Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Calorespirometry, die direkte und gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Atmung, sorgt für eine nicht-invasive Ansatz um den Energiestoffwechsel zu beurteilen. Diese Technik wird verwendet, um den Beitrag von aeroben und anaeroben Wege zur energetischen Nutzung durch die Überwachung des gesamten zellulären Energiefluss zu bewerten.

Zusammenfassung

Viele Zelllinien verwendet in der biologischen und biomedizinischen Grundlagenforschung pflegen energiehomöostase durch eine Kombination von aeroben und anaeroben Atmung. Allerdings ist der Umfang, den beide Wege zur Landschaft der zellulären Energieproduktion beitragen, konsequent übersehen. Transformierte Zellen kultiviert in Sättigung Niveaus der Glukose oft zeigen eine geringere Abhängigkeit auf Oxidative Phosphorylierung für ATP-Produktion, die durch eine Erhöhung der Substrat-Niveau Phosphorylierung ausgeglichen wird. Diese Verschiebung in der metabolischen Gleichgewicht ermöglicht Zellen, trotz der Anwesenheit der mitochondrialen Toxine vermehren. In veränderten Stoffwechsel Haltung der transformierten Zellen zu vernachlässigen, Ergebnisse von pharmazeutischen Prüfung können fehlinterpretiert werden, seit der potenziell Mitotoxic Effekte können nicht erkannt werden mit Modell Zelllinien kultiviert in Anwesenheit hoher Blutzucker Konzentrationen. Dieses Protokoll beschreibt die Paarung von zwei mächtigen Techniken, respirometrie und Kalorimetrie, die für die quantitative und nicht-invasive Beurteilung der aeroben und anaeroben Beiträge zur zellulären ATP-Produktion ermöglicht. Aerobe und anaerobe Atmungen erzeugen Wärme, die überwachten über Kalorimetrie sein kann. Unterdessen kann die Messrate der Sauerstoffverbrauch der aeroben Atmung, inwieweit. Wenn Wärmeableitung und Sauerstoffverbrauch gleichzeitig gemessen werden, kann das Verhältnis der Calorespirometric bestimmt werden. Die experimentell ermittelten Wert kann dann verglichen werden, um die theoretische Oxycaloric gleichwertig und das Ausmaß der anaeroben Atmung beurteilt werden kann. So bietet Calorespirometry eine einzigartige Methode, um eine Vielzahl von biologischen Fragen, einschließlich der Arzneimittelentwicklung, mikrobielles Wachstum und grundlegende Bioenergetik unter Inklusieve und hypoxischen Bedingungen zu analysieren.

Einleitung

In biologischen Systemen, die Wärmeabgabe oder Enthalpie Änderung beim Stoffwechsel ist in der Regel entweder direkt überwacht (über direkte Kalorimetrie) oder indirekt über O₂ Verbrauch und/oder CO-₂ -Produktion (über respirometrie). Wenn diese Techniken isoliert verwendet werden, ist leider wichtige Informationen verloren gehen, wie der Beitrag von anaeroben Wege zur zellulären Stoffwechsel. Calorespirometry ist eine leistungsstarke Technik, die auf die gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und die Atmung setzt. Calorespirometric Pionierarbeit den anaeroben Stoffwechsel im voll sauerstoffreiches Säugerzellen untersucht und demonstriert gleichzeitig Beiträge von aeroben und anaeroben Wege zur Energie-Homöostase trotz der transformierten Zellen in einer voll oxydierten Umgebung¹. Calorespirometry wurde inzwischen zu einer Vielzahl von biologischen Fragestellungen angewandt. Beispiele hierfür sind die Untersuchung von tierischen Energetik bei niedrigen Sauerstoffgehalt, die Auswirkungen der Herbizid und Östrogen auf den Kiemen der Muscheln, der Stoffwechsel der terrestrischen Organismen und den mikrobiellen Abbau von organischen Böden Angelegenheit^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. Calorespirometry hat⁷Zellen offenbarte wie metabolische Vorkonditionierung vor dem Einfrieren der Kryokonservierung von Säugetieren verbessert. Jeder Ansatz, Kalorimetrie und respirometrie, hat selbständig erhöht unser Wissen über zelluläre und organismal Bioenergetik. Relativ unerforscht bleiben jedoch grundlegende biologische Fragestellungen, die durch den Einsatz von Calorespirometry beantwortet werden können.

Hesss Gesetz besagt, dass die totale Enthalpieänderung der Reaktion des Weges zwischen dem Anfangs- und Endwert Staaten unabhängig ist. Beispielsweise ist die gesamte Enthalpieänderung für einen biochemischen Weg die Summierung der Änderung der Enthalpien aller Reaktionen innerhalb der Weg. Kalorimetrie bietet einen Echtzeit-Ansatz zur Messung der zellulären Wärmeerzeugung, die wahllos aerobe und anaerobe Wege erkennt. Dies basiert auf der Grundlage, dass keine Energie in das System außer durch die Wände des experimentellen Ampulle⁸ausgetauscht werden. Eine Änderung der Wärmeableitung ist gleich der Änderung im Enthalpie befreit alle Stoffwechselreaktionen in der Ampulle. So korreliert eine negative Enthalpie zu einem Verlust von Wärme aus dem System. Umfassende Forschung in den letzten vier Jahrzehnten hat die thermodynamische Landschaft von Anabolismus und Katabolismus geprägt. Dies wird durch einen stetigen Anstieg der Fachartikel finden Sie unter den Suchbegriffen "biologisch" und "Kalorimetrie" wie durch die Vereinigten Staaten nationale Bibliothek von Medicine (NLM) an den National Institutes of Health (PubMed) indiziert dargestellt. Die Suche zeigt, dass vor 1970, insgesamt 27 Publikationen Referenz biologische Kalorimetrie; Unterdessen in 2016 allein verwendet 546 Publikationen die Technik.

Kalorimetrischer Methoden sind etabliert, Wärmeerzeugung zu bestimmen. Für die Lösung des respirometric Wert wird jedoch mehr Flexibilität gewährt. Die respirometric Messung kann von O₂, CO₂, oder O₂ und CO₂bestehen. Darüber hinaus kann die Messung der O₂ oder CO₂ durch verschiedene Techniken, einschließlich Optrodes, Clark-Art Elektroden und tunable Diode Laser Absorption Spektroskopie^{7,9,10 erfolgen ,11}. Während CO₂ -Produktion eine wertvolle Metrik in vielen respirometric Studien ist, nutzt das Medium für kultivierten Zellen oft ein Bicarbonic Puffersystem für pH Steuerung^12,13. Zur Vermeidung von Komplikationen der CO₂ -Messung in das Bicarbonat-System nutzt das folgende Protokoll für die Calorespirometry der Zellen in Kultur O₂ als alleinige respirometric Parameter.

Gleichzeitig mit der Messung von Sauerstoff-Fluss, sind bestimmte Respirometers (siehe Tabelle der Materialien) für detaillierte Bewertungen der mitochondrialen Funktion ausgelegt. Substrat-Entkuppler-Inhibitor-Titrationen (Anzug) Protokolle sind etabliert und sind kompatibel mit Experimenten Membran potenzielle oder reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Bildung¹⁴messen soll. Die vorgestellte Protokoll für Calorespirometry der intakten Zellen ist kompatibel mit der Einführung der chemischen Entkuppler wie Carbonyl Zyanid-p-Trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und F₀F₁-ATP-Synthase Oligomycin Hemmstoff. Durch die Zugabe von FCCP können Sauerstoffverbrauch abgekoppelt von der ATP-Produktion, zur Bewertung der Auswirkungen von potenziellen Therapeutika auf mitochondriale Leistung¹⁵nützlich ist. Darüber hinaus beleuchtet die Zugabe von Oligomycin das Ausmaß der Undichtigkeit Atmung. So sind die respirometric Messungen während Calorespirometry kompatibel mit umfangreiche Protokolle entwickelt, um weitere mitochondriale Physiologie aufzuklären.

Die gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Sauerstoff Flussmittel kann für die Berechnung des Calorespirometric (CR)-Verhältnisses. Dieses Verhältnis ist dann im Vergleich zu den Thornton Konstante oder die theoretische Oxycaloric entspricht, die zwischen-430-480 kJ Mol^-1 je nach Zelllinie oder Gewebe von Interesse und ergänzten Kohlenstoff Substrate^{1, 16}. so eine negativere CR Verhältnis zeigt erhöhte Beiträge von anaeroben Wege zu insgesamt Stoffwechselaktivität. Zum Beispiel reicht das CR-Verhältnis für die routinemäßige Muskel Gewebe Atmung ohne die aktive Durchführung von Arbeiten von-448-468 kJ Mol-1 im Bereich der theoretischen Oxycaloric entspricht^17,18liegt. Unterdessen Säugetier-Krebszellen kultiviert im Medium, die reich an Glucose anzeigen erweiterte Milchsäuregärung nach Glykolyse und relativ niedrigen mitochondriale Engagement¹⁹. Dieser Phänotyp Ergebnisse in CR-Verhältnisse im Bereich der-490-800 kJ Mol^-1, zeigen eine erhöhte Beteiligung der anaerobe Wege in den zellulären Stoffwechsel angedeutet durch mehr negative CR Verhältnisse^{1,7, 16,20}.

Kommerzielle und gemeinnützige Zell- und Distributoren derzeit Angebot Zelllinien aus über 150 Arten mit fast 4.000 Zelllinien von Menschen abgeleitet. Immortalisierte Zelllinien sind praktische Werkzeuge für schnell Bewertung der Toxizität von potenziellen Therapeutika, von denen viele direkt oder indirekt mitochondriale Funktionen beeinträchtigen. Mit transformierten Zellen während Drogen-Screening kann der begrenzten Aussagekraft zum Teil wegen der Warburg-Effekt, ein Markenzeichen von vielen Krebsarten sein. Oft Krebs erzeugen ATP aus Substrat-Niveau Phosphorylierung und Redox-Gleichgewicht durch die Produktion von Laktat ohne Eingriff vollständig das Mitochondrium unter aeroben Bedingungen¹⁹. Pharmazeutische Entwicklung ist notorisch kostspielig und ineffizient, mit etwa 8 von 9 Verbindungen getestet in klinischen Studien am Menschen nicht Markt Genehmigung²¹erreicht. Während potenzielle Therapeutika erste Sichtung durch geringe Zytotoxizität in Zelllinien passieren kann, ist es möglich, dass einige dieser Verbindungen Mitotoxic sind. Ohne eine geeignete Methode, um zu erkennen, wie diese Toxine die Energiebilanz im Primärzellen beeinträchtigen können, die nicht der Warburg-Effekt angezeigt werden, ist oft wichtige Informationen über sah, therapeutische Entwicklung in frühen Stadien zu Engpässen.

Calorespirometry ist eine praktische, nicht-invasive Ansatz zur Stoffwechselaktivität in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich der Zellen und Geweben zu analysieren. Der Kern des vorliegenden Protokolls ist mit einer Vielzahl von Anwendungen kompatibel. Jedoch wurde eine Komplikation festgestellt. Immortalisierte Zellen sind oft in einem Glukose-freies Medium ergänzt mit Galaktose, den Beitrag der Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) für die Energieerzeugung zu erhöhen, um die Zellen, die potenzielle Mitotoxins^{22sensibilisieren kultiviert, 23}. Diese metabolischen Umprogrammierung erscheint Analyse zu verdecken, wenn Proben in der Edelstahl-Ampullen verwendet durch die Kalorimeter¹⁵platziert werden. Zellen in einem Glukose-Medium kultiviert weiterhin in hoher Stoffwechselaktivität für mehrere Stunden zu engagieren. Unterdessen verringern Zellen in Galaktose Medium kultiviert die Wärmeproduktion innerhalb von 30 min von ihrer Platzierung in der Ampulle, Messungen auf frühen experimentellen Zeitpunkte beschränkt. Dieses Verhalten verhindert leider die Möglichkeit, ihre Zellproliferation zu bewerten. Trotz dieser besonderen Einschränkung die meisten Anwendungen sind kompatibel mit Calorespirometric Analyse und metabolische Detailinformationen erhalten Sie durch diesen Ansatz.

Protokoll

(1) Zellkultur

1. Halten menschliche hepatozellulären Karzinom (HepG2) Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und zusätzliche Substrate (Pyruvat 1 mM, 10 mM Glukose und 2 mM Glutamin) bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator (5 % CO₂ , 95 % Luft, 100 % Luftfeuchtigkeit).
   Hinweis: Verwenden der oben genannten DMEM Formulierung, wenn DMEM in späteren Schritten für respirometrie und Kalorimetrie verwiesen wird.
2. Platte der Zellen bei 1 x 10⁶ Zellen pro 100 mm Kultur und Subkultur sie alle 7 Tage oder vor erreichen 90 % Konfluenz und erneuern das Medium alle 3-4 Tage.
3. Durchführen Sie die Experimente, wenn Zellen 60-80 % Zusammenfluss sind.

2. Vorbereitung des Respirometer und Kalorimeter

1. Pipettieren 2,2 mL DMEM in die Kammer Respirometer, legen Sie den Stopper voll und passen Sie es mit dem Stopper Spacer Werkzeug, um optimale Sauerstoffdiffusion aus Luft auf Medium zu ermöglichen.
2. Rühren Sie ständig bei 37 ° C, bis der Sauerstoff-Konzentration (blaue Spur) und Sauerstoff-Fluss (rote Spur) stabil sind. Sicherstellen Sie, dass die Respirometer Software programmiert ist, entfallen die Sauerstoff-Löslichkeit des Mediums in das Experiment verwendet.
   Hinweis: Unterschiedliche Medien haben unterschiedliche Sauerstoff Löslichkeit Koeffizienten (z. B.DMEM = 0,92).
3. Wählen Sie nach der Stabilisierung der Sauerstoffkonzentration in DMEM mit der Kammer öffnen einen stabilen Teil der Sauerstoff-Konzentration-Ablaufverfolgung und für 100 % Luft Sättigung zu kalibrieren.
4. Kalibrierung für 0 % Sauerstoff Sie einen stabile Teil der Sauerstoff-Konzentration-Ablaufverfolgung auswählen, wenn kein Sauerstoff im Plenarsaal anwesend ist. Führen Sie diesen Schritt nach 20 µL Titration von 230 mM Natrium Dithionite oder nach allen Sauerstoff von der biologischen Probe am Ende eines Experiments verbraucht wird.
5. Schließen Sie nach der 100 % Luft Kalibrierung der Respirometer den Stopper und sicherzustellen Sie, dass keine Luftblasen im Plenarsaal anwesend sind.
   Hinweis: ein leichter Anstieg im Sauerstoff-Fluss wird in der geschlossenen Kammer als der polarographischen Lambdasonde erkannt (POS) Sauerstoff verbraucht, um den Sauerstoff-Partialdruck zu messen.
6. Bestätigen Sie nach ~ 10 min von der Verschluss geschlossen wird, dass die Respirometer bereit für HepG2-Zellen durch einen stabilen Sauerstoff-Fluss zu beobachten.
   Hinweis: Die hier verwendete Kalorimeter nutzt Edelstahl Ampullen und erfordert eine Ampulle als Referenz verwendet werden.
7. Die Referenz-Ampulle von der Kalorimeter 2,5 mL H₂O (dH₂O) [gleiches Volumen wie die Proben (Schritt 4)] hinzu und ziehen Sie die Kappe mit einer Zange, wenn nötig. Reinigen Sie den versiegelten Ampulle mit Luftstrom und senken Sie langsam die Ampulle auf position 1 in den Referenzkanal das Kalorimeter. Bleiben Sie an Position 1 bis zur biologischen Probe vorbereitet ist.

3. Vorbereitung der HepG2-Zellen für Respirometrie und Kalorimetrie

1. Bestätigen Sie, dass die Respirometer und Kalorimeter vorbereitet und kalibriert werden. Warm DMEM und Trypsin auf 37 ° C in einem Wasserbad.
2. DMEM Hinzufügen einer frisch 100-mm-Platte und in den Inkubator, um das Gleichgewicht des Mediums für CO₂ und Temperatur zu ermöglichen.
   Hinweis: Dieses Medium wird für das Experiment Kalorimetrie verwendet werden, so dass das entsprechende Volumen hängt die Anzahl der Ampullen, die verwendet werden.
3. Bestätigen Sie mit einer invertierten Lichtmikroskop, dass die Zellen am Zusammenfluss von 60-80 %, dann waschen die 100-mm-Platte 2 X mit 10 mL der Raumtemperatur Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
4. Die 100-mm-Platte von Zellen 3 mL von 37 ° C Trypsin hinzu und inkubieren sie ca. 7-10 min bei 37 ° C in der Zelle-Kultur-Inkubator. Neutralisieren die Trypsin mit 3 mL 37 ° C DMEM und aussetzen von sanft pipettieren sie ~ 20 Mal mit einer 5 mL pipettieren.
5. Überführen Sie die 6 mL resuspendierte Zellen in DMEM und Trypsin in ein steriles 15 mL konische Röhrchen und Zentrifugieren Sie, für 5 min bei 175 X g. Flüssigkeit entfernen, ohne die Zelle Pellet zu stören.
6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in ~ 5 mL DMEM und pipettieren gründlich um sicherzustellen, dass die Zellen ausreichend voneinander getrennt sind.
7. Entfernen Sie ~ 100 µL der gut gemischten Probe zu und führen Sie eine gründliche Zellzahl nutzen alle 8 Felder auf eine Hemocytometer, die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen. Dann berechnen Sie das Volumen für Wiederfreisetzung der Zellen um ~ 2 x 10⁶ Zellen pro 50 µL zu generieren.
   Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass jede Kammer der Respirometer mit minimalen mittleren Hubraum 2 x 10⁶ Zellen hinzugefügt werden.
8. Zentrifugieren Sie den Zellen für 5 min bei 175 X g. Aufschwemmen das Pellet in das berechnete Volumen der DMEM aus Schritt 3.7.
9. Führen Sie eine Zellzahl bestimmen die Lautstärke, 2 x 10⁶ Zellen pro Kammer in der Respirometer zu injizieren (Dies sollte ~ 50 µL) erforderlich. Speichern Sie die Zellen für die respirometric Messung auf Eis, bis bereit.
10. Während die konzentrierte Zellprobe auf dem Eis ist, bestimmen Sie die Verdünnung erforderlich, um eine Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen/mL für die Kalorimetrie zu produzieren.
11. Die Probe gut mischen und jede TRINKAMPULLE ~ 3 mL der Zellen bei 1 x 10⁵ Zellen/mL in DMEM vorbereiten.
    Hinweis: Die DMEM verwendet für die Probenverdünnung sollte das äquilibriert Medium in Schritt 3.3 vorbereitet sein.

4. Kalorimetrie

1. Sicherstellen Sie, dass Kalorimeter an den Computer angeschlossen ist und das kalorimetrisch Signal in µW beobachtbaren und stabil.
2. Jede Ampulle 2,5 mL der Zellen bei 1 x 10⁵ Zellen/mL (~2.5 X 10⁵ Zellen) hinzu, ausreichend Luft ist zwischen den Deckel von der Ampulle und das Medium, um Gasdiffusion zu ermöglichen.
3. Sofort ziehen Sie die Kappe mit einer Zange, wenn nötig. Reinigen Sie den versiegelten Ampulle mit Luftstrom um jeglichen externen Schmutz zu entfernen und senken Sie langsam die Ampulle auf position 1 der Kalorimeter. Notieren Sie die Zeit, die die Ampulle auf position 1 abgesenkt wird.
4. Lassen Sie die Ampulle an Position 1 für 15 min sitzen.
   Hinweis: In diesem Zeitraum 15 min sind Zellen in der Respirometer (Schritt 5) injiziert werden. Dies sorgt dafür, dass die gleichen Zeitintervall für die Produktion von Wärme und Sauerstoff-Verbrauch verwendet wird, wenn das CR-Verhältnis bestimmt wird.
5. Senken Sie nach 15 min auf Position 1 langsam die Referenz und Sample Ampullen auf Position 2. Zeichnen Sie die Zeit, die die Ampullen gesenkt wurden und Maßnahme mindestens 30 min lang.

5. respirometrie

1. Während der 15-min-Intervall, in dem die Ampulle auf Position 1 in das Kalorimeter ist, beginnen Sie die respirometric Studien.
2. Mischen Sie die Zellprobe durch pipettieren gewährleisten eine homogene Lösung zu injizieren < 50 µL die Zellprobe in jeder Kammer des Respirometer für eine Endkonzentration von ~ 2 x 10⁶ Zellen/Kammer. Notieren Sie die Zeit, die die Zellen in den Respirometer injiziert werden.
3. Nach der Injektion werden die HepG2-Zellen kontinuierlich bei 37 ° c gerührt. Warten Sie mindestens 20-30 min für beide eine Stabilisierung der Sauerstoff-Fluss und eine stetige Abnahme der Sauerstoffkonzentration.
4. Wählen Sie die Registerkarte " O₂ Flux pro V " auf der rechten Seite des Bildschirms und markieren Sie eine stabile Portion Sauerstoff Flussmittel zu. Wählen Sie Markierungen, dann Statistiken und Daten für O₂ Flux pro V. Diese Aufnahme wird bei Berechnung des CR-Verhältnisses verwendet werden.
   Hinweis: Die Schritte 5.5 und 5.6 sind optional. Leck-Atmung und maximale abgekoppelt Atmung werden durch Titrationen von Oligomycin und FCCP enthüllt werden.
5. In jeder Kammer 1 µL 4mg/mL Oligomycin injizieren und erlauben ~ 10 min für Sauerstoff Flussmittel Stabilisierung. Rekord stabile Atmung Leckrate von Schritten durch die Hervorhebung einer stabilen Portion Sauerstoff-Fluss-Spur nach Oligomycin Zugabe in 5.4 durchgeführt.
6. Titel 2-µL-Injektionen von 0,2 mM FCCP in jeder Kammer, so dass für Sauerstoff Flussmittel Stabilisierung nach jeder Injektion. Die Titrationen weiter bis der maximale Fluss erreicht ist, wie durch einen leichten Rückgang der nachfolgenden FCCP Titration. Notieren Sie die stabile Atemfrequenz während der maximale Fluss.

6. Berechnung der Calorespirometric Verhältnis

1. Führen Sie eine endgültige Zellzahl der Proben vorbereitet auf ~ 1 x 10⁵ Zellen/mL nutzen alle 8 Felder von einer Hemocytometer zu bestimmen, die Gesamtzahl der Zellen hinzugefügt, um die Ampulle (2,5 mL).
2. Bestimmen Sie eine Zeit zur Aufzeichnung von Messungen von Kalorimeter und Respirometer bei der stabile Signale zu gleichen Zeiten anwesend sind. Die Referenzzeit aufgezeichnet, wenn die Ampulle gesenkt wurde, um 2 und dem Zeitpunkt der Injektion von Zellen in der Respirometer zu positionieren.
3. Notieren Sie die Wärmeproduktion, indem man den Cursor über die Ablaufverfolgung anzeigen Heizleistung für die angesehene Ampulle zum Zeitpunkt bestimmt, im Schritt und ausdrücklich als µW/Millionen Zellen. Sauerstoff-Verbrauch-Daten zu sammeln und stellen Sie sicher, dass es als Pmol O₂ x s^-1 x Millionen Zellen exprimiert wird.
4. Um das CR-Verhältnis berechnen, zuerst konvertieren Sie µW in kJ/s, und verteilen Sie kJ/s über Mol/s O₂, ausgedrückte als kJ/Mol O₂CR-Verhältnis zu erhalten. Hinweis: Der CR-Verhältnis wird in kJ/Mol O₂vorgestellt.
   (siehe ergänzende Datei 1)

Ergebnisse

Die Reproduzierbarkeit der Messungen der Calorespirometric hängt eine richtige und konsequente Probenvorbereitung. Proben aus Zellkultur sollte nicht verwendet werden, wenn die Platten bewachsen sind, wie zellenzahlen aufgrund Verklumpung ungenau werden können. Darüber hinaus reduzierte Wärmeströme durch begrenzte Substrat Diffusion in den aufgehäuften Zellen auftreten. Adhärente Zellen verwenden, ist es daher, eine Platte mit der Konfluenz zwischen 60-80 % wählen und ändern Sie das Medium 24 h vor dem Experimen...

Diskussion

Das Ziel des Calorespirometry ist quantitativ bewerten die Beiträge der aeroben und anaeroben Wege zur Stoffwechselaktivität und erhalten eine zusammengesetzte Ansicht der Zellenergie Flussmittel. Dies geschieht durch eine gleichzeitige Messung der Wärmeableitung und Sauerstoff-Fluss, gefolgt durch einen Vergleich der berechneten CR-Verhältnis mit der theoretischen Oxycaloric entspricht. Mehrere wichtige Schritte müssen für reproduzierbare und zuverlässige Daten berücksichtigt werden. Die Aufrechterhaltung einer ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium