Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Resumo

Este método de suspenso de RNA permite identificar os alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA (lncRNA). Baseado na hibridação de caseiras, concebidas antido sentidas oligonucleotide sondas de DNA específicas para este lncRNA em um tecido apropriadamente fixo ou linha de células, com eficiência permite a captura de todos os alvos de RNA do lncRNA.

Resumo

Há muito tempo não-codificantes do RNA (lncRNA), que são sequências de mais de 200 nucleotídeos sem um frame de leitura definida, pertencem à família a regulamentar não-codificantes do RNA. Apesar de suas funções biológicas permanecem em grande parte desconhecidas, o número destes lncRNAs aumentou constantemente e agora estima-se que os seres humanos podem ter mais de 10.000 tais transcrições. Alguns destes são conhecidos para ser envolvido em importantes vias reguladoras da expressão do gene que ocorrem no nível transcricional, mas também em diferentes etapas de RNA co - e maturação pós-transcricional. Nos últimos casos, RNAs que são direcionadas pelo lncRNA tem que ser identificado. Essa é a razão por que é útil desenvolver um método que permite a identificação de RNAs associados diretamente ou indiretamente com um lncRNA de interesse.

Este protocolo, que foi inspirado por protocolos anteriormente publicados, permitindo o isolamento de um lncRNA em conjunto com suas sequências de cromatina associada, foi adaptado para permitir o isolamento de RNAs associados. Determinamos que dois passos são essenciais para a eficiência do presente protocolo. O primeiro é o projeto de específicos antisentidos do oligonucleotide sondas de DNA capazes de cruzar para o lncRNA de interesse. Para este efeito, a estrutura secundária de lncRNA foi prevista por bioinformática e antisentido do oligonucleotide sondas foram projetadas com uma forte afinidade com as regiões que exibem uma baixa probabilidade de emparelhamento base interna. A segunda etapa crucial do processo depende das condições fixador do tecido ou células cultivadas que tem que preservar a rede entre todos os parceiros moleculares. Juntamente com a sequenciação do ARN alto throughput, este protocolo suspenso de RNA pode fornecer a interactome toda de RNA de uma lncRNA de interesse.

Introdução

O objectivo geral do método descrito aqui é identificar parceiros moleculares de RNA de um RNA não-codificante longo (lncRNA). LncRNA correspondem a sequências de mais de 200 nucleotídeos sem um frame de leitura definido. Alguns deles foram mostrados para ser envolvido na regulação da expressão gênica, não só a nível transcricional, mas também em diferentes etapas de RNA co - e maturação pós-transcricional. Nos últimos casos, parceiros moleculares da lncRNA são RNAs que devem ser identificados. Um método que permite a identificação de RNAs associados diretamente ou indiretamente com um lncRNA de interesse seria essencial para desenvolver.

Publicado anteriormente métodos, tais como isolamento de cromatina pela purificação de RNA (ChIRP)^1,2 e capturar hibridização análise de RNA alvos (gráfico)^3,4, permitem a descoberta da elevado-produção de Proteínas RNA-limite e sites de ligação genômica de um lncRNA específico. Em um desses dois métodos, o lncRNA de interesse primeiro foi hibridizada para biotinilado oligonucleotídeos complementares, e o complexo foi então isolado usando streptavidin grânulos. A principal diferença entre estas duas técnicas está relacionada com a concepção de sondas lncRNAs de destino. Piu, a estratégia inspirado pelo peixe de RNA, consistia em projetar uma piscina de curto complementares sondas de DNA do oligonucleotide para todo o comprimento do lncRNA de telha. Por outro lado, no gráfico, os autores adaptaram a um ensaio de mapeamento de RNase H na lncRNAs de sites disponíveis para hibridação da ponta de prova.

O procedimento proposto aqui ao design do oligonucleotide biotinilado do anti-sentido DNA utiliza sondas, bioinformática, modelagem de estrutura secundária de lncRNA⁵ para selecionar sondas com uma forte afinidade com as regiões que exibem uma baixa probabilidade de interno base de emparelhamento. Este procedimento tem a vantagem de ser menos caro do que os baseados em piscinas de azulejos do oligonucleotide sondas² e consumir menos tempo do que aqueles que se baseiam na sensibilidade de RNAse-H⁴.

Como não há um corpo crescente de evidências para regulamento de gene pós-transcricional por lncRNAs⁶, é muito útil desenvolver uma abordagem que permite a captura de RNAs que são alvos de um lncRNA. Além disso, para ser utilizável para a maioria dos aplicativos, a abordagem foi otimizada tanto em culturas de células e tecidos extratos.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com a Comunidade Económica Europeia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (86/609/CEE e 63/2010/UE) e sob uma licença concedida a D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, autorização n. º 13-002).

1. sonda Design

1. Usando a sequência primária da lncRNA de interesse, gere sua estrutura secundária sobre o "RNAstructure Webserver"⁵.
   Nota: Neste site diferentes algoritmos podem ser usados. As ferramentas de previsão de três que dão os melhores resultados para os projetos da sonda são: "Dobra" (estrutura de mais baixa energia livre), "MaxExpect" (pares de base altamente prováveis) e "Probnot" (prováveis pares de bases, incluindo pseudoknots). Estes três análises podem ser realizadas e comparadas. Outros servidores de web, tais como o RNA de Viena websuite⁷, também podem ser usados.
   1. Selecione as regiões que apresentam uma baixa probabilidade de emparelhamento base interna e projetar sondas do oligonucleotide antisenso de 25 bases com uma forte afinidade para estas regiões.
      Nota: O conteúdo GC de tais sondas deve incluir entre 40 e 60%. Usando uma ferramenta de busca de alinhamento (explosão), certifique-se que as sondas selecionado do oligonucleotide antisenso não reconhecem sequências nucleotídicas em outro RNA expresso no sistema do celular escolhido.
2. O projeto também uma específico do oligonucleotide sonda ADN de 25 bases que exibe nenhuma afinidade para o lncRNA de interesse nem para outras sequências de RNA no genoma de interesse.
3. Ordenar as sondas com biotina na extremidade 3'.
   Nota: Para reduzir o estérico, a distância entre do oligonucleotide e biotina tem de ser aumentada com um espaçador de triethyleneglycerol. Para melhores resultados e para ser capaz de avaliar a especificidade dos resultados do suspenso, recomenda-se o projeto 3 diferentes antisenso oligonucleotide probes e então comparar experimentalmente sua eficiência.

2. cross-linking

1. Cross-linking de células cultivadas
   1. Cultura do GH4C1 sommatolactotroph da hipófise células suplementado com 15% de soro de cavalo e 2% de soro de vitela fetal F10 do Ham. Cresce as células até a confluência em placas de cultura 78,5 cm² . Isso corresponde aproximadamente a 1 x 10⁷ células.
   2. Remover o meio de cultura celular de um confluente GH4C1 78,5 placa de cultura de² cm, em seguida, enxaguar com o volume médio de fosfato de 1x tampão salino (PBS)
   3. Consertar as células com uma solução de paraformaldeído 1% em PBS (10 mL para um pratos de² 78,5 cm); Esta solução deve ser preparada de uma solução stock de paraformaldeído 4%. Cross-link sob agitação por 10 min à temperatura ambiente (RT).
      Cuidado: Paraformaldehyde (PFA) é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
   4. Extinguir a ação de paraformaldeído, adicionando o volume de 1/10 de glicina 1,25 M (1 mL / 10 mL da solução de paraformaldeído); agitar 5 min à RT
   5. Descarte a mídia por aspiração e enxágue duas vezes (5 min) com 1 X o volume médio de PBS.
   6. Adicionar um volume de PBS, correspondente a 1/10 do volume de mídia, coletar as células com um raspador de célula e depois transferir para um tubo de centrifugação.
   7. Girar a 510 g a 4 ° C por 5 min.
   8. Remova o sobrenadante tanto quanto possível.
   9. Loja pelotas indefinidamente como necessário a-80 ° C.
2. Cross-linking de tecido
   1. Colocar 5 mg de tecido de glândula pituitária rato recém obtidos em uma solução de 1% paraformaldeído diluído em PBS (aproximadamente 10x o volume do tecido), agitar durante 10 min a RT
   2. Extinguir a ação de paraformaldeído pela adição de uma solução de glicina de 1,25 M (1 mL / 10 mL da solução de paraformaldeído) e agitar 5 min à RT
   3. Descartar a mídia por aspiração e lavar duas vezes com PBS (aproximadamente 10x o volume do tecido). Remova o sobrenadante tanto quanto possível.
   4. Armazenar o tecido reticulado indefinidamente a-80 ° C.

3. a célula ou tecido Lysis

1. Prepare o tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 10mm EDTA, SDS 1%, complementado com um coquetel de proteases inibidor 5 µ l/mL e 200 U/mL de uma solução de inibidor de RNAse).
2. Para obter amostras lisadas sem descongelamento prévio, re-suspenda as pelotas de células ou tecidos reticulados com esse buffer (cerca de 1 mL por 100 mg de centrifugado ou tecido). Um centrifugado obtido de 1 x 10⁷ células dão origem a uma amostra de lisados contendo aproximadamente 20 mg de proteína.
   Nota: Dependendo do tecido usado, um passo de ruptura mecânica deve ser adicionado. Neste caso, é importante evitar o aquecimento das amostras durante este passo adicional.

4. sonication

1. Otimização das condições sonication
   1. Programa do sonicador com 2 a 5 séries de 30 ON s e 30 s fora.
   2. Realize testes para otimizar sonication em amostras diluídas lisadas (factor de diluição ½ ou ¼ correspondente a cerca de 5 ou 10 mg de proteína). Lugar diluído lisadas amostras em banho de água a 4 ° C e iniciar a série sonication.
   3. Purifica o RNAs com um kit de purificação de RNA ou com um reagente de isolamento de RNA (por exemplo, Trizol).
   4. Carregar a totalidade do RNA purificado em uma eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TBE, verifique o comprimento dos fragmentos de RNA. Esse comprimento deve variar entre 200 e 800 bp.
      Nota: Dependendo do tamanho do fragmento de RNA, eficiência das sondas antisentido do oligonucleotide pode variar. Então recomenda-se verificar a eficiência das sondas sob diferentes condições de sonication.
2. Sonication das amostras de lisados
   1. Amostras do lugar lysed correspondente a 20 mg de proteínas (obtido após a etapa 3.2) a 4 ° C banho e começam a série de sonication como otimizado na etapa 4.1.
   2. Imediatamente após sonication, centrifugue por 5 min em 12.000 g a 4 ° C. Transferi sobrenadantes em tubos de centrífuga de novo.
      Nota: Para garantir a homogeneidade, replicar sobrenadantes podem ser agrupados e redistribuídos neste passo.

5. RNA Pull-down

1. Dia 1 – etapa de hibridação
   1. Adicione 2 volumes de tampão de hibridização (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 750 mM de NaCl, 1 mM EDTA, SDS 1%, 15% formamida adicionada extemporaneamente) para sobrenadantes coletados após a etapa de sonication. Vórtice.
   2. 20 µ l de cada amostra num tubo de centrífuga (amostras de entrada) de transferir e armazenar a-20 ° C.
   3. Adicione 100 pmol de sondas do oligonucleotide biotinilado (específicas ou inespecíficas; ver tabela 1) para cada amostra. Incubar a 4 a 6 h, sob agitação moderada em rotacao tubo no RT
   4. Adicione 50 µ l de grânulos magnético streptavidin suplementado com 200 U/mL de uma solução de inibidor de RNAse e um coquetel de proteases inibidor 5 µ l/mL.
   5. Incubar durante uma noite sob agitação moderada sobre o rotador de tubo a RT
2. Dia 2 – etapa de isolamento de RNA
   1. Use o suporte magnético para separar os grânulos de lisado celular, desprezar o sobrenadante e lave os grânulos com 900 µ l de tampão de lavagem (SDS 0,5%, CCD 2 x). Repita 5 vezes intercaladas com 5 min de agitação sobre o rotador a RT
   2. Após a última lavagem, decantar uma última vez e adicione 95 µ l de tampão de Proteinease K (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM de NaCl, 1 mM EDTA, SDS 0,5%) e 5 µ l de proteinase K (20 mg/mL) para as amostras.
   3. No gelo, descongelar as amostras de entrada (20 μL) e adicionar 75 µ l de tampão de Proteinease K e 5 µ l de proteinase K (20 mg/mL).
   4. Incubar as amostras com proteinase K por 45 min a 50 ° C depois de 10 min a 95 ° C.
   5. Relaxe a amostra no gelo por 3 min antes de separar as contas de RNAs com o suporte magnético. Manter o sobrenadante e descartar os grânulos.
   6. Purifica o RNAs com um kit de purificação de RNA, que deve incluir uma etapa de digestão de DNA. RNAs de loja a-80 ° C.
   7. Execute qPCR transcrição reversa (RT-qPCR) usando um kit de RT, seguido por qPCR utilizando primers específicos (tabela 1).
   8. Construa duas bibliotecas de DNA correspondente os dois pools de RNA obtidos com cada uma das sondas Neat1 específicas (tabela 1). Realize o sequenciamento em um sistema de sequenciamento de nova geração.

Resultados

Vários estudos recentes têm mostrado que lncRNAs um papel essencial em quase todos os processo biológico importante e que este papel é conseguida através do controle da expressão gênica que ocorrem tanto o transcricional e pós-transcricional níveis mostrando-se neste último caso que RNAs podem ser alvo de lncRNAs⁶.

A lncRNA Nuclear enriquecido abundante transcrição 1 (Neat1) está implicada na neuropathologies diferentes como demência frontotemporal, esclerose lateral amiotrófica ou epilepsia^8,9,10e é igualmente desregulada em diferentes tipos de câncer^11,12.

Este lncRNA é também conhecido para ser o componente estrutural de corpos nucleares específicos, os paraspeckles e envolver-se no Regulamento circadian pós-transcricional da expressão de gene¹³. Os paraspeckles são encontrados em cada núcleo da célula e são formados em torno não só de Neat1, que é necessário para sua formação, mas também em torno de ligação de RNA várias proteínas (RBP)¹⁴, na verdade são conhecidos por serem capazes de reter os alvos do RNA dentro do núcleo¹⁵ . A formação dos paraspeckles é alcançada através da Associação dos diferentes componentes. Esta formação foi mostrada para exibir um padrão rítmico circadian dirigindo uma retenção nuclear rítmica de RNA alvos¹³. A retenção nuclear de alvos de RNA pelos paraspeckles pode ocorrer através da ligação a RBP ou diretamente através da Associação de RNA/RNA, mas foi necessário determinar a extensão dos RNAs visados pelos paraspeckles. Para identificar o RNA alvo diretamente ou indiretamente por Neat1, um protocolo de suspenso de RNA foi projetado que permite o isolamento e a identificação de todos os alvos Neat1 RNA em células cultivadas, bem como em amostras de tecido (ver Figura 1 para um gráfico apresentação da técnica).

O protocolo foi aplicado também com sucesso para a identificação dos alvos de RNA de uma lncRNA outra metástase pulmonar de associado Adenocarcinoma 1 transcrição (Malat1). Malat1 é um lncRNA altamente conservada e expressa encontrado em manchas nucleares juntamente com vários RNA splicing fatores. Malat1 é sabido para ser envolvido na regulação da emenda de vários pre-mRNA nascente^16,17.

Específicos (SO) e pontas de prova do oligonucleotide específico (NSO) foram geradas usando a estratégia de projeto sonda descrita aqui. Esta estratégia baseia-se na seleção das regiões que exibem uma baixa probabilidade de base interna de emparelhamento como previsto pela estrutura secundária da lncRNA e no desenho de sondas específicas com uma forte afinidade para estas regiões. Como um resultado representativo destas previsões de bioinformática, uma imagem da estrutura secundária prevista de uma sequência de Neat1 (nucleotídeos 1.480 para 2.000) juntamente com a posição de dois projetado para sondas são dadas na Figura 2.

As sondas concebidas direcionadas para rato Neat1 ou Malat1 para células GH4C1 cultivadas e mouse Neat1 para extratos de tecido na hipófise (tabela 1). Calculou-se o enriquecimento relativo em Neat1 ou Malat1 para pontas de prova não-específica e específicas em relação as amostras de entrada. A Figura 3 mostra a eficiência das sondas específicas para Neat1 suspenso no rato GH4C1 linha de células da hipófise (Figura 3A) e no rato na hipófise tecido extractos (Figura 3B). Ao usar o protocolo do projeto sonda para gerar específico do oligonucleotide (então) sondas direcionadas para Malat1, um eficiente sonda foi obtida enquanto outra não foi eficiente o suficiente e era descartado (Figura 4A).

Depois de um RNA suspenso procedimento seguido por RT-qPCR experimentos, alguns RNAs avaliados com primers específicos (tabela 1) foram mostrados para ser associado com Neat1 ou Malat1 em extractos de GH4C1. Os RNAs associados com Neat1 em extratos de células GH4C1 também foram mostrados para ser associado com Neat1 em extratos de tecido da hipófise. Com efeito, depois de RNA Neat1 suspenso, Malat1 foi encontrado para ser alvo de Neat1 na linha de células GH4C1 e em extratos de tecido de rato na hipófise (Figura 5A). Reciprocamente, Neat1 foi significativamente enriquecido após Malat1 RNA suspenso realizado com uma sonda específica nas células GH4C1 (Figura 4B). Destacando-se a estreita relação entre os dois lncRNAs, estes resultados são consistentes com o papel de co-regulação potencial de Neat1 e Malat1 sugerido por ratos do KO Malat1 que exibem variações na expressão de RNA Neat1^{18, 19}. as transcrições dos dois principais hormônios da hipófise, o hormônio do crescimento (Gh) (Figura 5B) e a prolactina (Prl) (Figura 5) foram significativamente enriquecidas na sequência de RNA Neat1 suspenso com sondas específicas em células GH4C1 e hipófise extratos, sugerindo uma possível regulamentação dos dois hormônios por Neat1. Ao comparar as duas sondas específicas usadas, parecia que sua eficiência pode variar consoante o alvo do RNA considerado ( Figura 5eFigura 5B ). Esses resultados destacam a necessidade de projetar várias sondas específicas para selecionar aqueles exibindo não só a melhor eficiência no enriquecimento de lncRNA o suspenso, mas também a melhor eficiência no enriquecimento de seus alvos de RNA.

O método suspenso do RNA também pode ser seguido por sequenciação do ARN de alto rendimento para obter a lista completa dos destinos de RNA de uma lncRNA de interesse¹³. Uma análise de RNA-seq GH4C1 células da hipófise após Neat1 RNA suspenso usando as duas sondas específicas acima descritas foi realizado. Note-se que um controle negativo usando um NSO também poderia ser submetido a análise do RNA-seq, se o nível do RNA recuperado após o RNA suspenso com NSO é suficiente para permitir a construção de bibliotecas. Isto não foi o caso na anterior experiência¹³. Pipeline de bibliotecas que foram geradas após a utilização de sondas específicas foram analisados usando Tophat/botões de punho²⁰ e apenas transcrições com valores do fragmento por mil por milhão de leituras mapeadas (FPKM) superiores a 1 foram tomadas em conta. As listas obtidas com as duas sondas específicas direcionadas para Neat1 (tabela 1) foram cruzados para avaliar a especificidade dos resultados. 4.268 genes foram encontrados associados com os paraspeckles, que representou 28% de transcritos expressados em células de GH4C1¹³. Consistente com os resultados obtidos através da análise de qPCR (Figura 5A-C), as transcrições de Gh e Prl Malat1 foram encontradas para ser associado com Neat1. O método de suspenso de RNA, portanto, provou ser uma ferramenta eficiente para explorar a interação entre lncRNAs e os alvos de RNA.

Figura 1: representação gráfica do RNA puxar para baixo procedimento. No primeiro dia, as células ou tecidos foram reticulados com paraformaldeído, lysed e lisados antes da etapa de hibridização que foi executada pela adição de sondas específicas biotinilado. Esferas magnéticas streptavidin então foram adicionadas para separar o material específico do resto da célula lisado. No segundo dia, grânulos foram isolados por um imã e lavados várias vezes. Um passo de reticulação permitiu a recuperação de RNAs que foram purificados e usado para RT-qPCR ou análise de RNA-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: estrutura secundária de uma sequência de Neat1 (nucleotídeos 1.480 para 2.000) conforme predito por recurso de Bioinformática (servidor Web RNAstructure; estrutura de energia livre mais baixa). A estrutura é de cor de acordo com o grau de probabilidade de emparelhamento de base. As duas sondas de oligonucleotídeos (SO1 e SO2) em vermelho são posicionadas ao longo da estrutura do RNA Neat1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: validação de qPCR de enriquecimento Neat1 contra entrada. validação de qPCR de enriquecimento Neat1 contra entrada após Neat1 RNA puxar para baixo por dois diferentes específicas sondas (SO1-rn e SO2-rn para células GH4C1 e SO1-mm e SO2-mm para o tecido da hipófise) em comparação com um não-específica (NSO-rn para células GH4C1 e NSO-mm para tecido da hipófise) em células de rato de GH4C1 (A) e na hipófise rato tecido extrai (B). Os resultados são média ± SEM obtidos em experimentos de 3 a 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: validação de qPCR de enriquecimento Malat1 e Neat1 contra entrada após Malat1 RNA puxar para baixo. validação de qPCR de Malat1 (A) e Neat1 (B) enriquecimento contra entrada após Malat1 RNA puxar para baixo por dois diferentes específicas sondas (SO3-rn e rn-SO4) em comparação com um específico um (NSO-rn) em células de rato GH4C1. Os resultados são média ± SEM obtidos em 3 experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: validação de qPCR de Malat1, Gh, Prl enriquecimento contra entrada depois de RNA Neat1 puxar para baixo. validação de qPCR de Malat1 (A), Gh (B), enriquecimento de Prl (C) contra entrada após Neat1 RNA puxar para baixo usando diferentes sondas específicas em comparação com um específico em pilhas do rato GH4C1 e tecido da hipófise rato extrai. Os resultados são média ± SEM obtidos em experimentos de 3 a 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOMES DE SONDA	Sequências de
NSO-Rn	TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-Rn	CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-Rn	GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-Rn	AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-Rn	AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mm	GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mm	GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mm	CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
qPCR PRIMERS:
Rattus norvegicus
Neat1	AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
	TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1	GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
	TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
GH1	CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
	GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1	TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
	CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
GH1	CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
	TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

Tabela 1: Sequências de DNA do oligonucleotide sondas e primers de qPCR

Discussão

Há muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) pelo seu número e diversidade representam um grande campo de pesquisa e a maioria de seus papéis está ainda a ser descoberto. Muitos destes lncRNAs têm uma localização nuclear e entre eles, alguns estão implicados nas vias reguladoras da expressão gênica através de mecanismos transcriptional ou posttranscriptional. Um dos desafios atuais neste campo é entender a relevância dos lncRNAs em processamento pós-transcricional de RNAs. Para este efeito, RNAs alvo de lncRNAs tem que ser identificado. Inspirado por estudos anteriores focados na associação de lncRNAs com cromatina, desenvolvemos um procedimento que permite a identificação de RNAs associados com um lncRNA. O sucesso do presente protocolo, chamado RNA suspensos, é principalmente dependente de duas etapas cruciais, ou seja, o projeto da antisenso oligonucleotide DNA sondas que tenho especificamente e exclusivamente cruzar com a lncRNA de interesse e as condições do tecido ou fixação da pilha que tem que preservar a integridade da rede entre todos os parceiros moleculares.

Publicado anteriormente protocolos fornecidos procedimentos para isolar uma lncRNA juntamente com suas sequências de cromatina associada (ChIRP^1,2,^3,de gráfico⁴). Esses protocolos, diferentes estratégias foram empregadas para pontas de prova do oligonucleotide de biotinilado anti-sentido DNA de design. O procedimento de ChIRP, os autores utilizaram um pool de DNA biotinilado do oligonucleotide sondas englobando toda a extensão do lncRNA de interesse após a exclusão de todas as sondas redundantes e não-específica^1,2. No protocolo de gráfico, os autores identificaram as regiões do lncRNA que são mais acessíveis para a hibridação em projetado captura oligonucleotides que nestas regiões de destino. Estas regiões foram selecionadas com base em sua sensibilidade de RNase-H. Com efeito, usando a propriedade de RNAse-H para hidrolisar RNAs aos sítios de ligação de RNA-DNA, os oligonucleotides que hibridizam para sites acessíveis na lncRNA produzem híbridos RNA-DNA e levam a clivagem enzimática do lncRNA. Os autores selecionados três dos oligonucleotides de captura candidatos e usaram-as em um coquetel^3,4.

O procedimento que costumávamos design no anti-sentido DNA biotinilado do oligonucleotide sondas foi perto de usado no protocolo de gráfico, mas as regiões hibridização-disponível do lncRNA desejado não foram selecionadas com base em sua sensibilidade de RNAse-H, mas de acordo com a sua baixa probabilidade de emparelhamento base interna conforme determinado pela modelagem de bioinformática da estrutura secundária de lncRNA. Ele deve ser notado que irão prever-se diferentes estruturas secundárias usando algoritmos diferentes, e sondas a serem selecionados devem ser aqueles que hibridizam às sequências disponíveis do lncRNA do maior número de estruturas secundárias que previu. Os mesmos resultados foram obtidos usando um coquetel de três projetada, sondas específicas ou um único teste individualmente. Isto levou a utilização de duas sondas separadas, específicas e a consideração dos resultados positivos como aqueles que são comuns a estas duas sondas. Finalmente, recomenda-se, portanto, no início do desenvolvimento do método, para melhores resultados e ser capaz de avaliar a especificidade dos resultados da puxar para baixo, para projetar 3 diferentes do oligonucleotide antisondas sentido e, em seguida, comparar experimentalmente sua eficiência, especialmente desde que a sonda eficiência pode ser alterada por preparação lisado celular. No entanto, o procedimento de sonda design baseado em modelagem de bioinformática do lncRNA secundário estrutura usamos permaneceu menos cara do que com base em piscinas de azulejos do oligonucleotide sondas², e isso era menos demorado do que o método com base na sensibilidade de RNAse-H⁴.

Um controle negativo também deve ser realizado utilizando como oligonucleotide captura negativas ou o sentido DNA biotinilado do oligonucleotide probes ou mexidos pontas de prova do oligonucleotide, ou oligonucleotídeos dirigidos contra um RNA independente. Devido à existência de transcrições antisentido natural lncRNAs, uso de sondas de sentido do oligonucleotide às vezes pode ser inadequado. Independentemente da sonda do oligonucleotide seleccionada para o controlo negativo, é necessário verificar pela explosão que ele não cruzar com um conhecido do RNA e para manter em mente que este oligonucleotide pode cruzar para um lncRNA ainda un-anotado.

Os lisados celulares usados nesses experimentos suspenso de RNA foram obtidos a partir de 10⁶ a 10 células de⁷ ao trabalhar com culturas de células e de 1 a 10 mg, ao trabalhar com tecido. A preparação de lisados celulares precisa ser adaptado de acordo com o tipo de tecido ou célula usado com duas etapas principais que devem ser otimizadas: ou seja, a etapa do cross-linking que permite a formação de ligações covalentes entre o lncRNA e seus parceiros moleculares e o passo sonication que reduz a viscosidade, fragmentando a cromatina.

O objetivo da etapa do cross-linking é garantir que todos os alvos de RNA permanecem fechados para o lncRNA, induzindo a formação de uma rede entre todos os parceiros moleculares. Uma etapa de tratamento de paraformaldeído que irá formar ligações covalentes entre o lncRNA e seus parceiros permite que a rede ser reticulado. No protocolo de gráfico, sugeriu-se trabalhando com lncRNA nuclear, para realizar um tratamento de primeira com paraformaldeído em toda célula lisado e um segundo tratamento sobre a fração de ácidos nucleicos isolado^3,4. Observou-se que esta etapa complementar diminuíram a eficiência das sondas, provavelmente reduzindo a acessibilidade de lncRNA nas células. Portanto, o grau de reticulação por paraformaldeído tem de ser adaptadas tendo em conta a célula ou tecido tipo usado, a localização do lncRNA de interesse e a eficiência das sondas projetadas.

Enquanto a Lise das células, a cromatina é lançada no lisado e aumenta a sua viscosidade; é então necessário para destruir a cromatina pelo sonication para aumentar a fluidez das amostras e, consequentemente, facilitar a acessibilidade do oligonucleotide probes para o lncRNA de interesse. No entanto, sonication também irá destruir a RNA extraída com o lncRNA de interesse. É então importante para minimizar o tempo de sonication, de tal forma que enquanto eficiente reduz a viscosidade do lisado, também permite que a obtenção de RNA fragmentos com um comprimento compreendido entre 200-800 BP nota que o tempo de sonication será altamente depende tanto da quantidade e do tipo de tecido ou culturas de células utilizadas.

Em conclusão, o procedimento descrito aqui permite que em 2-3 dias a captura dos destinos de RNA de uma lncRNA desejado. Juntamente com o RT-qPCR, esses métodos permitirá à procura de uma associação específica e regulamento de um mRNA pelo lncRNA desejado como uma abordagem de candidato. Para uma abordagem de todo o genoma, experimentos suspenso de RNA podem ser analisados pela alta produtividade-a sequenciação do ARN que permite a recuperação de todos os RNAs associados a lncRNA desejada. Qualquer que seja a estratégia analítica escolhida, o procedimento suspenso do RNA deve fornecer novos conhecimentos significativos no Regulamento de RNA por lncRNAs.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetic streptavidin beads
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026
Gel electrophoresis apparatus	Advance	Mupid-One	Gel electrophoresis apparatus
Proteinase K	Sigma	P2308
RNA XS purification kit	Macherey-Nagel	740902	RNA purificationkit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse inhibitor
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	RNA purification
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf tube rotator
RNA to DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse transcription kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagent
Applied 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	qPCR apparatus
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit	Illumina	20020594	DNA library construction kit
Illumina NextSeq 500	Illumina	SY-415-1002	NGS system