Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Özet

Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.

Özet

Temel biyolojik ve Biyomedikal araştırmalarda kullanılan birçok hücre çizgiler aerobik ve anaerobik solunum bir birleşimi yoluyla enerji homeostazı korumak. Ancak, hangi hücresel enerji üretim yatay olarak her iki yolları katkıda ölçüde sürekli olarak gözden olduğunu. Dönüştürülmüş hücrelerin glikoz düzeyleri genellikle doyurarak kültürlü azalmış bir bağımlılık Oksidatif fosforilasyon artış substrat düzeyinde fosforilasyon tarafından telafi olduğu ATP üretimi için göster. Metabolik dengeyi bu vardiyada mitokondrial toksinlerin varlığı rağmen çoğalırlar hücreleri sağlar. Değiştirilmiş metabolik dengeyi dönüştürülmüş hücrelerin ihmal, bir ilaç tarama sonuçlarından beri misinterpreted potansiyel olarak mitotoxic etkileri modeli hücre satırları huzurunda yüksek glikoz kültürlü kullanarak algılanmayabilir konsantrasyonları. Bu protokol iki güçlü teknikleri, basınçlırespirometri ve hücresel ATP üretimi aerobik ve anaerobik katkılar nicel ve noninvaziv değerlendirilmesi için sağlayan Kalorimetre, eşleştirme açıklar. Aerobik ve anaerobik solunum Kalorimetre izlenen yolu ile olabilir ısı üretir. Bu arada, oksijen tüketim hızı ölçüm aerobik solunum ölçüde değerlendirebilirsiniz. Isı dağılımı ve oksijen tüketimi aynı anda ölçülen zaman calorespirometric oranı belirlenebilir. Deneysel olarak elde edilen değer o zaman teorik oxycaloric eşdeğer karşılaştırılabilir ve anaerobik solunum ölçüde değerlendirilecektir. Böylece, calorespirometry biyolojik sorular, ilaç geliştirme, mikrobiyal büyüme ve normoxic ve hipoksik koşullar altında temel bioenergetics de dahil olmak üzere geniş bir analiz etmek için benzersiz bir yöntem sağlar.

Giriş

Biyolojik sistemlerde, ısı-yayın veya entalpisi metabolizma sırasında genellikle değişimdir ya doğrudan izlenir (üzerinden doğrudan Kalorimetre) ya da dolaylı olarak O₂ tüketimi ve/veya CO₂ üretim (via basınçlırespirometri) aracılığıyla. Bu teknikler yalıtım modunda kullanıldığında, ne yazık ki, önemli bilgileri, hücre metabolizması anaerobik yolları katkısını gibi kaybolur. Calorespirometry ısı dağılımı ve solunum eş zamanlı ölçüm dayanır güçlü bir tekniktir. Calorespirometric iş öncü tam oksijenli memeli hücrelerinde anaerobik metabolizma incelenmiş ve eş zamanlı enerji homeostazı olmak dönüştürülmüş hücrelerin rağmen aerobik ve anaerobik yolları katkılarıyla gösterdi bir tam olarak oksijenli ortamı¹. Calorespirometry beri çok çeşitli biyolojik sorular uygulanmıştır. Bazı örnekler, düşük oksijen düzeyde hayvan enerji bilimi çalışma, solungaçları bivalvia, karasal organizmaların metabolizma ve organik toprak madde^2, mikrobiyal ayrışma herbisit ve östrojen etkileri ^{3 , 4 , 5 , 6}. Ayrıca calorespirometry sahip hücreleri⁷donma önce ortaya nasıl metabolik Önkoşullanma memeli dondurma geliştirir. Her yaklaşım, diferansiyel ve basınçlırespirometri, hücresel ve organizma bioenergetics ile ilgili bilgilerimizi bağımsız olarak artmıştır. Ancak, calorespirometry kullanılarak yanıtlanabilir temel biyolojik soru nispeten keşfedilmemiş kalır.

Hess'ın hukuk bir reaksiyon toplam entalpi değişimine ilk ve son durumlar arasındaki yolun bağımsız olduğunu belirtir. Örneğin, toplam entalpi değişimi biyokimyasal bir yol için yol içinde bütün tepkiler enthalpies değişikliği toplamı olduğunu. Kalorimetre gelişigüzel aerobik ve anaerobik yolları algılar hücresel ısı üretim ölçmek için gerçek zamanlı bir yaklaşım sunmaktadır. Bu hiçbir enerji sistem dışında deneysel ampul⁸duvarları üzerinden değiştirilir temel üzerine dayanır. Isı dağılımı bir değişiklik değişiklik tüm metabolik reaksiyonlar ampul içinde serbest entalpi eşittir. Böylece, negatif bir entalpi ısı kaybına yol sistemden karşılıklı olarak ilişkilendirir. Son dört yılda ayrıntılı araştırma katabolizma ve Anabolizma termodinamik peyzaj karakterize. Bu araştırma makaleleri arama terimleri "biyolojik" ve "tarafından Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Kütüphane, tıp (NLM) Ulusal Sağlık Enstitüleri (PubMed) adlı dizine gibi Kalorimetre" altında bulunan sürekli bir artış ile temsil edilir. Arama bundan önce 1970, toplam 27 yayınlar başvuru biyolojik Kalorimetre ortaya koymaktadır; Bu arada, 2016 yılında 546 yayınlar tekniği kullanılmıştır.

Isı üretim belirlemek için kurulan calorimetric yöntemlerdir. Ancak, daha fazla esneklik respirometric değer çözmek için verilir. Respirometric ölçüm O₂, CO₂, ya da hem O₂ ve CO₂bileşiminden oluşabilir. Ayrıca, O₂ veya CO₂ ölçüm optrodes, Clark-tip elektrotlar ve akort diyot lazer soğurma spektroskopisi^{7,9,10 dahil olmak üzere çeşitli teknikler tarafından gerçekleştirilebilir ,11}. CO₂ üretim birçok respirometric çalışma içinde değerli bir ölçü olsa da, kültürlü hücreler için orta bikarbonik tampon sistemi pH kontrolü^12,13kez kullanır. Bikarbonat sisteminde CO₂ ölçü komplikasyonları önlemek için tek respirometric parametre olarak O₂ hücre kültüründe calorespirometry için aşağıdaki iletişim kuralı kullanır.

Oksijen akı ölçme ile eşzamanlı, belirli respirometers ( Tablo malzemelerigörmek) mitokondriyal işlev detaylı değerlendirmeler için tasarlanmıştır. Substrat-uncoupler-inhibitörü-titrations (SUIT) protokolleri iyi kurulmuş ve membran potansiyeli veya reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu¹⁴ölçmek için tasarlanmış deneyler ile uyumlu değildir. Calorespirometry sağlam hücre için sunulan Protokolü karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve F₀F₁-ATP sentaz inhibitörü oligomycin gibi kimyasal uncouplers getirilmesi ile uyumludur. FCCP ek, oksijen tüketimi mitokondrial performans¹⁵potansiyel tedavi etkisini değerlendirmek yararlı olan ATP üretimden edilişi olabilir. Ayrıca, oligomycin eklenmesi sızıntı solunum ölçüde aydınlatır. Böylece, calorespirometry sırasında gerçekleştirilen respirometric ölçümleri mitokondrial fizyolojisi daha fazla aydınlatmak için tasarlanmış kapsamlı iletişim kuralları ile uyumludur.

