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Diese RNA Pulldown-Methode ermöglicht es, die RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA (LncRNA) zu identifizieren. Basierend auf der Hybridisierung von hausgemachten, gestaltete Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden spezifisch für diese LncRNA in einem entsprechend festen Gewebe oder Zell-Linie, ermöglicht es effizient die Erfassung aller RNA-Ziele von der LncRNA.
Lange nicht-kodierende RNA (LncRNA), die Sequenzen von mehr als 200 Nukleotiden ohne einen definierten Leseraster sind, gehören zu den regulatorischen nicht-kodierender RNA Familie. Obwohl ihre biologischen Funktionen weitgehend unbekannt bleiben, die Zahl dieser LncRNAs stetig gestiegen und es wird jetzt geschätzt, dass der Mensch mehr als 10.000 solcher Protokolle können. Einige davon sind bekanntermaßen wichtige regulatorische Signalwege der Genexpression beteiligt sein, die auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf verschiedenen Stufen der RNA co- und Posttranskriptionale Reifung stattfinden. In den letztgenannten Fällen haben RNAs, die durch das LncRNA ausgerichtet sind, identifiziert werden. Das ist der Grund, warum ist es sinnvoll, eine Methode, die es ermöglicht die Identifizierung der RNAs verbunden direkt oder indirekt mit einer LncRNA von Interesse zu entwickeln.
Dieses Protokoll, das von zuvor veröffentlichten Protokolle, so dass die Isolierung des LncRNA zusammen mit den zugehörigen Chromatin-Sequenzen inspiriert wurde, wurde angepasst um die Isolierung der zugehörigen RNAs zu ermöglichen. Wir festgestellt, dass zwei Schritte entscheidend für die Effizienz dieses Protokolls sind. Das erste ist das Design von spezifischen Anti-Sense DNA-Oligonukleotid Sonden zu hybridisieren, die LncRNA von Interesse. Zu diesem Zweck die LncRNA Sekundärstruktur wurde von Bioinformatik vorausgesagt und Gegenstrang Oligonukleotid Sonden wurden entwickelt, mit einer starken Affinität für Regionen, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung angezeigt. Der zweite entscheidende Schritt des Verfahrens stützt sich auf das Fixativ Bedingungen des Gewebes oder kultivierten Zellen, die das Netzwerk zwischen allen molekularen Partnern zu erhalten. Gepaart mit hohem Durchsatz RNA Sequenzierung, bieten diese RNA Pulldown-Protokoll der gesamten RNA Interaktom des LncRNA von Interesse.
Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist RNA Molekulare Partner eine lange nichtcodierender RNA (LncRNA) zu identifizieren. LncRNA Sequenzen von mehr als 200 Nukleotide ohne einen definierten Leseraster entsprechen. Einige von ihnen haben gezeigt, dass Ausdruck Genregulation, nicht nur auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf verschiedenen Stufen der RNA mit- und Posttranskriptionale Reifung beteiligt sein. In den letztgenannten Fällen sind Molekulare Partner von der LncRNA RNAs, die identifiziert werden. Entscheidend für die Entwicklung wäre eine Methode ermöglicht die Identifizierung der RNAs verbunden direkt oder indirekt mit einer LncRNA von Interesse.
Zuvor veröffentlichten Methoden, wie Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (ChIRP)1,2 und erfassen Hybridisierung Analyse der RNA Ziele (Diagramm)3,4, erlauben Hochdurchsatz-Entdeckung RNA-gebundene Proteine und genomische Bindungsstellen für einen bestimmten LncRNA. In diesen zwei Methoden, die LncRNA von Interesse war zuerst zu biotinylierte komplementären Oligonukleotiden hybridisiert, und die Anlage war dann isoliert mit Streptavidin-Perlen. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Techniken bezieht sich auf das Design der Sonden, die auf LncRNAs. Zwitschern, die Strategie von RNA-Fisch, bestand aus einen Pool von kurzen komplementären DNA-Oligonukleotid Sonden decken die gesamte Länge der LncRNA Gestaltung inspiriert. Im Gegensatz dazu im Diagramm angepasst die Autoren einen RNase H Zuordnung Assay auf LncRNAs Websites zur Hybridisierung zu untersuchen.
Das Verfahren hier vorgeschlagene Design Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden verwendet, die Bioinformatik Modellierung von LncRNA Sekundärstruktur5 markieren Sie mit einer starken Affinität für Regionen-Sonden, die eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen anzeigen Base pairing. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass weniger teuer als solche auf Basis von Pools von Fliesen Oligonukleotid Sonden2 und weniger zeitaufwändig als solche auf Basis von RNAse-H Empfindlichkeit4.
Da gibt es eine wachsende Zahl von Beweisen für posttranskriptionelle Genregulation durch LncRNAs6, ist es sehr nützlich, um einen Ansatz ermöglicht die Erfassung von RNAs, die Ziele von einem LncRNA zu entwickeln. Darüber hinaus wurde der Ansatz für die meisten Anwendungen verwendbar, in kultivierten Zellen und Gewebe-Extrakte optimiert.
Alle Verfahren wurden unter strikter Einhaltung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft für die Pflege und Verwendung von Labortieren (86/609/EWG und 2010/63/UE) und unter einer Lizenz gewährt, D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, Genehmigung Nr. 13-002) durchgeführt.
1. Probe Design
2. Vernetzung
(3) Zellen oder Gewebe Lyse
(4) Beschallung
(5) RNA-Pulldown
Mehrere Studien haben gezeigt, dass LncRNAs in fast allen wichtigen biologischen Verfahren eine wesentliche Rolle spielen und dass diese Rolle durch die Kontrolle der Genexpression auftreten, sowohl auf die transkriptionelle und posttranskriptionelle Ebene erreicht wird zeigen in diesem Fall, dass RNAs das Ziel von LncRNAs6sein können.
Die LncRNA nuklearen angereicherten reichlich Transkript 1 (Neat1) ist in verschiedenen Neuropathologies als Frontotemporale Demenz, Amyotrophe Lateralsklerose oder Epilepsie8,9,10verwickelt, und ist auch misreguliert in verschiedenen Krebsarten11,12.
Diese LncRNA ist auch bekannt, der strukturellen Komponente des bestimmten nuklearen Einrichtungen, die Paraspeckles und posttranskriptionelle Circadiane Regulierung der Gen-Expression-13beteiligt sein. Paraspeckles, die findet man in jedem Zellkern und werden gebildet, um nicht nur Neat1, die notwendig ist für ihre Ausbildung, sondern auch um mehrere RNA-bindende Proteine (RBP)14, sind in der Tat bekannt, RNA Ziele innerhalb des Zellkerns15 behalten zu können . Die Bildung des Paraspeckles erfolgt durch die Vereinigung der verschiedenen Komponenten. Diese Formation zeigte sich ein circadiane rhythmisches Muster eine rhythmische nuklearen Aufbewahrung von RNA Ziele13fahren angezeigt. Die nukleare Beibehaltung der RNA Ziele von Paraspeckles kann auftreten durch Bindung an RBP oder direkt durch RNA/RNA Verein, aber das Ausmaß der RNAs, die gezielt durch Paraspeckles ermittelt werden musste. Um die RNA zu identifizieren gezielt direkt oder indirekt durch Neat1, eine RNA Pulldown-Protokoll wurde entwickelt, die erlaubt, die Isolierung und Identifizierung aller Neat1 RNA-Ziele in kultivierten Zellen als auch in Gewebeproben (siehe Abbildung 1 für eine grafische Präsentation der Technik).
Das Protokoll wurde auch erfolgreich zur Identifizierung der RNA Ziele von einem anderen LncRNA Metastasierung assoziiert Lunge Adenokarzinom Transkript 1 (Malat1) eingesetzt. Malat1 ist ein hoch konservierte und ausdrücklichen LncRNA in nuklearen Flecken zusammen mit mehreren RNA splicing-Faktoren gefunden. Malat1 ist bekannt, in der Verordnung das Spleißen von mehreren im Entstehen begriffenen Pre-mRNA16,17einbezogen.
(SO) spezifische und unspezifische Oligonukleotid (NSO) Sonden wurden mit der Sonde Designstrategie beschrieben hier erzeugt. Diese Strategie basiert auf die Auswahl der Regionen, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basis Paarung wie vorhergesagt durch die Sekundärstruktur der LncRNA angezeigt und das Design von spezifischen Sonden mit einer starken Affinität für diese Regionen. Als ein repräsentatives Ergebnis dieser Bioinformatik Vorhersagen, ein Bild von den vorhergesagten Sekundärstruktur aus einer Folge von Neat1 (Nukleotide 1.480 bis 2.000) zusammen mit der Position von zwei entwickelt, so dass Sonden in Abbildung 2gegeben sind.
Die entworfenen Sonden wurden angewiesen, Neat1 oder Malat1 für GH4C1, die kultivierten Zellen und Maus Neat1 für Hypophyse Gewebe-Extrakte (Tabelle 1) Ratte. Die relative Anreicherung in Neat1 oder Malat1 wurde für die unspezifischen und spezifischen Sonden im Verhältnis zu der eingabesamples berechnet. Abbildung 3 zeigt die Effizienz der spezifischen Sonden zu Pulldown-Neat1 bei der Ratte GH4C1 Hypophyse Zelllinie (Abbildung 3A) und in der Maus Hypophyse Gewebe extrahiert (Abb. 3 b). Wenn die Sonde Design-Protokoll verwenden, um spezifische Oligonukleotid generieren (damit) Sonden an Malat1 weitergeleitet, verworfen eine effiziente Sonde erhalten wurde, während ein anderer nicht effizient genug war und wurde (Abb. 4A).
Nach einer RNA Pulldown-Verfahren, gefolgt von RT-qPCR Experimente, einige RNAs bewertet mit spezifischen Primern (Tabelle 1) erwiesen sich als Neat1 oder Malat1 GH4C1 auszugsweise zugeordnet werden. Der RNAs, die im Zusammenhang mit Neat1 in GH4C1 zellextrakte zeigten auch auszugsweise Hypophyse Gewebe mit Neat1 in Verbindung gebracht werden. In der Tat wurde nach Neat1 RNA Pulldown-Malat1 gefunden, von Neat1 in der GH4C1-Zell-Linie und auszugsweise Hypophyse Maus Gewebe (Abb. 5A) ausgerichtet werden. Umgekehrt war Neat1 wesentlich bereichert, nachdem Malat1 RNA Pulldown-Menü mit einer speziellen Sonde in den GH4C1 Zellen (Abbildung 4 b) durchgeführt. Durch die enge Beziehung zwischen den beiden LncRNAs hervorheben, diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der möglichen ko-Rolle der Neat1 und Malat1, vorgeschlagen von Malat1-Knockout-Mäusen, die Variationen an Neat1 RNA Ausdruck18, 19. die Transkripte der beiden wichtigsten Hypophyse Hormone, Wachstumshormon (Gh) (Abb. 5 b) und Prolaktin (Prl) (Abbildung 5) wurden wesentlich bereichert nach Neat1 RNA Pulldown-Menü mit speziellen Sonden in GH4C1 Zellen und Hypophyse extrahiert, was auf eine mögliche Regulierung der beiden Hormone durch Neat1. Vergleicht man die zwei spezifischen Sonden verwendet, schien es, dass ihre Effizienz, je nach RNA Ziel betrachtet (Abbildung 5 b und Abbildung 5 variieren kann). Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit der Gestaltung mehrere spezifische Sonden, um die Anzeige nicht nur den besten Wirkungsgrad bei der Anreicherung von Pulldown-LncRNA, sondern auch die beste Effizienz bei der Anreicherung der RNA Ziele auswählen.
Die RNA-Pull-Down-Methode kann auch RNA Hochdurchsatz-Sequenzierung erhalten die umfassende Liste der RNA Ziele von LncRNA Interesse13folgen. Eine RNA-Seq-Analyse auf GH4C1 Hypophysen Zellen nach Neat1 RNA Pulldown-Menü mit zwei spezifischen Sonden, die oben beschriebenen durchgeführt wurde. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Negativkontrolle mit einem NSO auch RNA-Seq-Analyse unterzogen werden könnte wenn das Niveau der RNA wiederhergestellt, nachdem das RNA-Pulldown-Menü mit NSO ausreicht, um den Bau von Bibliotheken ermöglichen. Dies war nicht der Fall in früheren Erfahrung13. Bibliotheken, die erzeugt wurden, nach der Verwendung von spezifischen Sonden wurden analysiert mit Tophat/Manschettenknöpfe pipeline-20 und nur Abschriften mit Werten des Fragments pro Kilobase pro Million des zugeordneten lautet (FPKM) höher als 1 berücksichtigt wurden. Die Listen mit den zwei spezifischen Sonden an Neat1 gerichtet erhalten (Tabelle 1) wurden gekreuzt, um die Spezifität der Ergebnisse zu bewerten. 4.268 Gene fanden sich verbunden mit Paraspeckles, die 28 % der zum Ausdruck gebrachten Abschriften in GH4C1 Zellen13vertreten. In Übereinstimmung mit erzielten Ergebnisse mit qPCR Analyse (Abbildung 5A-C), die Transkripte der Gh, Prl und Malat1 fanden sich Neat1 zugeordnet werden. Die RNA-Pull-Down-Methode wurde daher erwies sich ein effizientes Werkzeug, um die Interaktion zwischen LncRNAs und ihre RNA Ziele erkunden werden.
Abbildung 1: grafische Darstellung der RNA pull-down Verfahren. Am ersten Tag wurden Zellen oder Geweben vernetzt mit Paraformaldehyd, lysiert und vor dem Schritt der Hybridisierung, der durchgeführt wurde, indem man spezifische Sonden biotinylierte beschallt. Magnetische Streptavidin Perlen wurden dann hinzugefügt, um bestimmtes Material vom Rest der Zelle lysate zu trennen. Am zweiten Tag waren Perlen isoliert durch einen Magneten und mehrmals gewaschen. Ein de-Vernetzung Schritt ermöglichte Wiederherstellung von RNAs, die gereinigt und für RT-qPCR oder RNA-Seq-Analyse verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: sekundäre Struktur aus mehreren Neat1 (Nukleotid 1.480 bis 2.000) wie vorhergesagt von Bioinformatik-Ressource (RNAstructure-Webserver; niedrigste freie Energie-Struktur). Die Struktur ist je nach Grad der Wahrscheinlichkeit der Basenpaarung gefärbt. Die zwei Oligonukleotide Sonden (SO1 und SO2) in rot sind entlang der Neat1 RNA-Struktur aufgestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: qPCR Validierung der Neat1 Bereicherung gegenüber Eingang. qPCR Validierung der Neat1 Bereicherung gegen Eingabe nach Neat1 RNA herunterziehen von zwei verschiedenen spezifischen Sonden (SO1-Rn und SO2-Rn für GH4C1 Zellen und 1 mm und SO2-mm für Hypophyse Gewebe) im Vergleich zu einer unspezifischen (NSO-Rn für GH4C1 Zellen und NSO-mm für Hypophyse Gewebe) in GH4C1 rattenzellen (A) und Maus Hypophyse Gewebe extrahiert (B). Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM in 3 bis 10 Experimenten gewonnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: qPCR Validierung von Malat1 und Neat1 Bereicherung gegen Eingabe nach Malat1 RNA herunterziehen. qPCR Validierung des Malat1 (A) und Neat1 (B) Anreicherung versus Eingabe nach Malat1 RNA durch zwei verschiedene spezifische Sonden (SO3-Rn und SO4-Rn) im Vergleich zu einer unspezifischen herunterziehen einer (NSO-Rn) in GH4C1 rattenzellen. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM in 3 Experimente erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: qPCR Validierung von Malat1, Gh, Prl Bereicherung gegen Eingabe nach Neat1 RNA herunterziehen. qPCR Validierung des Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) Anreicherung versus Eingabe nach Neat1 RNA pull-down mit verschiedenen spezifischen Sonden im Vergleich zu einer unspezifischen GH4C1 Ratte Zellen und Maus Hypophyse Gewebe extrahiert. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM in 3 bis 8 Experimente erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
SONDE NAMEN | Sequenzen | |
NSO-Rn | TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT | |
SO1-Rn | CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC | |
SO2-Rn | GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC | |
SO3-Rn | AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA | |
SO4-Rn | AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC | |
NSO-mm | GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC | |
SO1-mm | GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC | |
SO2-mm | CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA | |
qPCR Primer: | ||
Rattus norvegicus | ||
Neat1 | AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT | |
TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC | ||
Malat1 | GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT | |
TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA | ||
GH1 | CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA | |
GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT | ||
PRL | TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT | |
AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA | ||
Mus musculus | ||
Neat1 | TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA | |
CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT | ||
GH1 | CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA | |
TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC | ||
PRL | TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT | |
AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA |
Tabelle 1: Sequenzen von DNA-Oligonukleotid Sonden und qPCR Primer
Lange Forensisches RNAs (LncRNAs) durch ihre Anzahl und Vielfalt ein großes Forschungsfeld dar, die meisten ihrer Rollen sind noch zu entdecken. Viele von diesen LncRNAs haben eine nukleare Lokalisierung und unter ihnen sind einige an rechtlichen Wege der Genexpression durch transkriptionelle oder posttranskritionelle Mechanismen beteiligt. Eines der aktuellen Herausforderungen in diesem Bereich ist die Relevanz dieser LncRNAs in Posttranskriptionale Verarbeitung von RNAs zu verstehen. Zu diesem Zweck müssen RNAs gezielt durch LncRNAs identifiziert werden. Inspiriert von früheren Studien konzentrierte sich auf die Vereinigung von LncRNAs mit Chromatin, entwickelten wir ein Verfahren, das von RNAs, die einem LncRNA zugeordnet werden können. Der Erfolg dieses Protokolls, namens RNA Pulldown-richtet sich vor allem auf zwei entscheidende Schritte, nämlich die Gestaltung der Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden, die speziell und ausschließlich mit der LncRNA von Interesse, und die Bedingungen des Gewebes zu hybridisieren oder Zelle-Fixierung, die die Integrität des Netzwerks zwischen allen molekularen Partnern zu erhalten.
Zuvor veröffentlichten Protokollen vorgesehenen Verfahren um eine LncRNA zusammen mit seinen zugehörigen Chromatin-Sequenzen (ChIRP1,2, Tabelle3,4) zu isolieren. In diesen Protokollen wurden verschiedene Strategien Design beschäftigt, die dem Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden. In der ChIRP-Prozedur verwendet die Autoren einen Pool von DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden umfasst die gesamte Länge des LncRNA von Interesse nach Ausschluss aller überflüssig und nicht-spezifischen Sonden1,2. Protokoll der CHART die Autoren identifiziert die Bereiche der LncRNA, die zugänglicher für die Hybridisierung sind und Capture-Oligonukleotide, die auf diesen Gebieten entwickelt. Diese Regionen wurden aufgrund ihrer Empfindlichkeit RNase-H ausgewählt. In der Tat, mit der Eigenschaft der RNAse-H, hydrolyseneigung RNAs an Standorten der RNA-DNA-Bindung, der Oligonukleotide, die an zugänglichen Seiten in den LncRNA hybridisieren RNA-DNA-Hybriden zu produzieren und zu enzymatische Spaltung von der LncRNA führen. Die Autoren drei von diesen Kandidaten Erfassung Oligonukleotide ausgewählt und in ein cocktail3,4verwendet.
Das Verfahren zum Design der Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden war nah an, die in das Diagramm-Protokoll verwendet, aber die Hybridisierung verfügbaren Regionen von der gewünschten LncRNA auf der Grundlage ihrer RNAse-H-Empfindlichkeit nicht ausgewählt wurden, sondern nach deren geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung wie von Bioinformatik Modellierung von LncRNA Sekundärstruktur bestimmt. Es muss festgestellt werden, dass verschiedene Sekundärstrukturen werden mit verschiedenen Algorithmen vorausgesagt werden, Sonden ausgewählt werden sollten diejenigen, die verfügbaren Sequenzen der LncRNA in der größten Zahl der Sekundärstrukturen vorhergesagt hybridisieren sein. Die gleichen Ergebnisse wurden erzielt mit entweder ein Cocktail aus drei entworfen, spezifische Sonden oder einer einzigen Sonde einzeln. Dies veranlasste die Verwendung von zwei separaten, spezifischen Sonden und die Berücksichtigung der positiven Ergebnisse als jene, die für diese zwei Sonden sind. Endlich, es wird daher empfohlen, am Anfang der Entwicklung der Methode, für ein optimales Ergebnis und Sonden, die Spezifität der Ergebnisse das Pulldown-Menü, 3 verschiedene Anti-Sense-Oligonukleotid entwerfen bewerten zu können und dann zu vergleichen experimentell ihre Effizienz, zumal Sonde Effizienz durch Zelle lysate Vorbereitung verändert werden kann. Dennoch, das Verfahren der Sonde Design basierend auf Bioinformatik Modellierung von LncRNA sekundäre Struktur verwendeten wir preiswerter als die basierend auf Pools von Fliesen Oligonukleotid Sonden2blieb, und das war weniger zeitaufwändig als die Methode basiert RNAse-H Empfindlichkeit4.
Eine negative Kontrolle sollte auch mit negativen erfassen Oligonukleotid entweder die Sinne DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden durchgeführt werden oder Rührei Oligonukleotid Sonden oder gegen eine unabhängige RNA-Oligonukleotide. Wegen der Existenz der natürlichen antisense Transkripte LncRNAs möglicherweise Verwendung von Sinn Oligonukleotid Sonden manchmal unzureichend. Unabhängig von der Oligonukleotid-Sonde für die negativ-Kontrolle ausgewählt ist es notwendig, durch Explosion zu überprüfen, die es nicht mit einem bekannten RNA hybridisieren und im Auge zu behalten, die diese Oligonukleotid, noch un-kommentierte LncRNA hybridisieren kann.
Die Zelle Lysates verwendet diese RNA Pulldown-Experimente stammen aus 106 bis 107 Zellen bei der Arbeit mit kultivierten Zellen und von 1 bis 10 mg, bei der Arbeit mit Gewebe. Die Vorbereitung der Zelle Lysates muss angepasst werden, je nach Gewebe oder Zellen verwendet mit zwei Hauptschritte, die optimiert werden müssen: nämlich die Vernetzung Schritt, die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den LncRNA und ihren molekularen Partnern ermöglicht und die Beschallung-Schritt, der die Viskosität verringert durch Schreddern Chromatin.
Das Ziel der Vernetzung Schritt soll sicherstellen, dass alle RNA-Ziele für den LncRNA geschlossen bleiben, durch Induktion der Bildung eines Netzwerkes zwischen allen Partnern der molekularen. Ein Paraformaldehyd Behandlungsschritt, die bilden kovalente Bindungen zwischen den LncRNA und ihren Partnern kann das Netzwerk sein netzartige. Im Diagramm Protokoll, es wurde vorgeschlagen, wenn arbeiten mit nuklearen LncRNA, um eine erste Behandlung mit Paraformaldehyd durchzuführen, im großen und ganzen lysate Zelle und eine zweite Behandlung am isoliert Nukleinsäuren Bruchteil3,4. Wir beobachteten, dass dieser zusätzliche Schritt die Effizienz der Sonden, wahrscheinlich verringert durch die Reduzierung der LncRNA Zugänglichkeit in den Zellen. Daher der Grad der Vernetzung von Paraformaldehyd muss unter Berücksichtigung der Zelle angepasst oder Gewebetyp verwendet, die Lokalisierung von LncRNA von Interesse, und die Effizienz der entworfenen Sonden.
Während der Lyse der Zellen, das Chromatin ist in der lysate freigegeben und erhöht seine Viskosität; Es ist dann notwendig, um das Chromatin durch Ultraschallbehandlung zu erhöhen die Fließfähigkeit der Proben und erleichtern damit die Zugänglichkeit des Oligonukleotids Zerkleinern, die LncRNA von Interesse-Sonden. Jedoch wird Beschallung auch Schreddern der RNAs extrahiert mit der LncRNA von Interesse. Es ist dann wichtig, die beschallungsdauer so minimieren, dass es effizient reduziert die Viskosität von der lysate, erlaubt es auch, dass die Einholung der RNA Fragmente mit einer Länge zwischen 200-800 BP. Hinweis enthalten, die die beschallungsdauer hoch werden abhängig von der Menge und der Art des Gewebes oder kultivierten Zellen verwendet.
Abschließend ermöglicht die hier beschriebene Vorgehensweise in 2-3 Tagen die Erfassung der RNA Ziele der gewünschten LncRNA. Gepaart mit RT-qPCR, werden diese Methoden ermöglichen eine Verordnung für eine mRNA und bestimmte Zuordnung durch die gewünschte LncRNA als Kandidat Ansatz suchen. Für eine genomweite Ansatz können RNA Pulldown-Experimente von Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung ermöglicht den Abruf von allen RNAs, verbunden mit der gewünschten LncRNA analysiert werden. Was die analytische Strategie gewählt, sollte das RNA-Pulldown-Verfahren neuen wichtigen Erkenntnisse über RNA-Verordnung von LncRNAs vermitteln.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universität Aix-Marseille und CNRS und finanziert durch einen Zuschuss von Pfizer Laboratorien.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |
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