Calorespirometry: Мощный, неинвазивная подход к расследованию клеточной энергии метаболизма

Резюме

Этот протокол описывает calorespirometry, прямой и одновременное измерение тепловыделением и дыхания, который обеспечивает неинвазивная подход к оценке энергии метаболизма. Этот метод используется для оценки вклада аэробных и анаэробных пути использования энергии путем наблюдения за общей клеточной энергии потока.

Аннотация

Многие клеточных линий, используемых в основных биологических и биомедицинских исследований поддержания энергетического гомеостаза через сочетание аэробных и анаэробных дыхание. Однако степень которой оба пути способствовала пейзаж клеточной энергии производства постоянно забывают. Преобразованные клетки культивировали в насыщения уровней глюкозы часто показывают снижение зависимости на Оксидативное фосфорилирование для производства АТФ, которое компенсируется увеличением в субстрат уровня фосфорилирования. Этот сдвиг в метаболические равновесием позволяет клетки размножаются несмотря на присутствие митохондриальной токсинов. В пренебрегая изменены метаболические равновесием трансформированных клеток, результаты от фармацевтической скрининга могут быть неправильно истолкованы с потенциально mitotoxic эффекты не могут быть обнаружены с помощью модели линии клетки культивировали в присутствии высоких глюкозы концентрации. Этот протокол описывает сопряжения двух мощных методов, калориметрия, который позволяет для оценки количественных и неинвазивной аэробных и анаэробных взносов сотовой производства АТФ и respirometry. Аэробных и анаэробных дыхание генерировать тепло, которое может быть контроль через калориметрии. Тем временем измерения скорость потребления кислорода может оценить степень аэробном дыхании. Когда одновременно измеряется как тепла, так и потребление кислорода, calorespirometric соотношения могут быть определены. Экспериментально полученное значение затем можно сравнить с теоретической oxycaloric эквивалент, и степень анаэробного дыхания можно судить. Таким образом calorespirometry обеспечивает уникальный метод для анализа широкий спектр биологических вопросов, включая разработки лекарств, микробного роста и основных Биоэнергетика под нормоксические и гипоксических условий.

Введение

В биологических системах, тепло release или энтальпии в ходе метаболизма изменяется обычно контролируется либо непосредственно (через Прямая калориметрия) или косвенно через O₂ потребления или производства CO₂ (через respirometry). К сожалению когда эти методы используются в изоляции, критической информации теряется, как вклад анаэробных пути для клеточного метаболизма. Calorespirometry – это мощный метод, который опирается на одновременное измерение рассеивание тепла и дыхания. Новаторская работа calorespirometric расследование анаэробного метаболизма полностью кислородом клеток млекопитающих и продемонстрировал одновременный вклад аэробных и анаэробных пути энергетического гомеостаза несмотря на трансформированных клеток, находящихся в ¹полностью кислородом среде. Calorespirometry с тех пор был применен к широкий спектр биологических вопросов. Некоторые примеры включают изучение животных энергетики на уровнях низким содержанием кислорода, воздействия гербицидов и эстрогена на жабрах двустворчатые моллюски, метаболизм земных организмов и микробного разложения органических почв вопрос^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. Кроме того, имеет calorespirometry показал как метаболические кондиционирования до замораживания улучшает криоконсервирования млекопитающих клетки⁷. Каждый подход, калориметрии и respirometry, самостоятельно увеличилась наши знания о клеточном и научные биоэнергетики. Однако основные биологические вопросы, которые можно ответить с помощью calorespirometry остаются сравнительно неизученными.

Закон Гесса утверждает, что изменение общей энтальпии реакции не зависит от пути между начальной и конечной государствами. Например изменение общей энтальпии на биохимические пути является суммирование с изменением энтальпии всех реакций в пути. Калориметрия предлагает в реальном времени подход для измерения производства ячеистого тепла, который неизбирательно обнаруживает аэробных и анаэробных пути. Это основано на фундаменте, что без энергии осуществляется в системе за исключением через стены экспериментальной ампулы⁸. Изменения в тепловыделение равен изменения энтальпии, освобождены от всех метаболических реакций в ампулы. Таким образом негативные энтальпии коррелирует к потере тепла от системы. Исчерпывающие исследования за последние четыре десятилетия характеризуется термодинамических ландшафт анаболизма и катаболизма. Это представлено устойчивый рост в научных статей, найденных под условия поиска «биологического» и «теплофизика» как индексированных по Соединенных Штатов национальной библиотеки из медицины (NLM) в национальном институте здоровья (PubMed). Поиск показывает, что до 1970 года, в общей сложности 27 публикаций ссылка биологических калориметрии; Тем временем в 2016 году в одиночку, 546 публикаций использовали технику.

Калориметрических методов хорошо известны, чтобы определить производства тепла. Однако для разрешения использованием респирометрической значение предоставляется больше гибкости. Использованием респирометрической измерения может состоять из O₂, CO₂, или O₂ и CO₂. Кроме того измерение O₂ или CO₂ может быть достигнуто путем различных методов, включая optrodes, Кларк тип электродов и перестраиваемые Диод лазера поглощения спектроскопии^{7,9,10 ,11}. В то время как CO₂ производства является ценным метрики во многих исследованиях использованием респирометрической, средство для культивируемых клеток часто использует bicarbonic буферную систему для контроля рН^12,13. Чтобы избежать осложнений CO₂ измерения в системе бикарбонат, следующий протокол для calorespirometry клеток в культуре использует O₂ в качестве единственного параметра использованием респирометрической.

Одновременно с измерением потока кислорода, некоторые respirometers (см. Таблицу материалы) предназначены для детальной оценки функции митохондрий. Субстрат uncoupler ингибитор титрования (костюм) протоколы хорошо разработаны и совместимы с эксперименты, предназначенные для измерения мембраны потенциальных или реактивного кислорода (АФК) формирование¹⁴. Представленные протокол для calorespirometry нетронутым клеток совместим с введением химических uncouplers карбонильные цианид p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) и oligomycin ингибитора синтазы F₀F₁-АТФ. Путем добавления FCCP потребление кислорода может быть центровку от производства АТФ, который является полезным для оценки воздействия потенциальных терапевтических средств на митохондриальной peformance¹⁵. Кроме того добавление oligomycin освещает масштабы утечки дыхания. Таким образом использованием респирометрической измерений во время calorespirometry совместимы с обширной протоколы, разработанные для дальнейшего прояснения митохондриальной физиологии.

Одновременное измерение рассеивание тепла и кислорода потока позволяет расчет коэффициента calorespirometric (CR). Это соотношение затем сравнивается с константой Торнтон или теоретический эквивалент, oxycaloric, которая колеблется между-430--480 кДж моль^-1 в зависимости от линии клетки или ткани интереса и дополнено углеродных подложках^{1, 16}. Таким образом, более негативное отношение CR показывает увеличение взносов от анаэробных пути к общей метаболической активности. Например коэффициент CR для рутинной мышц тканевого дыхания без активного выполнения работы варьируется от-448 до-468 кДж моль-1, который находится в пределах диапазона теоретических oxycaloric эквивалентную^17,18. Тем временем млекопитающих раковые клетки культивировали в среде, что является высоким содержанием глюкозы отображения расширенной молочнокислое брожение после гликолиза и относительно низкой митохондриальной участие¹⁹. Этот фенотип результаты в соотношениях CR в диапазоне-490--800 кДж моль^-1, демонстрируя повышенное участие анаэробных путей в клеточный метаболизм, как указано на^{, более негативные CR соотношения1,7 16,20}.

Коммерческие и некоммерческие клеток и тканей дистрибьюторов в настоящее время предложение клеточных линий более 150 видов, с почти 4000 клеточных линий, полученных от людей. Удобные инструменты для быстрого оценки токсичности потенциальных терапевтических средств, многие из которых могут прямо или косвенно вмешиваться в митохондриальной функции увековечен клеточных линий. С помощью трансформированных клеток во время наркотиков скрининг может быть ограниченной прогностическая ценность отчасти из-за эффекта Варбург, отличительной чертой многих раковых заболеваний. Часто рака генерировать СПС от субстрата уровня фосфорилирования и поддерживать окислительно-восстановительного баланса путем производства молочной кислоты без полного вовлечения митохондрий в аэробных условиях¹⁹. Фармразработка крайне дорого и неэффективно, с примерно 8 из 9 соединений, протестированы в клинические испытания на человеке не достигают рынок утверждения²¹. В то время как потенциальные терапии может пройти первоначальный отбор из-за низкой цитотоксичность в клеточных линий, вполне возможно, что некоторые из этих соединений являются mitotoxic. Без подходящий метод для обнаружения, как эти токсины могут ухудшить энергетический баланс в клетках первичной, которые не отображают эффект Варбург критической информации часто чрезмерно посмотрел, обнаружены терапевтические развития на ранних стадиях.

Calorespirometry является Неинвазивная подход для анализа метаболической активности в различных биологических проб, в том числе клеток и тканей. Основные представленные протокол совместим с широкого спектра приложений. Одно осложнение, однако, была обнаружена. Увековечен клетки часто выращиваются в среде свободной глюкозы, дополнена галактозы для увеличения вклада окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для производства энергии, с целью информирования клетки потенциальные mitotoxins^{22, 23}. Этот метаболических перепрограммирования, как представляется, закрывают анализа, когда образцы помещаются в ампулах из нержавеющей стали, используемые в калориметре¹⁵. Клетки культивировали в среде глюкозы по-прежнему участвовать в высокой метаболической активности в течение нескольких часов. Тем временем клетки культивировали в галактозы средних уменьшение производства тепла в течение 30 минут их размещения в ампулы, делая ограничивается заблаговременно экспериментальных точек измерения. Это поведение, к сожалению, препятствует возможность оценить их пролиферации. Несмотря на это конкретные ограничения большинство приложений совместимы с calorespirometric анализом и метаболические подробную информацию можно получить через этот подход.

протокол

1. клеточная культура

1. Поддерживать человека гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) клеток в Дульбекко изменение орла среде (DMEM), содержащей 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и дополнительные субстратов (глюкоза 10 мм, 2 мм глутамина и пирувата 1 мм) при 37 ° C в инкубатор культуры клеток (5% CO₂ , воздуха 95%, 100% влажность).
   Примечание: Используйте выше формулировка DMEM когда DMEM упоминается в последующих шагах для respirometry и калориметрии.
2. Пластина клетки на 1 x 10-⁶ клеток на 100 мм пластины культуры и субкультуры их каждые 7 дней или до достижения 90% confluency и возобновить носитель каждые 3-4 дня.
3. Выполните эксперименты, когда клетки являются 60-80% притока.

2. Подготовка респирометра и калориметрические

1. Накапайте 2,2 мл DMEM в камере респирометра, полностью вставьте пробку и настроить его с помощью инструмента распорку пробку для диффузии оптимальной кислорода из воздуха до среднего.
2. Постоянно помешивая при 37 ° C, до тех пор, пока концентрация кислорода (синий след) и поток кислорода (красный след) являются стабильными. Убедитесь, что респирометра программного обеспечения запрограммирован для учета растворимости кислорода, используемых в эксперименте.
   Примечание: Различные средства массовой информации имеют различные кислорода растворимость коэффициентов (например, DMEM = 0,92).
3. После стабилизации концентрации кислорода в среде DMEM с открытой камеры выберите стабильной частью трассировки концентрация кислорода и калибровки для воздуха 100% насыщения.
4. Калибровка для 0% кислорода, выбор стабильной частью трассировки концентрации кислорода, когда нет кислорода присутствует в зале. Выполните этот шаг после 20 мкл титрования Дитионит натрия 230 мм, или после того, как все кислород расходуется в биологическом образце в конце эксперимента.
5. После калибровки воздуха 100% Респирометр закройте пробку и убедитесь, что не пузыри присутствуют в камере.
   Примечание: небольшое увеличение потока кислорода будет быть обнаружен в закрытой камере как полярографический кислородного датчика (POS) потребляет кислорода для измерения парциального давления кислорода.
6. После ~ 10 минут закрываться пробкой подтверждают, что респирометра готова к HepG2 клеток, наблюдая стабильной кислорода поток.
   Примечание: Калориметра, используемый здесь использует ампулы из нержавеющей стали и требует одной ампулы для использования в качестве ссылки.
7. Добавление ссылки ампулы калориметра 2,5 мл H₂O (dH₂O) [равный объем как образцы (шаг 4)] и затяните крышку, используя плоскогубцы, если необходимо. Очистить запечатанном ампулы с потоком воздуха и медленно опустите ампулы в положение 1 в опорного канала калориметра. Остаются в позиции 1, до тех пор, пока готовится биологических образцов.

3. Подготовка HepG2 клеток Respirometry и калориметрия

1. Убедитесь, что респирометра и калориметра подготовлен и откалиброван. Теплой среде DMEM и трипсина до 37 ° C на водяной бане.
2. Добавьте DMEM свежие 100-мм пластины и место в инкубаторе для уравновешивания среды для CO₂ и температуры.
   Примечание: Эта среда будет использоваться для эксперимента, калориметрия, поэтому соответствующий объем зависит от количества ампул, которые будут использоваться.
3. Подтвердите с инвертированным микроскопом света, что клетки находятся в 60-80% притока, затем промыть 100-мм листа 2 x 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера комнатной температуры (PBS).
4. Добавить 3 мл трипсина 37-° C 100-мм пластины клеток и инкубировать их в 7-10 мин при 37 ° C в инкубатор культуры клеток. Нейтрализовать трипсина с 3 мл DMEM 37 ° C и приостановить, нежно закупорить ~ 20 раз с 5 мл пипетки.
5. Передача по 6 мл ресуспензированы клеток в среде DMEM и трипсина в стерильных 15-мл конические и центрифуги, за 5 минут при 175 x g. удаления жидкости без затрагивания Пелле ячейки.
6. Ресуспензируйте Пелле клеток в ~ 5 мл DMEM и пипетки, он тщательно обеспечить клетки достаточно отделить друг от друга.
7. Удалить ~ 100 мкл перемешанных образца и выполнить тщательный клеток игр, используя все 8 поля на Горяева определить общее количество клеток. Затем рассчитайте объем для ресуспендирования ячеек с целью генерировать ~ 2 x 10⁶ клеток / 50 мкл.
   Примечание: Это будет гарантировать, что 2 x 10⁶ клеток добавляются к каждой камере респирометра с минимальным средний перемещения.
8. Центрифуга клетки для 5 минут при 175 x g. Ресуспензируйте Пелле в рассчитанном объеме DMEM из шага 3.7.
9. Выполните подсчет клеток для определения объема необходимых для вставки 2 х 10⁶ клеток в камере респирометра (это должно быть ~ 50 мкл). Храните клетки для использованием респирометрической измерения на льду до готовности.
10. В то время как образец концентрации клеток на льду, определите разрежения, необходимые для производства в концентрации 1 х 10⁵ клеток/мл для калориметрии.
11. Хорошо перемешайте образец и подготовить ~ 3 мл клеток в 1 х 10⁵ клеток/мл в среде DMEM для каждого ампулы.
    Примечание: DMEM, используется для разбавления образца должна быть уравновешенной среднего, подготовленную на этапе 3.3.

4. калориметрия

1. Обеспечить, чтобы калориметра подключен к компьютеру и калориметрических сигнал в мкВт наблюдаемых и стабильной.
2. Добавление каждая ампула 2,5 мл клеток в 1 х 10⁵ клеток/мл (~2.5 x 10⁵ клеток), обеспечение достаточного количества воздуха между крышкой ампулы и среднего для газовой диффузии.
3. Сразу же затяните крышку, используя плоскогубцы, если необходимо. Очистить запечатанный ампулы, используя поток воздуха для удаления любого внешнего мусора и медленно опустите ампулы в положение 1 калориметра. Запишите время ампулы опускается в положение 1.
4. Разрешить ампулы сидеть в позиции 1, 15 мин.
   Примечание: В этот период 15 мин, клетки должны быть введены в респирометра (шаг 5). Это гарантирует, что тот же интервал времени используется для производства тепла и потребление кислорода, когда коэффициент CR определяется.
5. После 15 минут в позиции 1 медленно опустите как ссылка, так и образец ампулы в положение 2. Запись времени, которые были снижены ампулы и меру для по крайней мере 30 минут.

5. respirometry

1. Во время 15-мин интервал, в котором ампулы находится в позиции 1 в калориметре начинают использованием респирометрической исследований.
2. Тщательно перемешайте образец клеток, закупорить обеспечить однородный раствор и привнести < 50 мкл образец клеток в каждой камере респирометра для конечной концентрации ~ 2 x 10⁶ клеток/камеры. Запишите время клетки вводят в респирометра.
3. После инъекции HepG2 клетки постоянно перемешивают при 37 ° C. Подождите, по крайней мере 20-30 минут для обоих стабилизации потока кислорода и неуклонное снижение концентрации кислорода.
4. Выберите вкладку O₂ потока в V в правой части экрана и выделить стабильной часть потока кислорода. Выберите метки, затем статистики и записи данных для потока₂ O за V. Эта запись будет использоваться в расчет коэффициента CR.
   Примечание: Шаги 5.5 и 5.6 являются необязательными. Максимальная центровку дыхания и дыхания, утечке будет раскрыта путем титрования oligomycin и FCCP.
5. Придать каждой камеры 1 мкл 4 мг/мл oligomycin и позволяют ~ 10 минут для стабилизации потока кислорода. Частота дыхания в записи стабильной утечки на следующие шаги, выполняемые в 5.4, выделив стабильной частью трассировки потока кислорода после добавления oligomycin.
6. Титруйте 2 мкл инъекции 0,2 мм FCCP в каждой камере, позволяя для стабилизации потока кислорода после каждой инъекции. Продолжайте титрование до достижения максимального потока, как указано на некоторое снижение в последующих FCCP титрования. Рекорд частоты стабильной дыхания во время максимального потока.

6. Расчет коэффициента Calorespirometric

1. Выполните окончательный клеток, количество образцов, подготовленный на ~ 1 х 10⁵ кл/мл, используя все 8 поля Горяева определить общее количество ячеек добавляется ампулы (2,5 мл).
2. Определите время для записи измерений калориметр и Респирометр, на котором стабильные сигналы присутствуют на идентичные раз. Ссылаться на то время, когда ампулы был снижен до позиции 2 и время инъекции клеток в респирометра.
3. Запись производства тепла, поместив курсор над трассировки, вывода тепла для уважаемых ампулы в то время определяется на этапе и выразить как мкВт/миллионов клеток. Сбор данных по потреблению кислорода и убедитесь, что он выражается как пмоль O₂ x s^-1 миллион клеток.
4. Чтобы вычислить коэффициент CR, сначала преобразовать мкВт кДж/s, а затем разделить кДж/s над mol O/s₂получить соотношение CR, выраженный в виде кДж/моль O₂. Примечание: CR соотношение представлена в кДж/моль O₂.
   (см. дополнительный файл 1)

Результаты

Воспроизводимость результатов измерений calorespirometric зависит от надлежащего и последовательного пробоподготовки. Образцов, приготовленных из клеточной культуры следует не использоваться если заросло пластины, как клеток может стать неточными из-за слипания. Кроме того, может произойти...

Обсуждение

Цель calorespirometry заключается в том, чтобы количественно оценить вклад аэробных и анаэробных пути к метаболической активности и получить составное представление потока клеточной энергии. Это достигается путем одновременного измерения тепла и поток кислорода, следуют сравнение расчетны?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium