kültürünü ve hipofiz fare doku özleri (şekil 5A) hedef tespit edildi. Malat1 RNA aşağı açılır (şekil 4B) GH4C1 hücrelerdeki belirli bir sonda ile yapılır sonra karşılıklı, Neat1 önemli ölçüde zenginleştirilmiş. İki lncRNAs arasında yakın bir ilişki vurgulayarak, bu sonuçlar Neat1 ve varyasyonları Neat1 RNA ifade¹⁸'^, görüntülemek Malat1 nakavt fareler tarafından önerilen Malat1 potansiyel co-regulatory rolü ile tutarlı ¹⁹. iki ana hipofiz hormonları, büyüme hormonu (Gh) (şekil 5B) ve prolaktin (Prl) (şekil 5C) Tutanaklar önemli ölçüde Neat1 RNA aşağı açılır GH4C1 hücreleri ve hipofiz belirli probları ile zenginleştirilmiş özler, olası bir düzenleme Neat1 tarafından iki hormon, düşündüren. Kullanılan iki belirli problar karşılaştırırken, onların verimliliği kabul RNA hedef bağlı olarak (ve şekil 5C5B anlamaya) değişebilir ortaya çıktı. Bu sonuçlar bu sadece açılan lncRNA zenginlik içinde en iyi verimlilik, aynı zamanda en iyi verimlilik RNA hedeflerini zenginleştirme görüntüleme seçmek için birkaç belirli probları tasarlama gerekliliği vurgulayın.

RNA açılan yöntemi Ayrıca faiz¹³lncRNA RNA hedefleri kapsamlı listesini elde etmek için RNA yüksek üretilen iş sıralama tarafından izlenebilir. RNA-seq analizi yukarıda açıklanan iki belirli problar kullanarak Neat1 RNA açılan gerçekleştirmesinden sonra GH4C1 hipofiz hücreleri üzerinde. RNA açılan NSO ile inşaat kütüphanelerin izin için yeterli olduğu sonra RNA düzeyini yeniden elde etmek, bir negatif kontrol bir NSO kullanarak da RNA-seq analize tabi unutulmamalıdır. Bu durum önceki deneyim¹³' te böyle değildi. Belirli sonda kullanımı analiz sonra zanaat/kol düğmeleri kullanarak oluşturulan kitaplıkları boru hattı²⁰ ve yalnızca transkript kilobaz başına parçasının değerlerle milyon eşlenen okur (FPKM) 1 dikkate alınmıştır daha yüksek. Listeleri elde Neat1 için yönettiği iki belirli problar ile (Tablo 1) sonuçları özgüllük değerlendirmek için çaprazdı. 4,268 gen GH4C1 hücreleri¹³' te ifade tutanakları % 28 temsil paraspeckles ile ilişkili bulunmuştur. QPCR analizi (Şekil 5A-C) kullanılarak elde edilen sonuçlar ile tutarlı, Gh, Prl ve Malat1 transkript Neat1 ile ilişkili bulunmuştur. RNA açılan yöntemi bu nedenle lncRNAs ve RNA hedeflerine arasındaki etkileşimi keşfetmek için verimli bir araç olarak kanıtlanmıştır.

Şekil 1: RNA grafik gösterimini çekin prosedürü. İlk gününde, hücreleri veya doku paraformaldehyde ile çapraz bağlı, lysed ve biotinylated belirli probları ekleyerek gerçekleştirilen hibridizasyon adım önce sonicated. Manyetik streptavidin boncuk sonra belirli malzeme hücre lysate geri kalanından ayırmak için eklenmiştir. İkinci gün, boncuk bir mıknatıs tarafından izole ve birkaç kez yıkanmış. Bir de-çapraz adım saflaştırılmış ve RT-qPCR veya RNA-seq analiz için kullanılan RNA'lar kurtarılması izin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: ikincil yapı olarak tahmin Biyoinformatik kaynak (RNAstructure webserver; en düşük serbest enerji yapısı) tarafından Neat1 dizisinin (nükleotit 1.480-2000). Yapısı baz eşleşmesi olasılık derecesine göre renklidir. İki oligonucleotides problar (SO1 ve SO2) kırmızı Neat1 RNA yapısı konumlandırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Neat1 zenginleştirme giriş karşı doğrulanmasını qPCR. Neat1 RNA sonra giriş karşı Neat1 zenginleştirme qPCR doğrulama iki farklı belirli problar (SO1-rn ve SO2-rn GH4C1 hücreleri ve SO1-mm ve SO2-mm hipofiz doku için) bir belirsiz karşılaştırıldığında tarafından aşağı çekin bir (GH4C1 hücreler için NSO-rn ve NSO-mm için Hipofiz bez) GH4C1 fare hücreleri(a)ve fare hipofiz doku (B) ayıklar. 3-10 deneylerde elde edilen ortalama ± SEM sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: aşağı çekin Malat1 RNA sonra giriş karşı Malat1 ve Neat1 zenginleştirme doğrulanmasını qPCR. Malat1 qPCR doğrulama(a)ve Neat1 (B) zenginleştirme giriş karşı Malat1 RNA sonra iki farklı belirli problar (SO3-rn ve SO4-rn) spesifik olmayan karşılaştırıldığında tarafından aşağı çekin bir (NSO-rn) GH4C1 fare hücrelerinde. 3 deneylerde elde edilen ortalama ± SEM sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Malat1, Gh, Prl zenginleştirme Neat1 RNA aşağı çekin sonra giriş karşı doğrulanmasını qPCR. Malat1 qPCR doğrulama(a)aşağı çekin non-spesifik bir GH4C1 fare hücrelerinde karşılaştırıldığında farklı belirli probları kullanarak Gh (B), Neat1 RNA sonra giriş karşı Prl (C) zenginleştirme ve fare hipofiz doku ayıklar. 3-8 deneylerde elde edilen ortalama ± SEM sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

SONDA ADLARI	Dizileri
NSO-Rn	TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-Rn	CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-Rn	GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-Rn	AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-Rn	AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mm	GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mm	GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mm	CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
qPCR ASTAR:
Rattus norvegicus
Neat1	AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
	TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1	GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
	TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
GH1	CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
	GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1	TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
	CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
GH1	CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
	TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

Tablo 1: DNA Oligonükleotid probları ve qPCR astar dizileri

Tartışmalar

Büyük bir alan araştırma uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs) sayısı ve çeşitliliği temsil ve rolleri hala keşfedilmeyi çoğu. Çoğu bu lncRNAs nükleer bir Yerelleştirme ve bunlar arasında bazı transkripsiyon veya posttranscriptional mekanizmalar yoluyla gen ifadesinin yasal yollar karıştığı. Bu alanda geçerli sorunlardan biri bu lncRNAs RNA'ların çoğu işlemedeki alaka anlamaktır. Bu amaçla, lncRNAs tarafından hedef RNA'ların tespit edilmesi gerekiyor. Önceki çalışmalarda lncRNAs Derneği Kromatin ile üzerinde duruldu esinlenerek, RNA'ların bir lncRNA ile ilişkili kimliği sağlar bir yordam geliştirdik. Esas olarak iki önemli adım üzerinde bağımlı RNA aşağı açılır adlı bu protokol başarıdır, yani Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları tasarımını var özellikle ve sadece ilgi lncRNA ve doku koşullarına melezlemek veya Tüm moleküler ortakları arasında ağ bütünlüğünü korumak zorunda hücre fiksasyon.

Daha önce bir lncRNA ile birlikte, ilişkili Kromatin dizileri (cıvıltı^1,2, grafik^3,4) yalıtmak için yordamları sağlanan protokoller yayınlandı. Bu protokoller farklı stratejiler Anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları tasarım istihdam edildi. Cıvıltı yordamda yazarlar DNA biotinylated Oligonükleotid probları lncRNA ilgi tüm uzunluğu tüm gereksiz ve non-spesifik problar^1,2dışlanması sonra kapsayan bir havuz kullanılır. GRAFİK protokolündeki yazarlar hibridizasyon için daha erişilebilir lncRNA bölgelerinde tespit ve bu bölgelerde hedef yakalama oligonucleotides tasarlanmış. Bu bölgeler temelinde kendi RNase H duyarlılık seçildi. Gerçekten de, RNA'ların RNA-DNA bağlama sitelerdeki hidrolize için RNAse H özelliğini kullanarak, lncRNA erişilebilir sitelere melezlemek oligonucleotides RNA-DNA melez üretmek ve lncRNA enzimatik bölünme için yol. Yazarlar bu aday yakalama oligonucleotides üçü seçili ve onları bir kokteyl^3,4' te kullanılan.

Yordamı grafik protokolünde kullanılan anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları yapıldı yakın tasarım yapardık ama istenen lncRNA hibridizasyon kullanılabilir bölgelerinde onların RNAse H duyarlılık temelinde, seçili değil ama Biyoinformatik modelleme lncRNA ikincil yapılara sahip tarafından belirlenen iç baz eşleşmesi onların düşük olasılık göre. Farklı ikincil yapılar farklı algoritmaları kullanarak tahmin ve seçilecek sondalar o lncRNA en büyük sayısı tahmin ikincil yapılar olarak kullanılabilir sıralarını melezlemek olmalıdır fark gerekir. Aynı sonuçları üç tasarlanmış bir kokteyl, belirli probları veya tek bir sonda kullanarak tek tek elde edilmiştir. Bu iki ayrı, belirli problar kullanımı ve bu iki problar için ortak olan bu olumlu sonuçlar dikkate istenir. Son olarak, bu nedenle bir en iyi sonuç için yöntem geliştirilmesi başında önerilir ve 3 farklı Anti-anlamda Oligonükleotid tasarlamak için aşağı açılır, sonuçlarını özgüllük değerlendirmek muktedir probları ve sonra karşılaştırmak için özellikle sonda verimliliği hücre lysate hazırlık tarafından değişmiş olabilir beri deneysel olarak onların verimliliği. Yine de, lncRNA biz kullanılan yapısı daha ucuz fayans Oligonükleotid probları²takımlık üzerinde temel kaldı ve bu yöntemi göre daha az zaman alıcı ikincil modellenmesi Biyoinformatik dayalı soruşturma tasarım prosedürü RNAse H duyarlılık⁴üzerinde.

Bir negatif kontrol negatif yakalama Oligonükleotid anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları gibi kullanarak aynı zamanda gerçekleştirilmesi gereken veya Oligonükleotid probları veya karşı ilgisiz bir RNA yönetmen oligonucleotides karıştırılmış. Doğal antianlamlı transkript lncRNAs varlığı nedeniyle anlamda Oligonükleotid sonda kullanımı bazen yetersiz olabilir. Negatif denetim için seçilmiş Oligonükleotid sonda ne olursa olsun, bilinen bir RNA ile melez değil patlamanın kontrol etmek ve bu Oligonükleotid hala un ek açıklama eklenen bir lncRNA melezlemek akılda tutmak için gereklidir.

Bu RNA açılan deneylerde kullanılan hücre lysates 10 elde edilmiştir⁶ -10⁷ hücreler kültürlü hücrelerle ve 1-10 mg doku ile çalışırken çalışırken. Hücre lysates hazırlanması optimize edilmiş olması gereken iki ana adımları ile kullanılan doku veya hücre tipine göre adapte gerekiyor: Yani, cross-linking adım lncRNA ve moleküler ortakları arasında Kovalent bağlar oluşumunu sağlayan ve viskozite Kromatin parçalama tarafından azaltır sonication adım.

Cross-linking adım tüm moleküler ortakları arasında bir ağ oluşumu inducing tarafından tüm RNA hedefler için lncRNA kapalı kalmasını sağlamak için amaçtır. Yararlanılabilmesi için retiküle. lncRNA ve ortakları arasında Kovalent bağlar oluşturacak bir paraformaldehyde tedavi adım sağlar GRAFİK iletişim kuralında nükleer lncRNA ile paraformaldehyde ile ilk tedavi gerçekleştirmek için çalışan bütün lysate hücre ve bir saniye önerildi tedavi izole nükleik kesir^3,4. Hücrelerdeki lncRNA erişilebilirlik azaltarak, bu ek adım sondalar, verimliliğini muhtemelen azalma gözlendi. Bu nedenle, hücre dikkate alarak adapte olmak paraformaldehyde tarafından Şebekeleşme derecesine sahiptir veya doku türü kullanıldığında, yerelleştirme tasarlanmış probları etkinlik ve faiz lncRNA.

Hücreleri lysing, süre Kromatin lysate içinde yayınlanır ve viskozite artırır; Kromatin örnekleri akışkanlık ve dolayısıyla Oligonükleotid erişilebilirliğini kolaylaştırmak için sonication tarafından parçalamak için gerekli faiz lncRNA için probları, sonra nedir. Ancak, sonication da faiz lncRNA ile çıkarılan RNA'ları parçalayıp. Böyle bir şekilde verimli bir şekilde lysate viskozite azaltır iken, bu da bir uzunluğu ile elde RNA'ın parçaları sağlayan sonication süresini en aza indirmek önemli 200-800 bp. sonication zaman-ecek var olmak yüksek not arasında oluşan, sonra nedir hem miktar hem de doku veya kullanılan kültürlü hücre türüne bağlıdır.

Sonuç olarak, burada açıklanan yordam 2-3 gün içinde istenen lncRNA RNA hedeflerini yakalama sağlar. RT-qPCR ile birleştiğinde, bu yöntemler tarafından istenen lncRNA bir aday yaklaşım olarak bir ilişki ve düzenleme, bir mRNA arıyor izin verir. Genom geniş yaklaşım için RNA açılan deneyler yüksek üretilen iş RNA-sıralama istenen lncRNA ile ilişkili tüm RNA'ların alınmasını sağlayan tarafından analiz edilebilir. Seçilen her türlü analitik strateji, RNA açılan yordam tarafından lncRNAs RNA regülasyonu yeni önemli bilgi sağlamalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetic streptavidin beads
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026
Gel electrophoresis apparatus	Advance	Mupid-One	Gel electrophoresis apparatus
Proteinase K	Sigma	P2308
RNA XS purification kit	Macherey-Nagel	740902	RNA purificationkit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse inhibitor
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	RNA purification
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf tube rotator
RNA to DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse transcription kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagent
Applied 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	qPCR apparatus
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit	Illumina	20020594	DNA library construction kit
Illumina NextSeq 500	Illumina	SY-415-1002	NGS system