Isı dağılımı ve oksijen akışı eş zamanlı ölçüm calorespirometric (CR) oranı hesaplanması için sağlar. Bu oran, daha sonra Thornton's sabit veya-430 bağlı olarak hücre satır veya doku ilgi-480 kJ mol^-1 için ve desteklenmiştir karbon yüzeyler^1, arasında değişmektedir teorik oxycaloric eşdeğer, karşılaştırılır ¹⁶. böylece daha olumsuz bir CR oranı artan anaerobik yolları genel olarak metabolik aktivite katkıları ortaya koymaktadır. Örneğin, rutin kas doku solunum çalışmalarının etkin performans olmadan CR oranı-448-468 kJ mol-1'e hangi teorik oxycaloric eşdeğer^17,18aralıkta arasında değişmektedir. Bu arada, memeli kanser hücreleri glikoz yüksek orta kültürlü glikoliz aşağıdaki gelişmiş laktik asit fermantasyonu görüntülemek ve nispeten düşük mitokondrial nişan¹⁹. Bu fenotip anaerobik yolları daha olumsuz CR oranları^{1,7tarafından belirtildiği gibi hücresel metabolizma artan katılımı gösteren-800 kJ mol-1,-490 sonuçlarını CR oranları aralığı içinde 16,20}.

Ticari ve kar amacı gütmeyen hücre ve doku distribütörler Şu anda insanların yaklaşık 4.000 hücre hatları ile 150 türler'den fazla teklif hücre hatları türetilmiş. Ölümsüzleştirdi hücre satırlarını hızlı bir şekilde birçoğu mitokondrial fonksiyonları ile doğrudan veya dolaylı olarak engel olabilecek potansiyel therapeutics toksisitesi değerlendirmek için uygun araçlardır. Dönüştürülmüş hücrelerin uyuşturucu tarama sırasında kullanarak sınırlı değeri kısmen Warburg etkisi nedeniyle, birçok kanser damgasını olabilir. Çoğu zaman, kanser ATP substrat düzeyinde fosforilasyon oluşturmak ve tam aerobik koşullar¹⁹altında mitokondri çekici olmadan laktat üretim ile redoks dengesini korumak. İlaç geliştirme Rootkitler pahalı ve verimsiz, yaklaşık 8 9 bileşikler için başaramadığı Pazar onay²¹insan klinik çalışmalarda test dışarı ile. Potansiyel tedavi nedeniyle düşük sitotoksisite başlangıç tarama hücre hatlarında geçebilir, bu bazı bu bileşiklerin mitotoxic vardır mümkündür. Nasıl bu toksinler Warburg etkisi görüntülenmez primer hücre enerji dengede zarar olabilir algılamak için uygun yöntemi kritik bilgi kez, tedavi edici gelişme erken aşamalarında darboğaz aşırı baktı.

Calorespirometry biyolojik örnekleri, hücre ve dokulara da dahil olmak üzere çeşitli metabolik etkinliğini çözümlemeye pratik, invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Sunulan Protokolü özünü bir uygulama yelpazesi ile uyumludur. Bir sorun, ancak, tespit edilmiştir. Ölümsüzleştirdi hücreleri genellikle potansiyel mitotoxins^{22hücrelere duyarlı için Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) enerji üretiminde katkısını artırmak için galaktoz ile takıma glikoz-Alerjik ortamda kültürlü, 23}. Bu metabolik yeniden programlama örnekleri Kalorimetresi¹⁵tarafından kullanılan paslanmaz çelik ampul yerleştirildiğinde analiz belirsiz görünüyor. Birkaç saat için yüksek metabolik faaliyete girişme hücreleri glikoz ortamda kültürlü devam. Bu arada, galaktoz ortamda kültürlü hücreleri ısı üretim yerleri erken deneysel zaman puan için sınırlı ölçümler yaparak ampul içinde 30 dk içinde azaltın. Bu davranış, ne yazık ki, onların hücresel proliferasyonu değerlendirme imkanı engeller. Belirli bu sınırlamaya rağmen çoğu uygulama calorespirometric analizi ile uyumludur ve bu yaklaşımla ayrıntılı metabolik bilgi elde edilebilir.

Protokol

1. hücre kültürü

1. İnsan hepatosellüler karsinom (HepG2) Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve ek yüzeylerde (10 mM glikoz, 2 mM glutamin ve 1 mM pyruvate) içeren hücrelerde korumak (%5 CO₂ , % 95 hava, nem oranı %100).
   Not: Yukarıdaki DMEM formülasyonu DMEM basınçlırespirometri ve diferansiyel için sonraki adımda başvurulduğunda kullanın.
2. 1 x 10⁶ hücre plaka başına 100 mm Kültür plaka ve alt kültür onları her 7 gün % 90 confluency ulaşan önce hücreleri ve orta her 3-4 gün yenilemek.
3. Hücreleri % 60-80 birleşmesi olduğunuzda deneyler gerçekleştirin.

2. Respirometer ve Kalorimetresi hazırlanması

1. Damlalıklı DMEM 2,2 mL respirometer odasına tıpa tam olarak yerleştirin ve optimum oksijen difüzyon--dan soluduğumuz hava orta için izin vermek için tıpa spacer aracıyla ayarlayın.
2. Oksijen konsantrasyonu (mavi İzle) ve oksijen akı (kırmızı izle) stabildir kadar sürekli olarak 37 ° C'de karıştırın. Respirometer'ın yazılım ortamının deneyde kullanılan oksijen çözünürlük için hesap için programlanmıştır olun.
   Not: Farklı oksijen çözünürlük katsayıları farklı ortama sahip (Örneğin, DMEM 0,92 =).
3. Stabilizasyon odası açık DMEM içinde oksijen konsantrasyonunun sonra oksijen konsantrasyonu izleme istikrarlı bir bölümünü seçmek ve % 100 hava doygunluk için kalibre.
4. %0 oksijen oksijensiz odasında olmadığı durumlarda oksijen konsantrasyonu izleme istikrarlı bir bölümünü seçmek için kalibre edin. 20 µL titrasyon 230 mM sodyum dithionite veya tüm oksijen bir deney sonunda biyolojik örnek tarafından tüketilen sonra sonra bu adımı gerçekleştirin.
5. Respirometer % 100 hava kalibrasyonu sonra tıpa kapatın ve hava kabarcığı yok odasında mevcut olduğundan emin olun.
   Not: oksijen akı hafif bir artış kapalı odasında polarographic oksijen sensörü (POS) oksijen kısmi basıncı ölçmek için oksijen tüketir tespit edilecektir.
6. ~ 10 dk sonra kapalı olmak tıpa, istikrarlı oksijen akı gözlemleyerek respirometer HepG2 hücreler için hazır olduğundan emin olun.
   Not: burada kullanılan Kalorimetresi paslanmaz çelik ampul kullanır ve bir referans olarak kullanmak üzere bir ampul gerektirir.
7. 2,5 mL H₂O (dH₂O) [eşit birim örnekleri (adım 4) olarak] Kalorimetresi başvuru ampul ekleyin ve pense kullanarak kap sıkın. Bir hava akımı ile mühürlü ampul temiz ve yavaşça Kalorimetresi referans kanal 1 konumuna ampul indirin. Biyolojik örnek hazırlanan kadar 1 konumunda kalır.

3. HepG2 hücre basınçlırespirometri ve hazırlık Kalorimetre

1. Respirometer ve Kalorimetresi hazırlanan ve kalibre onaylayın. Sıcak DMEM ve tripsin 37 ° c su banyosu içinde.
2. Bir taze 100-mm plaka ve yer orta CO₂ ve sıcaklık için denge sağlamak için kuluçka DMEM ekleyin.
   Not: uygun birim kullanılacak ampul sayısına bağlıdır Bu orta Kalorimetre deneme için kullanılacaktır.
3. Bir ters ışık mikroskobu ile onaylamak hücreleri 60-%80 birleşmesi, 100 mm plaka 2 x 10 mL ile Oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz (PBS) sonra yıkayın.
4. 37 ° C tripsin 3 mL hücreleri 100-mm plakasına eklemek ve onları 7-10 dk 37 ° c hücre kültür kuluçka için kuluçkaya. Tripsin 37 ° C DMEM 3 mL ile etkisiz hale getirin ve yavaşça o ~ 20 kez 5 mL damlalıklı ile pipetting tarafından askıya alma.
5. Resuspended hücre DMEM ve tripsin 6 mL steril 15 mL konik tüp içine aktarmak ve hücre Pelet bozmadan sıvı 5 dk 175 x g. az kaldırmak için santrifüj kapasitesi.
6. Hücre Pelet ~ 5 ml damlalıklı hücreler iyice emin olmak için-yeterince ayrışmış birbirinden ve DMEM resuspend.
7. ~ 100 µL iyi karışık örnek kaldırmak ve hücrelerin toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre tüm 8 alanları kullanan bir kapsamlı hücre sayısı gerçekleştirin. Sonra hücrelerin resuspension için ses ~ 2 x 50 µL başına 10⁶ hücre oluşturmak için hesaplamak.
   Not: Bu 2 x 10⁶ hücre respirometer ile en az orta yerinden her odası eklenir garanti eder.
8. 175 x g. Resuspend, 5 min için hücreleri hesaplanan hacmine DMEM adım 3.7 Pelet santrifüj kapasitesi.
9. Hacimli (Bu ~ 50 µL olmalıdır) respirometer odasında başına 2 x 10⁶ hücre enjekte etmek için gerekli belirlemek için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Respirometric ölçüm için hücreleri buza hazır kadar saklayın.
10. Konsantre hücre örneği buza olmakla birlikte, 1 x 10⁵ hücre/mL Kalorimetre için bir konsantrasyon üretmek için gerekli seyreltme belirlemek.
11. Örnek karıştırın ve ~ 3 mL 1 x 10⁵ hücre/mL DMEM, hücrelerin her ampul için hazırlanın.
    Not: numune dilüsyonu için kullanılan DMEM 3.3 adımda hazırlanan dengelenmiş orta olmalıdır.

4. Kalorimetre

1. Kalorimetresi bilgisayara doğru bağlandığından ve µW calorimetric sinyal gözlemlenebilir ve kararlı olduğundan emin olun.
2. Ampul kapağı ve orta gaz difüzyon için izin vermek için 1 x 10⁵ hücre/mL (~2.5 x 10⁵ hücreleri) her ampul yeterli hava sağlamak için hücrelerin 2.5 mL arasındadır ekleyin.
3. Hemen pense kullanarak kap sıkın. Dış herhangi bir enkaz kaldırmak için hava akımı kullanarak kapalı ampul temiz ve yavaşça Kalorimetresi 1 konumlandırmak için ampul indirin. Yazmak zaman ampul 1 konumuna indirilir.
4. Ampul pozisyonu 1 15 dakika oturup izin.
   Not: Bu 15 dk süresince, respirometer (5. adım) enjekte edilir hücrelerdir. Bu CR oranı belirlendiğinde zaman aynı aralığı ısı üretimi ve oksijen tüketimi için kullanılmasını sağlar.
5. 1 konumundaki 15 dk sonra yavaşça başvuru ve örnek ampul pozisyonu 2 için indirin. Zaman ampul indirdi ve ölçmek için en az 30 dakika kayıt.

5. basınçlırespirometri

1. Ampul Kalorimetresi 1 konumunda olduğu 15 dk aralığında respirometric çalışmaları başlar.
2. Hücre örnek homojen bir çözüm sağlamak ve enjekte pipetting tarafından mix iyice < 50 µL ~ 2 x 10⁶ hücreler/odası son bir konsantrasyon için respirometer her odası içine hücre örneği. Hücreleri respirometer enjekte edilir zaman kaydetmek.
3. Enjeksiyon sonra HepG2 hücreler sürekli olarak 37 ° C'de kıpırdandı Oksijen akışı ve oksijen konsantrasyonu sürekli bir düşüş her iki sabitleme için en az 20-30 dakika bekleyin.
4. Ekranın sağ O₂ akı V başına sekmesinde seçin ve oksijen akı istikrarlı bir bölümünü vurgulayın. İşaretleri, sonra istatistikler ve O₂ akı V başına kayıt verilerini seçin. Bu kayıt CR oranı hesaplanmasında kullanılır.
   Not: 5.5 ve 5.6 isteğe bağlı adımlardır. Sızıntı solunum ve maksimal edilişi solunum oligomycin ve FCCP titrations tarafından açıklanacak.
5. 4 mg/mL oligomycin 1 µL her odanın içine enjekte etmek ve izin ~ oksijen akı sabitleme 10 dakikadır. Oligomycin eklenmesinden sonra oksijen akı izleme istikrarlı bir kısmını vurgulayarak 5,4 içinde gerçekleştirilen numaralı adımları izleyerek kayıt istikrarlı sızıntı Solunum oranı.
6. 2-µL enjeksiyonları 0.2 bırakmak için oksijen akı sabitleme sonra her enjeksiyon mm FCCP her odasına titre. Maksimal akı ulaşılıncaya kadar titrations sonraki FCCP titrasyon hafif bir düşüş tarafından belirtildiği şekilde devam edin. Kayıt sırasında maksimum akı istikrarlı Solunum oranı.

6. Calorespirometric oranı hesaplanması

1. Son hücre sayısı itibariyle hazırlanan numunelerin gerçekleştirmek ~ 1 x 10⁵ hücre/mL ampul (2.5 mL) eklendi hücreleri toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre tüm 8 alanları kullanan.
2. Bir süre için kayıt ölçümleri Kalorimetresi ve en istikrarlı sinyalleri aynı zamanlarda mevcut respirometer belirlemek. Ampul 2 ve respirometer içine hücre enjeksiyon zaman konumuna düşürdü kaydedilen saat başvuru.
3. Isı üretim adım ve hızlı µW/milyon hücre olarak belirlenen zamanda saygın ampul için ısı çıktısını görüntüleme izleme üzerinde imleci yerleştirerek kaydedin. Oksijen tüketimi veri toplamak ve sağlamak pmol O₂ s^-1 milyon hücre x x olarak ifade edilir.
4. CR oranı hesaplamak için önce µW kJ/s için dönüştürmek ve sonra O₂/s kJ/mol O₂ifade edilen CR oranı elde etmek için mol üzerinde kJ/s bölebilirsiniz. Not: CR oranı kJ/mol O₂içinde sunulur.
   (bkz. ek dosya 1)

Sonuçlar

Calorespirometric ölçümler tekrarlanabilirlik doğru ve tutarlı numune hazırlama üzerinde bağlıdır. Tabakları büyümüş, hücre sayımları topaklanma nedeniyle yanlış olabilir gibi hücre kültürü hazırlanan örnekleri kullanılmamalıdır. Ayrıca, düşük ısı akışı sınırlı substrat difüzyon olmalı hücrelerdeki nedeniyle oluşabilir. Bu nedenle, yapışık hücreleri kullanırken, % 60-80 arasında confluency ile bir kalıbı seçin ve orta deneme önce 24 saat değiştirmek için çok öne...

Tartışmalar

Kantitatif metabolik aktivite aerobik ve anaerobik yolları katkıları değerlendirmek ve hücresel enerji akı bileşik bir görünümünü elde etmek için calorespirometry hedefidir. Bu ısı dağılımı ve oksijen akı hesaplanan CR oranı eşdeğer teorik oxycaloric ile karşılaştırılması ardından eşzamanlı bir ölçü tarafından gerçekleştirilir. Birkaç önemli adımlar için tekrarlanabilir ve güvenilir verileri dikkate alınmalıdır. Steril, sağlıklı hücre kültürü bakımından önemlidir. K...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium