Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Riepilogo

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Abstract

Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l'omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell'equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l'alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l'accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l'entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all'equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.

Introduzione

Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O₂ e/o produzione di CO₂ (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi completamente ossigenate e dimostrato contributi simultanei dei percorsi sia aerobici che anaerobici di omeostasi energetica nonostante le cellule trasformate in un ambiente completamente ossigenato¹. Calorespirometry da allora è stato applicato a una vasta gamma di domande biologiche. Alcuni esempi includono lo studio dell'animale energetica a bassi livelli di ossigeno, gli effetti di erbicidi e di estrogeno sulle lamelle di molluschi bivalvi, il metabolismo degli organismi terrestri e la decomposizione microbica di materia organica del suolo^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. Inoltre, calorespirometry ha rivelato come metabolica precondizionamento prima del congelamento migliora la crioconservazione di mammiferi celle⁷. Ogni approccio, sia calorimetria e manometrica, indipendentemente ha aumentato la nostra conoscenza della bioenergetica cellulare e organismica. Tuttavia, fondamentali domande biologiche che possono essere risolte attraverso l'uso di calorespirometry rimangono relativamente inesplorate.

Leggi di Hess afferma che la variazione di entalpia totale di una reazione è indipendente del pathway tra gli stati iniziali e finali. Ad esempio, la variazione di entalpia totale per una via biochimica è la somma della variazione di entalpie di tutte le reazioni all'interno della via. Calorimetria offre un approccio in tempo reale per misurare la produzione di calore cellulare, che rileva indiscriminatamente vie sia aerobiche che anaerobiche. Questo si basa sul fondamento che nessuna energia viene scambiata nel sistema tranne attraverso le pareti della fiala sperimentale⁸. Un cambiamento nella dissipazione del calore è uguale al cambiamento di entalpia rilasciato da tutte le reazioni metaboliche in fiala. Così, un negativo entalpia correla ad una perdita di calore dal sistema. Ricerche approfondite negli ultimi quattro decenni ha caratterizzato il paesaggio termodinamico di anabolismo e catabolismo. Questo è rappresentato da un aumento costante nella ricerca articoli trovati sotto i termini di ricerca "biologici" e "calorimetria" come indicizzato dallo Stati Uniti National Library di medicina (NLM) presso il National Institutes of Health (PubMed). La ricerca rivela che prima del 1970, un totale di 27 pubblicazioni riferimento biologico calorimetria; nel frattempo, nel 2016 da solo, 546 pubblicazioni utilizzato la tecnica.

Metodi calorimetrici sono ben stabiliti per determinare la produzione di calore. Tuttavia, una maggiore flessibilità è concesso per la risoluzione il valore respirometriche. La misurazione respirometriche può consistere di O₂, CO₂, o O₂ e CO₂. Ulteriormente, la misura di O₂ o CO₂ può essere compiuta mediante varie tecniche, tra cui optrodes, Clark-tipo di elettrodi e diodo tunable laser assorbimento spettroscopia^{7,9,10 ,11}. Mentre la produzione di CO₂ è una metrica preziosa in molti studi respirometriche, il supporto per le cellule coltivate spesso utilizza un sistema di buffer di bicarbonic per controllo pH^12,13. Per evitare complicazioni di CO₂ misura nel sistema di bicarbonato, il seguente protocollo per la calorespirometry delle cellule nella cultura utilizza O₂ come unico parametro respirometriche.

In concomitanza con cambiamento continuo dell'ossigeno di misurazione, alcuni respirometers (Vedi Tabella materiali) sono progettati per valutazioni dettagliate della funzione mitocondriale. Substrato-disaccoppiatore-inibitore-titolazioni (SUIT) protocolli sono ben stabiliti e sono compatibili con gli esperimenti progettati per misurare la membrana potenziale o reattive dell'ossigeno (ROS) specie formazione¹⁴. Il protocollo presentato per calorespirometry di cellule intatte è compatibile con l'introduzione della chimica uncouplers come Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP) e l'inibitore oligomycin di F₀F₁-ATP sintasi. Attraverso l'aggiunta di FCCP, consumo di ossigeno può essere disgiunto dalla produzione di ATP, che è utile per valutare l'impatto di potenziali terapie su mitocondriale peformance¹⁵. Inoltre, l'aggiunta di oligomycin si illumina nella misura della respirazione di perdita. Così, le misure respirometriche eseguite durante calorespirometry sono compatibili con protocolli vasti progettati più ulteriormente per delucidare fisiologia mitocondriale.

La misura simultanea di dissipazione di calore e di cambiamento continuo dell'ossigeno consente il calcolo del rapporto calorespirometric (CR). Questo rapporto viene quindi confrontato con costante di Thornton o il oxycaloric teorico equivalente, che spazia tra -430 a-480 kJ mol^-1 a seconda della varietà di cellula o tessuto di interesse e il carbonio completati substrati^{1, 16}. quindi, un rapporto più negativo di CR rivela maggiori contributi da vie anaerobiche per complessivo activity. Ad esempio, il rapporto di CR per la respirazione dei tessuti muscolo routine senza l'attiva delle prestazioni di lavoro varia da-448 a-468 kJ mol-1 che è all'interno della gamma del oxycaloric teorico equivalente^17,18. Nel frattempo, le cellule tumorali dei mammiferi coltivate in medium che è ad alto contenuto di glucosio visualizzare fermentazione acido lattico avanzata seguendo la glicolisi e relativamente basso coinvolgimento mitocondriale¹⁹. Questo risultati di fenotipo in rapporti di CR nell'intervallo di-490 a-800 kJ mol^-1, dimostrando una maggiore partecipazione delle vie anaerobiche nel metabolismo cellulare come indicato da più negativa CR rapporti^{1,7, 16,20}.

Distributori di cellule e tessuti sia commerciali che senza scopo di lucro attualmente offerta linee cellulari provenienti da oltre 150 specie, con quasi 4.000 linee cellulari derivano da esseri umani. Linee cellulari immortalizzate sono strumenti utili per valutare rapidamente la tossicità delle terapie potenziali, molte delle quali possono interferire direttamente o indirettamente con funzioni mitocondriali. Utilizzando cellule trasformate durante lo screening di stupefacenti può essere di limitato valore predittivo in parte a causa dell'effetto di Warburg, un segno distintivo di molti cancri. Spesso, i cancri generano ATP da fosforilazione del substrato-livello e mantengono l'equilibrio redox attraverso la produzione di lattato senza impegnarsi pienamente il mitocondrio sotto condizioni aerobiche¹⁹. Sviluppo farmaceutico è notoriamente costoso ed inefficiente, con circa 8 su 9 composti provati nei test clinici umani non riuscendo a ottenere l'approvazione del mercato²¹. Mentre terapeutica potenziale può passare uno screening iniziale a causa della bassa citotossicità nelle linee cellulari, è possibile che alcuni di questi composti sono mitotoxic. Senza un metodo adatto per rilevare come queste tossine possono alterare l'equilibrio di energia nelle cellule primarie che non vengono visualizzati l'effetto Warburg, informazione critica è spesso sovra-sembrava, strozzature sviluppo terapeutico nelle fasi iniziali.

Calorespirometry è un approccio pratico, non invadente per analizzare l'attività metabolica in una varietà di campioni biologici, compreso le cellule e tessuti. Il nucleo del protocollo presentato è compatibile con una gamma di applicazioni. Una complicazione, tuttavia, è stata identificata. Cellule immortalizzate sono spesso coltivate in un medium privo di glucosio, completato con galattosio per aumentare il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per la produzione di energia, al fine di sensibilizzare le cellule a potenziali mitotoxins^{22, 23}. Questa riprogrammazione metabolico sembra oscurare analisi quando i campioni vengono inseriti nelle fiale di acciaio inossidabile utilizzate dal calorimetro¹⁵. Le cellule coltivate in un medium del glucosio continuano ad impegnarsi in alta attività metabolica per diverse ore. Nel frattempo, le cellule coltivate in medium galattosio diminuiscono la produzione di calore entro 30 min della loro collocazione in fiala, effettuare misure limitate ai punti di tempo sperimentale in anticipo. Questo comportamento, purtroppo, ostacola la possibilità di valutare la loro proliferazione cellulare. Nonostante questa limitazione specifica, la maggior parte delle applicazioni sono compatibili con l'analisi calorespirometric e dettagliate informazioni metaboliche possono essere ottenute attraverso questo approccio.

Protocollo

1. coltura cellulare

1. Mantenere cellule epatocellulari umane di carcinoma (HepG2) nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ulteriori substrati (10 millimetri di glucosio, glutammina 2 mM e 1 mM piruvato) a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule (5% CO₂ , aria di 95%, 100% di umidità).
   Nota: Utilizzare la precedente formulazione di DMEM quando DMEM viene fatto riferimento nei passaggi successivi per manometrica e calorimetria.
2. Piastra le cellule a 1 x 10⁶ cellule per piastra di coltura di 100 mm e sottocultura loro ogni 7 giorni o prima di raggiungere confluency di 90% e rinnovare il mezzo ogni 3-4 giorni.
3. Eseguire gli esperimenti quando le cellule sono 60-80% confluenti.

2. preparazione del respirometro e calorimetro

1. Dispensare 2,2 mL di DMEM nell'alloggiamento respirometro, mettere il tappo completamente e regolare con lo strumento di tappo distanziale per consentire per diffusione ottimale dell'ossigeno dall'aria al mezzo.
2. Mescolate continuamente a 37 ° C fino a quando la concentrazione di ossigeno (traccia blu) e il flusso di ossigeno (traccia rossa) sono stabili. Garantire che software di respirometro è programmato per contabilizzare la solubilità dell'ossigeno del medium usato nell'esperimento.
   Nota: Diversi media hanno coefficienti di solubilità di ossigeno differente (ad es., DMEM = 0,92).
3. Dopo la stabilizzazione della concentrazione di ossigeno in DMEM con la camera aperta, selezionare una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno e calibrare per saturazione dell'aria di 100%.
4. Calibrare per 0% ossigeno selezionando una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno quando l'ossigeno non è presente in aula. Eseguire questo passaggio dopo titolazione di µ l 20 di 230 mM Ditionito di sodio o dopo tutto l'ossigeno viene consumato da campione biologico alla fine di un esperimento.
5. Dopo la calibrazione con 100% aria del respirometro, chiudere il tappo e assicurarsi che non ci sono bolle siano presenti in aula.
   Nota: un leggero aumento nel cambiamento continuo dell'ossigeno verrà rilevato in camera chiusa come il Sensore polarografico di ossigeno (POS) consuma ossigeno al fine di misurare la pressione parziale di ossigeno.
6. Dopo ~ 10 min del tappo chiuso, confermare che il respirometro è pronto per cellule HepG2 osservando un flusso di ossigeno stabile.
   Nota: Il calorimetro usato qui utilizza Ampolle in acciaio inox e richiede una fiala da utilizzare come riferimento.
7. Aggiungere 2,5 mL di H₂O (dH₂O) [volume uguale come i campioni (passaggio 4)] per la fiala di riferimento del calorimetro e serrare il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata con flusso d'aria e abbassare lentamente la fiala alla posizione 1 nel canale di riferimento del calorimetro. Rimangono nella posizione 1 fino a quando il campione biologico viene preparato.

3. preparazione delle cellule HepG2 Respirometry e Calorimetria

1. Confermare che il respirometro e calorimetro sono preparati e calibrati. Caldo DMEM e tripsina a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Aggiungere DMEM a un fresco 100 mm di spessore e posto nell'incubatrice per consentire l'equilibrazione del mezzo per CO₂ e la temperatura.
   Nota: Questo mezzo verrà essere utilizzato per l'esperimento di calorimetria, così il volume appropriato dipende dal numero di fiale che verrà utilizzato.
3. Confermare con un microscopio ottico invertito che le cellule sono al 60-80% confluenti, poi lavare il 100 mm piastra 2 x 10 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) e temperatura ambiente.
4. Aggiungere 3 mL della tripsina di 37 ° C per la piastra di 100 mm delle cellule e loro Incubare per 7-10 min a 37 ° C nell'incubatore di cultura cellulare. Neutralizzare la tripsina con 3 mL di 37 ° C DMEM e sospendere pipettando delicatamente e ~ 20 volte con una pipetta da 5 mL.
5. Trasferire i 6 mL di sedimento cellule in DMEM e tripsina in una provetta conica sterile di 15 mL e si centrifuga per 5 min a 175 x g. rimuovere il liquido senza disturbare il pellet cellulare.
6. Risospendere il pellet cellulare in ~ 5 mL di DMEM e dispensare accuratamente per garantire le cellule sono sufficientemente dissociato da altra.
7. Rimuovere ~ 100 µ l del campione omogeneizzato ed eseguire un conteggio accurato delle cellule utilizzando 8 tutti i campi su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule. Quindi calcolare il volume per la risospensione delle cellule al fine di generare ~ 2 x 10⁶ cellule per 50 µ l.
   Nota: Questo garantisce che 2 x 10⁶ cellule vengono aggiunti a ciascuna camera del respirometro con minimo medio dislocamento.
8. Centrifugare le cellule per 5 min a 175 x g. Risospendere il pellet nel volume calcolato di DMEM dal punto 3.7.
9. Eseguire un conteggio delle cellule per determinare il volume necessario per iniettare 2 x 10⁶ cellule per camera nel respirometro (questo dovrebbe essere ~ 50 µ l). Conservare le cellule per la misurazione respirometriche su ghiaccio fino al momento.
10. Mentre il campione concentrato cellulare è sul ghiaccio, determinare la diluizione necessaria per produrre una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/mL per la calorimetria.
11. Mescolare bene il campione e preparare ~ 3 mL delle cellule a 1 x 10⁵ cellule/mL in DMEM per ogni fiala.
    Nota: Il DMEM utilizzato per la diluizione del campione dovrebbe essere il mezzo equilibrato preparato al punto 3.3.

4. calorimetria

1. Assicurarsi che il calorimetro è collegato al computer e il segnale calorimetrico in µW è osservabile e stabile.
2. Aggiungere 2,5 mL delle cellule a 1 x 10⁵ cellule/mL (~2.5 x 10⁵ celle) per ogni fiala, garantire aria sufficiente è tra il coperchio della fiala ed il mezzo per consentire per la diffusione del gas.
3. Immediatamente stringere il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata, utilizzando il flusso d'aria per rimuovere eventuali detriti esterni e abbassare lentamente la fiala in posizione 1 del calorimetro. Registrare il tempo che la fiala è abbassata in posizione 1.
4. Consentire la fiala per sedersi nella posizione 1 per 15 min.
   Nota: Durante questo periodo di 15 minuti, le cellule sono deve essere iniettato in respirometro (passo 5). Questo assicura che lo stesso intervallo di tempo viene utilizzato per la produzione di calore e consumo di ossigeno quando il rapporto di CR è determinato.
5. Dopo 15 min in posizione 1, abbassare lentamente fiale del campione sia il riferimento alla posizione 2. Registrare il tempo che le fiale sono state abbassate e misura per almeno 30 min.

5. respirometry

1. Durante l'intervallo di 15 minuti in cui la fiala è alla posizione 1 nel calorimetro, iniziano gli studi respirometrici.
2. Mescolare bene il campione di cellule pipettando per garantire una soluzione omogenea e iniettare < 50 µ l di campione cellulare in ogni camera del respirometro per una concentrazione finale di ~ 2 x 10⁶ cellule/camera. Registrare il tempo, che le cellule vengono iniettate il respirometro.
3. Dopo l'iniezione, le cellule HepG2 sono continuamente agitate a 37 ° C. Attendere almeno 20-30 min per entrambi una stabilizzazione del flusso ossigeno ed una costante diminuzione della concentrazione di ossigeno.
4. Selezionare la scheda flusso di₂ O a V sulla destra dello schermo ed evidenziare una parte stabile del flusso di ossigeno. Selezionare indicatori, quindi le statistiche e dati del record per flusso₂ O a V. Questa registrazione verrà utilizzata nel calcolo del rapporto CR.
   Nota: Passaggi 5.5 e 5.6 sono facoltativi. Perdita di respirazione e la respirazione disgiunto massima sarà rivelati di titolazioni di oligomycin e FCCP.
5. Iniettare 1 µ l di oligomycin 4mg/mL in ogni camera e consentire ~ 10 min per la stabilizzazione del flusso di ossigeno. Tasso di respirazione di perdita stabile record eseguendo i passaggi eseguiti in 5.4 mettendo in evidenza una parte stabile della traccia del flusso di ossigeno dopo l'aggiunta di oligomycin.
6. Titolare le iniezioni di 2-µ l di 0,2 mM FCCP in ogni camera, consentendo per la stabilizzazione di flusso di ossigeno dopo ogni iniezione. Continuano le titolazioni fino a quando il flusso massimo è raggiunto, come indicato da un lieve calo la successiva titolazione FCCP. Registrare il tasso di respirazione stabile durante il flusso massimo.

6. calcolo del rapporto di Calorespirometric

1. Eseguire un conteggio finale delle cellule dei campioni preparati a ~ 1 x 10⁵ cellule/mL utilizzando 8 tutti i campi di un emocitometro per determinare il numero totale di celle aggiunte alla fiala (2,5 mL).
2. Determinare un tempo per i valori di misurazione dal calorimetro e respirometro in cui sono presenti a volte identici segnale stabile. Riferimento che il tempo registrato quando la fiala è stata abbassata a posizione 2 e il tempo di iniezione delle cellule nel respirometro.
3. Registrare la produzione di calore posizionando il cursore sopra la traccia visualizzare l'output di calore per la fiala rispettata al momento determinato nel passaggio ed espressa come µW/milioni di cellule. Raccogliere dati sul consumo di ossigeno e garantire che si esprime come pmol O₂ x s^-1 1x milioni di cellule.
4. Per calcolare il rapporto di CR, prima convertire µW in kJ/s e quindi dividere kJ/s per mol di O2/s per ottenere il rapporto CR espresso in kJ/mol O₂. Nota: Il rapporto di CR è presentato in kJ/mol O₂.
   (Vedi 1 FIle supplementari)

Risultati

La riproducibilità delle misurazioni calorespirometric dipende da una preparazione del campione corretto e coerente. Campioni preparati da coltura cellulare non devono essere utilizzati se le piastre sono invasi, come i conteggi delle cellule possono diventare imprecisi a causa di agglutinamento. Inoltre, flussi di calore ridotta a causa della diffusione di substrato limitato nelle cellule ragruppate possono verificarsi. Pertanto, quando si utilizza cellule aderenti, è fondamentale per selezionare un piatto con la conf...

Discussione

L'obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium