Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Resumo

Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

Resumo

Muitas linhas de celulares usadas em pesquisa biológica e biomédica básica mantenham a homeostase de energia através de uma combinação da respiração aeróbia e anaeróbia. No entanto, na medida em que ambos os caminhos contribuem para a paisagem da produção de energia celular é consistentemente ignorada. Células transformadas cultivadas em saturando os níveis de glicose frequentemente mostram uma diminuição da dependência na fosforilação oxidativa para a produção de ATP, que é compensada por um aumento no nível de substrato fosforilação. Essa mudança no equilíbrio metabólico permite que as células a proliferar apesar da presença de toxinas mitocondriais. Em negligenciar a poise metabólica alterada de células transformadas, resultados de um rastreio farmacêutico podem ser mal interpretados desde o potencialmente mitotoxic efeitos podem não ser detectados usando linhas de célula modelo cultivadas na presença de glicose alta concentrações. Este protocolo descreve o emparelhamento de duas técnicas poderosas, respirometria e calorimetria, que permite a avaliação quantitativa e não-invasiva de contribuições aeróbias e anaeróbias para produção de ATP celular. Respiração aeróbia e anaeróbia gera calor, que pode ser monitorado através de calorimetria. Enquanto isso, a medição da taxa de consumo de oxigênio pode avaliar o grau de respiração aeróbia. Quando tanto a dissipação de calor e consumo de oxigênio são medidos simultaneamente, a relação de calorespirometric pode ser determinada. O valor obtido experimentalmente em seguida pode ser comparado com a oxycaloric teórico equivalente e a extensão da respiração anaeróbica pode ser julgada. Assim, o calorespirometry fornece um método exclusivo para analisar uma ampla gama de questões biológicas, incluindo o desenvolvimento de drogas, crescimento microbiano e bioenergética fundamental sob condições de hipóxicos e normoxic.

Introdução

Em sistemas biológicos, a libertação de calor ou entalpia de mudança durante o metabolismo normalmente é monitorado ou diretamente (via directa calorimetria) ou indiretamente através do consumo de O₂ e/ou produção de CO₂ (através de respirometria). Infelizmente, quando estas técnicas são utilizadas em isolamento, informação crítica é perdida, tais como a contribuição das vias anaeróbias para o metabolismo celular. Calorespirometry é uma técnica poderosa que se baseia na medição simultânea de dissipação de calor e a respiração. Calorespirometric trabalho pioneiro investigou o metabolismo anaeróbico em células de mamíferos totalmente oxigenados e demonstrado contribuições simultâneas das vias aeróbias e anaeróbias, a homeostase de energia, apesar das células transformadas em uma ambiente totalmente oxigenado¹. Calorespirometry desde que foi aplicado a uma grande variedade de questões biológicas. Alguns exemplos incluem o estudo da energética animal em baixos níveis de oxigênio, os efeitos do herbicida e do estrogênio sobre as brânquias de moluscos bivalves, o metabolismo de organismos terrestres e a decomposição microbiana do solo orgânico matéria^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. Além disso, calorespirometry tem revelado como metabólica pré-condicionamento antes da congelação melhora a criopreservação de mamíferos células⁷. Cada abordagem, tanto calorimetria e respirometria, independente aumentou nosso conhecimento do celular e a Bioenergética. No entanto, questões biológicas fundamentais que podem ser respondidas através da utilização de calorespirometry permanecem relativamente inexploradas.

Lei de Hess afirma que a mudança de entalpia total de uma reação é independente do percurso entre os Estados iniciais e finais. Por exemplo, a mudança de entalpia total para uma via metabólica é o somatório da variação enthalpies de todas as reações dentro da via. Calorimetria oferece uma abordagem em tempo real para medir a produção de calor celular, que detecta indiscriminadamente vias aeróbias e anaeróbias. Isto é baseado na Fundação que nenhuma energia é trocada no sistema exceto pelas paredes da ampola experimental⁸. Uma mudança na dissipação de calor é igual à mudança na entalpia liberada de todas as reações metabólicas em ampola. Assim, uma entalpia negativa se correlaciona com a perda de calor do sistema. Exaustiva pesquisa nas últimas quatro décadas tem caracterizado a paisagem termodinâmica de catabolismo e o anabolismo. Isso é representado por um aumento constante nos artigos de pesquisa encontrado sob os termos de busca "biológicos" e "calorimetria" como indexados pelos Estados Unidos nacional biblioteca da medicina (NLM) no National Institutes of Health (PubMed). A pesquisa revela que antes de 1970, um total de 27 publicações calorimetria biológicos de referência; Enquanto isso, no ano de 2016, 546 publicações utilizaram a técnica.

Os métodos calorimétricos são bem estabelecidos para determinar a produção de calor. No entanto, mais flexibilidade é concedida para resolver o valor respirometric. A medição de respirometric pode consistir de O₂, CO₂, ou tanto O₂ e CO₂. Além disso, a medição de O₂ e CO₂ pode ser realizada por várias técnicas, incluindo optrodes, eletrodos tipo Clark e diodo ajustável do laser absorção espectroscopia^{7,9,10 ,11}. Enquanto a produção de CO₂ é uma métrica valiosa em muitos estudos respirometric, o meio para pilhas cultivadas frequentemente utiliza um sistema de reserva de bicarbonic para controle de pH^12,13. Para evitar complicações da medição de CO₂ no sistema de bicarbonato, o seguinte protocolo para o calorespirometry das células em cultura utiliza O₂ como o único parâmetro de respirometric.

Simultâneas com medição de fluxo de oxigênio, certas respirometers (ver Tabela de materiais) são projetados para avaliações detalhadas da função mitocondrial. Substrato-desacoplador-inibidor-titulações (SUIT) protocolos são bem estabelecidos e são compatíveis com os experimentos para medir a membrana potencial ou reativas de oxigênio (ROS) de espécies formação¹⁴. O protocolo apresentado por calorespirometry de células intactas é compatível com a introdução de produtos químicos uncouplers como carbonila cianeto-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e a F₀F₁-ATP sintase inibidor oligomicina. Através da adição de FCCP, consumo de oxigênio pode ser desacoplado da produção de ATP, que é útil para avaliar o impacto da terapêutica potencial mitocondrial peformance¹⁵. Além disso, a adição de oligomicina acende-se a extensão da respiração de vazamento. Assim, as respirometric medições realizadas calorespirometry são compatíveis com protocolos extensivos projetados para elucidar ainda mais a fisiologia mitocondrial.

A medição simultânea de dissipação de calor e de fluxo de oxigênio permite o cálculo da relação de calorespirometric (CR). Esta relação é então comparada com a constante do Thornton ou a oxycaloric teórico equivalente, que varia entre-430 ao-480 kJ mol^-1 , dependendo da linhagem de células ou tecidos de interesse e o de substratos de carbono completados^{1, 16}. assim, uma relação de CR mais negativa revela aumentada contribuições de vias anaeróbias a atividade metabólica geral. Por exemplo, a proporção de CR para a respiração do tecido muscular rotina sem o desempenho ativo de trabalho varia de-448 a-468 kJ mol-1, que está dentro do intervalo dos teóricos oxycaloric equivalente^17,18. Enquanto isso, células de câncer mamíferos cultivadas em meio que é rico em glicose exibir reforçada ácido lático fermentação glicólise a seguir e relativamente baixo envolvimento mitocondrial¹⁹. Este resultados de fenótipo em rácios de CR no intervalo de-490 a-800 kJ mol^-1, demonstrando um maior envolvimento das vias anaeróbias no metabolismo celular como indicado pelo negativo mais CR rácios^{1,7, 16,20}.

Distribuidores comerciais e sem fins lucrativos de célula e tecido atualmente oferta de linhas de celulares de mais de 150 espécies, com quase 4.000 linhas de células derivadas de seres humanos. Linha celular imortalizado é ferramentas convenientes para avaliar rapidamente a toxicidade da terapêutica potencial, muitos dos quais direta ou indiretamente interferem com funções mitocondriais. Usar células transformadas durante o rastreio de drogas pode ser de valor preditivo limitado em parte por causa do efeito Warburg, uma marca registrada de muitos cancros. Muitas vezes, cancros geram ATP de fosforilação do substrato-nível e mantêm equilíbrio redox através da produção de lactato sem engajar-se totalmente a mitocôndria sob condições aeróbias¹⁹. Desenvolvimento farmacêutico é notoriamente caro e ineficiente, com aproximadamente 8 em 9 compostos testados em ensaios clínicos humanos não atingirem o mercado aprovação²¹. Enquanto terapêutica potencial pode passar triagem inicial devido à baixa citotoxicidade em linhas celulares, é possível que alguns destes compostos são mitotoxic. Sem um método adequado para detectar como estas toxinas podem prejudicar o equilíbrio de energia em células primárias que não exibem o efeito Warburg, informação crítica é muitas vezes excessivamente olhou, descongestionamento desenvolvimento terapêutico em estágios iniciais.

Calorespirometry é uma abordagem prática e não-invasiva para analisar a atividade metabólica em uma variedade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos. O núcleo do protocolo apresentado é compatível com uma variedade de aplicações. Uma complicação, no entanto, foi identificada. Células imortalizadas geralmente são cultivadas em um meio isento de glicose suplementado com galactose para aumentar a contribuição da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para a produção de energia, a fim de sensibilizar as células com potencial mitotoxins^{22, 23}. Esta reprogramação metabólica parece obscurecer a análise quando amostras são colocadas nas ampolas de aço inoxidável usadas pelo calorímetro¹⁵. As células cultivadas em meio de glicose continuam a se envolver em alta atividade metabólica durante várias horas. Enquanto isso, células cultivadas em meio de galactose diminuem a produção de calor dentro de 30 min de sua colocação em ampola, fazer medições restritas aos pontos de início tempo experimental. Este comportamento, infelizmente, dificulta a oportunidade de avaliar sua proliferação celular. Apesar desta limitação específica, a maioria dos aplicativos são compatíveis com análise de calorespirometric e metabólicas obter informações detalhadas podem ser obtidas através desta abordagem.

Protocolo

1. cultura de pilha

1. Manter as células de carcinoma (HepG2) hepatocelular humano médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e substratos adicionais (10 mM glicose, glutamina 2 mM e piruvato de 1 mM) a 37 ° C numa incubadora de cultura celular (5% CO₂ , ar de 95%, 100% de umidade).
   Nota: Use a formulação DMEM acima quando DMEM é referenciado em etapas posteriores para respirometria e calorimetria.
2. Placa as células em 1 x 10⁶ células por placa de cultura de 100mm e subcultura-las cada 7 dias ou antes de chegar a 90% de confluência e renovar o médio a cada 3-4 dias.
3. Realize os experimentos que, quando as células são de 60-80% de Confluencia.

2. preparação de Respirometer e calorímetro

1. Pipetar 2,2 mL de DMEM na câmara respirometer, tapar totalmente e ajustá-lo com a ferramenta de espaçador de rolha para permitir a difusão do ideal de oxigênio do ar para médio.
2. Mexa continuamente a 37 ° C até que a concentração de oxigênio (traço azul) e o fluxo de oxigênio (traço vermelho) são estáveis. Certifique-se de que software a respirometer é programado para dar conta da solubilidade de oxigênio do meio utilizado no experimento.
   Nota: Diferentes meios de comunicação têm coeficientes de solubilidade de oxigênio diferentes (por exemplo, DMEM = 0,92).
3. Após a estabilização da concentração de oxigênio em DMEM com a câmara aberta, selecione uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio e calibrá-lo para a saturação do ar de 100%.
4. Calibre para oxigênio de 0%, selecionando uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio quando o oxigênio não está presente na câmara. Execute esta etapa após 20 titulação µ l de 230 mM ditionito de sódio ou após todo o oxigênio é consumido pela amostra biológica no final do experimento.
5. Após a calibração de ar de 100% do respirometer, feche o bujão e certifique-se de que não há bolhas estão presentes na câmara.
   Nota: um ligeiro aumento no fluxo de oxigênio será detectado na câmara fechada como o sensor de oxigênio polarographic (POS) consome oxigênio para medir a pressão parcial de oxigênio.
6. Depois de ~ 10 min da rolha sendo fechada, confirme que o respirometer está pronto para células HepG2, observando um fluxo estável de oxigênio.
   Nota: O calorímetro usado aqui utiliza ampola de aço inoxidável e requer uma ampola para ser usado como uma referência.
7. Adicionar 2,5 mL de H₂O (dH₂O) [volume igual como as amostras (etapa 4)] para a ampola de referência do calorímetro e aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada com fluxo de ar e abaixe lentamente a ampola na posição 1 no canal de referência do calorímetro. Permanecem na posição 1 até amostra biológica é preparada.

3. preparação de células HepG2 para respirometria e calorimetria

1. Confirme que o respirometer e o calorímetro são preparados e calibrados. Quente DMEM e tripsina a 37 ° C em banho-maria.
2. Adicione DMEM para uma placa de 100mm fresca e lugar na incubadora para permitir o equilíbrio do meio para CO₂ e temperatura.
   Nota: Este meio será usado para o experimento de calorimetria, então o volume apropriado depende do número de ampolas que será usado.
3. Confirme com um microscópio invertido que as células estão em 60-80% de confluencia, depois lave a 100mm-placa 2 x com 10 mL de temperatura fosfato salino (PBS).
4. Adicionar 3 mL de tripsina de C a 37 ° a 100mm placa de células e incube-os por 7-10 min a 37 ° C, a incubadora de cultura de células. Neutralizar a tripsina com 3 mL de 37 ° C DMEM e suspender pipetando suavemente-~ 20 vezes com uma pipeta de 5 mL.
5. Transferir a 6 mL de células ressuspensa em DMEM e tripsina em um tubo cônico de 15 mL estéril e centrifugue por 5 min à 175 g. x remover o líquido sem perturbar o centrifugado.
6. Resuspenda o pellet de células em ~ 5 mL de DMEM e pipetar cuidadosamente para garantir que as células são suficientemente dissociado um do outro.
7. Remova ~ 100 µ l da amostra bem misturada e realizar uma contagem completa de células utilizando todos os 8 campos em um hemocytometer para determinar o número total de células. Em seguida, calcule o volume para ressuspensão das células para gerar ~ 2 x 10⁶ células por 50 µ l.
   Nota: Isto irá garantir que a 2 x 10⁶ células são adicionadas a cada câmara do respirometer com deslocamento médio mínimo.
8. Centrifugar as células durante 5 min à 175 x g. Ressuspender o sedimento do volume calculado de DMEM da etapa 3.7.
9. Realize uma contagem de células, para determinar o volume necessário para injetar 2 x 10⁶ células por câmara no respirometer (isto deve ser ~ 50 µ l). Armazene as células para a medição de respirometric no gelo até que esteja pronto.
10. Enquanto a amostra concentrada de células está no gelo, determine a diluição necessária para produzir uma concentração de 1 x 10⁵ células/mL para a calorimetria.
11. Misturar a amostra bem e prepare-se para cada ampola ~ 3 mL de células a 1 x 10⁵ células/mL em DMEM.
    Nota: O DMEM usado para a diluição da amostra deve ser o meio equilibrado, preparado na etapa 3.3.

4. calorimetria

1. Garantir que o calorímetro é conectado ao computador e o sinal calorimétricos em µW é observável e estável.
2. Adicionar 2,5 mL de células a 1 x 10⁵ células/mL (⁵ células de ~2.5 x 10) para cada ampola, garantir o suficiente de ar entre a tampa da ampola e o meio para permitir a difusão do gás.
3. Imediatamente aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada, usando o fluxo de ar para remover quaisquer resíduos externos e abaixe lentamente a ampola na posição 1 do calorímetro. Registre o tempo que a ampola é abaixada na posição 1.
4. Permitir que a ampola sentar-se na posição 1 por 15 min.
   Nota: Durante este período de 15 min, as células são para ser injetado o respirometer (passo 5). Isso garante que o mesmo intervalo de tempo é usado para produção de calor e consumo de oxigênio, quando a relação de CR é determinada.
5. Após 15 minutos na posição 1, abaixe lentamente a referência e a amostra ampolas para a posição 2. Registra o tempo que as ampolas estavam abaixadas e medida pelo menos 30 min.

5. respirometria

1. Durante o intervalo de 15 min em que a ampola está na posição 1 no calorímetro, começa os estudos respirometric.
2. Misture bem a amostra de células pipetando para garantir uma solução homogénea e injetar < 50 µ l da amostra em cada câmara do respirometer para uma concentração final de ~ 2 x 10⁶ células/câmara celular. Registre o tempo em que as células são injetadas no respirometer.
3. Após a injeção, as células HepG2 são continuamente agitou a 37 ° C. Espere pelo menos 20-30 min para ambos uma estabilização do fluxo de oxigênio e uma diminuição constante da concentração de oxigênio.
4. Selecione a guia de fluxo de₂ O por V à direita da tela e realçar uma porção estável do fluxo de oxigênio. Selecione marcas, então as estatísticas e dados do registro para o fluxo de O₂ por V. Esta gravação será usada no cálculo do rácio da CR.
   Nota: As etapas 5.5 e 5.6 são opcionais. Vazamento de respiração e respiração desacoplada máxima serão revelados por titulações de oligomicina e Compararia.
5. Injetar 1 µ l de oligomicina 4mg/mL em cada câmara e permitir ~ 10 min para a estabilização do fluxo de oxigênio. Taxa de respiração vazamento estável registro seguindo as etapas executadas em 5.4 destacando uma parte estável do rastreamento de fluxo de oxigênio após adição de oligomicina.
6. Titula-se injeções de 2 µ l de 0,2 mM Compararia em cada câmara, permitindo a estabilização de fluxo de oxigênio após cada injeção. Continue as titulações até o fluxo máximo é atingido, como indicado por um ligeiro decréscimo na titulação Compararia subsequente. A taxa de respiração estável durante o fluxo máximo de registro.

6. cálculo do rácio de Calorespirometric

1. Realizar uma contagem de célula final das amostras preparadas em ~ 1 x 10⁵ células/mL, utilizando todos os 8 campos de um hemocytometer para determinar o número total de células adicionado à ampola (2,5 mL).
2. Determine um tempo para gravar medições do calorímetro e respirometer no qual estáveis sinais estão presentes em momentos idênticos. Referência que o tempo registrado quando a ampola foi reduzida para a posição 2 e o tempo de injeção de células para o respirometer.
3. Grave a produção de calor, colocando o cursor sobre o rastreamento exibir a saída de calor para a ampola respeitada no momento determinado na etapa e expressa como µW/milhões de células. Coletar dados de consumo de oxigênio e certifique-se de que ele é expresso como pmol O₂ x s^-1 x milhões de células.
4. Para calcular a taxa de CR, primeiro converta µW em kJ/s e depois dividir kJ/s por mol de O₂/s para obter a relação de CR, expressada em kJ/mol O₂. Nota: A relação do CR é apresentada em kJ/mol O₂.
   (ver arquivo complementar 1)

Resultados

A reprodutibilidade das medições calorespirometric depende de uma preparação de amostra adequada e consistente. Amostras preparadas a partir de cultura de células não devem ser usadas se as placas são abandonadas, como contagem de células pode se tornar imprecisa devido à aglutinação. Além disso, os fluxos de calor reduzida devido à difusão do substrato limitada nas células agrupadas podem ocorrer. Portanto, quando usando células aderentes, é crítico para selecionar uma placa com a confluência entre 60...

Discussão

O objetivo do calorespirometry é avaliar quantitativamente as contribuições das vias aeróbias e anaeróbias, a atividade metabólica e obter uma visão composta de fluxo de energia celular. Isso é realizado por uma medida simultânea de dissipação de calor e fluxo de oxigênio, seguido por uma comparação do rácio CR calculado com o equivalente de oxycaloric teórica. Vários passos críticos devem ser considerados para dados reprodutíveis e confiáveis. A manutenção de uma cultura de pilha de estéril, saud?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium