"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Özet

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

Özet

Nerede sadece üç viral genom deneysel olarak enfekte şempanzelerin kronikleşme içinde sonuçlanabilir, olağanüstü infektivite hepatit B virüsü (HBV) içinde vivo rağmen en tüp bebek modelleri birkaç yüz binlerce hücre başına viral genom gerektirir. geçici bir enfeksiyon başlatmak için sipariş. Ayrıca, birincil insan tetkikine (PHH) statik 2D kültürleri sadece kısa vadeli çalışmalar nedeniyle onların hızlı dedifferentiation izin. Burada, biz 3D karaciğer-on-a-chip kültürleri PHH, monocultures veya cocultures ile diğer nonparenchymal karaciğer yerleşik hücre tanımlamak. Bu fizyolojik konak hücre yanıt-e doğru uzun vadeli HBV enfeksiyonlarıdır eğitimi için önemli bir gelişme sunar. İlaç etkinliğini araştırmaları, toksikolojik analiz ve Patogenez soruşturmalar kolaylaştırıcı ek olarak, bu mikrosıvısal kültür sistemleri kovalent kapalı ortadan kaldırarak hedef alan HBV enfeksiyonu için şifalı tedaviler değerlendirilmesi olanaklı kılmak, Daire (ccc) DNA'sı. Bu yöntem PHH monocultures ve PHH/Kupffer hücre ortak kültürleri, saflaştırılmış HBV ile onların enfeksiyon ve ana bilgisayar yanıt analizini up açıklar. Bu yöntem, özellikle uzun vadeli etkileri HBV enfeksiyonu, tedavi kombinasyonları ve Patogenez değerlendirilmesi için geçerlidir.

Giriş

HBV çalışmanın birkaç yüz binlerce enfeksiyon¹başlatmak için hücre başına HBV genomu kopya gerektiren kültür sistemlerinin, zavallı duyarlılık tarafından karmaşık. Ayrıca, birincil insan tetkikine genellikle son derece kırılgan ve hızla geleneksel kültürler²sırasında dedifferentiate. Gerçeğini esas olarak düz ve sert plastik yüzeyler karaciğer ve oksijen yokluğunda mikrosıvısal dolaşım, kültürlerin genel eksikliği içinde bulunan doğal hücre dışı ortamlarda taklit değil nedeni bu. Geleneksel statik hepatosit kültür kolajen kaplı plakalar üzerinde hızla dedifferentiate ve HBV enfeksiyonu³onların duyarlılık kaybetmek. Burada, kurulum ve geleneksel 2B statik PHH kültürler onların genişletilmiş metabolik ve fonksiyonel yetkinlik nedeniyle kolajen kaplı tabaklarda çok avantajlı bitti, 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, yetiştirilen PHH enfeksiyonu tarif kolaylaştırılması en az 40 gün⁴uzun vadeli kültürleri. Bu sistemde, PHH sürekli oksijen ve besin hücrelere sağlamak için büyüme orta ile periosteum kolajen kaplı iskele üzerinde seribaşı. PHH için alternatif kültür sistemleri dayalı olsa bile fare fibroblastlar veya 3D büyüme pulcuklarının karmaşık cocultures doğrulandıktan ve HBV enfeksiyonu ilişkilendirmenin çeşitliliği 500 genom (GE) karşılıkları HBV enfeksiyonu hücre başına, 3D kullanarak yatkındır karaciğer-on-a-chip kültürler kalır tek tüp bebek modeli sistemi 0,05 duyarlı GE HBV hücre⁴başına. Bu ayrıca HBV enfeksiyonu kurmak için dimetil sülfoksit (DMSO) ve Polietilen glikol (PEG) yüksek konsantrasyonda kullanma gerekliliği tarafından bu kültürlerde 3D karaciğer-on-a-chip kültür sistemleri enfeksiyon için gereksiz olan desteklenen ⁴. HBV önemli işaretlerinden arasında tüm de üretilen novo-virions^5,6için transkripsiyon şablon görevi görür cccDNA havuzu enfeksiyondur. CccDNA geleneksel hepatosit kültürler^7,8' tespit edilebilir olsa da, ister cccDNA düzenlenmesi ve herhangi bir tedavi yaklaşımları onun eleme amaçlı olarak kısmen recapitulated olarak belirsizdir veya tamamen dediferansiye tetkikine. Biz o cccDNA işlevsel olarak 3D karaciğer-on-a-chip kültürlerde oluşturulur, fizyolojik uyaranlara yanıt verir ve transkripsiyon makine cccDNA genom⁴erişilebilirliğini engel tarafından hedef göstermiştir.

Bu enfeksiyon, hem de tedavi başarı için biyolojik tanımlaması etkinleştirme, HBV infekte hastaların gözlenen 3D karaciğer-on-a-chip taklit HBV enfeksiyonu için ana bilgisayar yanıt. Karaciğer-on-a-chip kültürlerin benzersiz özellikleri arasında PHH ve karaciğer Kupffer hücreleri⁴, yildiz seklinde hücre⁹ve karaciğer sinüsoidal dahil olmak üzere, içindeki diğer nonparenchymal hücreleri arasında uzun vadeli ana bilgisayar yanıt-e doğru değerlendirmek için yeteneğidir endotel hücreleri^10,11. Bu karmaşık bir 3D microenvironment etkileşimlerde hücre/hücre değerlendirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır.

Ayrıca, bu platform genişletilmiş kültür döneminde geleneksel hepatosit kültür sistemleri kullanarak mümkün olmayan sıralı ilaç tedavileri değerlendirilmesi ve HBV sebat, üzerindeki etkilerini kolaylaştırır.

Bu protokolü nasıl 3D karaciğer-on-a-chip açıklar monocultures, PHH veya PHH cocultures Kupffer hücreleri ile kültürler oluşturulur. Ayrıca, saf HBV enfeksiyonu, düşük çeşitlilik araştırmaları üretimi yanı sıra ev sahibi ve viral yanıt daha sonraki analiz açıklar.

Protokol

1. montaj ve denge plakaların

1. Kompresör ve vakum pompası LiverChip platformu ile ilişkili açık olduğundan emin olun. Derleme ve denge plakaların bir sınıf II kabine içinde gerçekleştirin.
2. Aseptik mikrosıvısal tabak tabak Bankası arasındaki steril bir zar yerleştirerek ve iyi içeren üst plaka (Şekil 1a) ekleyerek birleştirin.
3. Steril membran sorunsuz taban plakası, iki iğneli üzerinde düzensiz membran yerleşim uzlaşma beri mikrosıvısal dolaşım aittir emin olun.
4. Steril plaka kapak eklemek ve bir otomatik hassas tork 33 sıra sıkma bir sarmal kullanarak lb için kullanarak plaka temelini vidaları sıkıştırın. Tüm vidaları kullanarak el ile bir tork 35 lb için sıkılır emin olun. Bu adım sırasında vidaları simetrik olarak sıkılır emin olun (Şekil 1a).
5. Hepatosit tohumlama orta içeren Williams E orta, çözülme ve takviyeleri, % 5 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 µM deksametazon 37 ° c daha önce astar kaplama birincil hepatosit prewarm.
6. Tamamen monte plaka içinde çamaşır dock yerleştirerek ve orta her şey rezervuar tarafına tohum hepatosit 400 µL ekleyerek Başbakan. Plaka çamaşır dock tamamen oturana emin olun.
7. 1 µL/s'de 3,5 dakika yukarı doğru yönde akışı başlatın. Başarılı işlevi mikrosıvısal dolaşım plaka (Şekil 1a) tarafında kırmızı göstergeleri ile tespit edilebilir.
8. Bir kez orta plaka hücre büyüme tarafına pompalanır, akışı Kanal doğru Meclisi sağlanması orta tohum hepatosit bir ek 1.2 mL ekleyin.
9. Dikkatle plaka 37 ° C ve % 5 CO₂ oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine transfer ve akışını 1 µL/s 16 h (Şekil 1 c) için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
10. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyi kabarcıkları ortadan kaldırmak.
11. Steril, filtre kağıdı, ardından bir hücre eki iskele ve istinat bir halkaya, steril forseps kullanarak her şey yuvarlak ekleyin. Her şey steril lavabo pompası ile aşağı istinat yüzük ve iskele (Şekil 1b) kilitlemek için tuşuna basın.
12. Tüm Orta Aspire edin ve prewarmed hepatosit tohumlama Orta 400 µL yavaşça iskele üzerinde ekleyin ve akışını 3,5 dk 1 µL/s için aşağıya doğru yönde başlatmak.
13. Tüm Orta plaka rezervuar yan dışarı pompalanır Aspire edin. Bu akışı kanal içinde yer alan orta değiştirmek için gerekli bir adımdır.
14. Orta ve her şey iyi başına toplam hacim tamamlamak için dock plaka dönmeden önce tohum hepatosit 1.4 mL ekleyin. Birimin başına iyi şimdi 1.6 mL (1.4 mL iyi ve akış kanaldaki 0.2 mL) olduğunu.

2. çözülme ve Monocultures için tetkikine tohum

1. Orta ve hepatosit tohumlama orta PHH bir şişe tedarikçiler yönergelerine göre çözülme önce 37 ° C olarak çözdürme hepatosit prewarm. Bir santrifüj ani sıcaklık değişiklikleri önlemek için bu adımı sırasında oda sıcaklığında kullanın. Çözme ve bir sınıf II kabine tetkikine, tohum gerçekleştirin.
2. Hepatosit tohumlama orta 1 mL hücrelerde resuspend ve trypan mavi kullanarak hücreleri saymak. Hücrelerin canlılık %90 üzerinde olduğundan emin olun.
3. Onlar için kuyu eklenene kadar hücreler buz üzerinde tutmak.
4. Denge ve montajı plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
5. 600.000 tetkikine hepatosit tohumlama orta 500 µL birimindeki her şey ekleyin.
6. Akış debisi 1 µL/s'lik yönü aşağı yönde başlatmak ve toplam hacim kuyuda 1.6 mL orta tohum hepatosit 900 µL ekleyerek getir.
7. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO₂oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon aktarın.
8. 1 µL/s 8 h, yukarı yönde 1 µL/s 8 h için akış hızında bir akış ters tarafından takip için akış hızında aşağıya doğru yönde akışı başlatın.
9. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
10. Her iyi ve başlatmak akışını 1 µL/s için 3,5 dk akış hızında aşağıya doğru yönde 400 µL hepatosit bakım Orta (Hepatosit bakım takviyeleri ve 100 nM deksametazon ile desteklenmiş Williams E orta) ekleyin.
11. Tüm Orta rezervuar Aspire edin ve 1.4 mL hepatosit bakım Orta (Şekil 1 d) ekleyin.
12. Orta hepatosit bakım orta her 48 h ile değiştirin. İyi tüm orta yerine emin olmak için taze hepatosit bakım orta eklenmesi önce çamaşır adımı gerçekleştirin.
13. Çamaşır adım için plaka çamaşır dock cihazına aktarmak, tüm Orta kuyulardan Aspire edin ve bakım Orta 400 µL ekleyin.
14. Akışını 1 µL/s'de 3,5 dk. aspiratı aşağıya doğru yönde tüm Orta kuyuları rezervuar tarafında görünen başlatın.
15. 1.4 mL hepatosit bakım orta ve oksijen inkübatör içinde 37 ° C'de ve % 5 CO₂ekleyin, plaka belgili tanımlık rıhtım istasyon aktarmak ve akışını 1 µL/s 48 h (Şekil 1f) için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
    Not: Denetimler için cocultures, denetlenen koşullar, sağlamak için kullanılan hepatosit monocultures için cocultures birincil insan Kupffer hücreleri ile kullanmak için belirli olan bakım orta ikinci tür kullanılır. 48 h hepatosit bakım Orta (3. gün sonrası tohum) ile orta tohum hepatosit değiştirdikten sonra düzenli hepatosit bakım orta coculture bakım orta II, özellikle ne zaman için karşılaştırma PHH monocultures değiştirilecektir Orta bileşenleri olarak PHH ve Kupffer hücrelerinin cocultures biraz farklı.

3. çözülme ve Kupffer hücreleri ve tetkikine ortak kültürler için tohum

1. Amacıyla doğru bir karşılaştırma sonuçları sağlamak için her zaman PHH/Kupffer hücre cocultures PHH monocultures için karşılaştırın
2. Cocultures PHH ve Kupffer hücrelerinin erimek için bir şişe içinde ileri Kupffer hücrelerinin Dulbecco'nın deksametazon olmadan kartal Orta (AdDMEM) değiştirilen ancak birincil hepatosit çözdürme ile desteklenmiş ve kaplama (coculture orta tohum) according takviyeleri Tedarikçiler yönergeleri için. Çözdürme ve Kupffer hücreleri ve bir sınıf II kabine tetkikine tohum gerçekleştirin.
3. 1 mL coculture orta tohum hücrelerinde resuspend ve trypan mavi kullanarak hücreleri saymak. Hücrelerin canlılık %90 üzerinde olduğundan emin olun.
4. Hücreleri hücre adezyon önlemek için kuyu eklemeden önce buz üzerinde tutun.
5. Birincil insan tetkikine çözdürme için adımlar 2,1-2.3 yönergeleri izleyin.
6. Denge ve montajı plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
7. 60.000 Kupffer hücreleri ve/veya 600.000 tetkikine toplam hacmi 250 µL her Orta tohum coculture her kuyuya ekleyin.
8. Akış debisi 1 µL/s'lik yönü aşağı yönde başlatmak ve orta ve her şey tohum coculture 900 µL ekleyin.
9. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO₂oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarın.
10. 1 µL/s 8 h, yukarı yönde 1 µL/s 8 h için akış hızında akış ters tarafından takip için akış hızında aşağıya doğru yönde akışı başlatın.
11. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
12. Coculture bakım Orta 400 µL eklemek için her iyi ve başlatmak akışını 1 µL/s için 3,5 dk akış hızında aşağıya doğru yönde ben (deksametazon hepatosit bakım takviyeleri ile desteklenmiştir ama olmadan AdDMEM).
13. Rezervuar tarafından gelen tüm Orta Aspire edin ve coculture bakım orta 1.4 mL ekleyin ben her şey için.
14. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO₂ oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarmak ve akışını 1 µL/s 48 h için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
15. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin. Coculture bakım orta II (deksametazon 100 nM hidrokortizon ve hepatosit bakım takviyeleri ile desteklenmiştir ama olmadan Williams E orta) 400 µL ekleyin ve akışını 1 µL/s'de 3,5 dk için aşağıya doğru yönde başlatmak.
16. Tüm Orta kuyuları rezervuar tarafında görünen Aspire edin.
17. Coculture bakım orta II 1.4 mL ekleyin ve Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO₂oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarın.
18. 1 µL/s 48 h (Şekil 1e) için akış hızında yukarı doğru yönde akışı başlatın.
19. Orta her 48 h coculture bakım orta II ile değiştirin. İyi tüm orta yerine emin olmak için taze orta eklenmesi önce çamaşır adımı gerçekleştirin.
20. Yıkamak için plaka çamaşır dock cihazına aktarmak, tüm Orta kuyulardan Aspire edin ve coculture bakım orta II 400 µL ekleyin.
21. Akışını 1 µL/s'de 3,5 dk. aspiratı aşağıya doğru yönde tüm Orta kuyuları rezervuar tarafında görünen başlatın.
22. Coculture bakım orta II 1.4 mL ekleyin ve Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO₂oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine aktarmak ve akışını 1 µL/s 48 h (Şekil 1f) için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.

4. bir bulaşıcı hepatit B virüsü enfeksiyonu etütler imalatı

1. Bu bölüm iletişim kuralının bir koruma düzey III laboratuvar gerçekleştirin. Tohum, orta değişiklikler, orta koleksiyonu ve bir sınıf II kabine virüs konsantrasyon yapmak.
2. Kültür HBV üreten hücrelerin (örn, HepDE19, HepAD38) kolajen kaplı T1000 5 katmanlı şişe tam DMEM/F12 (%10 FBS, penisilin/steptomycin, önemli olmayan amino asitler, 500 μg/mL G418 ve 1 μg/mL tetrasiklin) 120 ml % 90 confluency ulaşana kadar.
3. HBV üretim ikna etmek için indüksiyon Orta (tetrasiklin olmadan tam DMEM) orta değiştirin.
4. Tam orta ses her 48 h 12 gün tetrasiklin sonrası çekilmesi için toplamak ve 4 ° C'de saklayın
5. Toplanan orta 0,45 µm şişe ilk filtre ile filtre.
6. 4 g/g son bir konsantrasyon için toplanan orta steril PEG 8000 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içinde eklemek, 8 x-10 x ters çevirme mix ve 16 h. santrifüj 10.000 x g 1 h 4 ° C'de PEG çöktürülmüş virüs toplamak ve resuspend için de için 4 ° C'de kuluçkaya % 10 içeren PBS Pelet FBS.
7. PEG çöktürülmüş virüs--dan tüm hasat zaman noktaları birleştirmek ve bir % 20 sükroz yastık üstüne katman. 140.000 x g bir SW28 rotor kullanarak 4 ° C'de 16 h için de santrifüj kapasitesi.
8. Süpernatant Aspire edin ve Pelet PBS ile %10 FBS, ve aliquot içinde resuspend ve-80 ° C'de saklayın
9. HBV DNA kopyalama numarasını süpernatant içinde mevcut HBV DNA qPCR (adım 6) belirlemek.

5. enfeksiyon HBV ile 3D kültürlerin

1. Enfeksiyonlar bir sınıf II içinde bir koruma düzey III laboratuvar kabine gerçekleştirin.
2. 3 gün sonra monocultures veya cocultures, tohum HBV içeren aliquots oda sıcaklığında gerekli sayıda çözülme ve sırasıyla gerekli virüs doz hepatosit bakım orta veya coculture bakım orta II şey, başına 1,8 ml seyreltik.
3. Bu 1.8-mL sulandırılmış virüs çamaşır adım (400 µL) ve orta iyi (1.4 mL) değiştirilmesi için yeterlidir. Ancak, enfeksiyon gerekli çokluğu hesabına 1.6 mL son kültür hacmi için ayarlanması gerekir.
4. Plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin. HBV içeren Orta 400 µL ekleyin ve tüm Orta görünen kuyuları rezervuar tarafında akışını 1 µL/s'de 3,5 dk. aspiratı aşağıya doğru yönde başlatmak.
5. 1.4 mL başına orta II iyi ve 37 ° C'de ve % 5 CO₂oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon içine plaka transfer HBV içeren bakım orta/coculture bakım ekleyin. 1 µL/s 8 h, bir akış hızı 1 µL/s'lik yönü yukarı doğru yönde bir ters tarafından takip için akış hızında aşağıya doğru yönde akışı başlatın.
6. 24 h HBV, eklenmesi aşağıdaki plaka çamaşır dock cihazına aktarın ve kuyulardan tüm Orta Aspire edin.
7. Her yıkama de plaka kültür türüne göre karşılık gelen orta ile 3 x içinde özetlenen adımlar 2.12-2,14 kuyudan arta kalan virüs ortadan kaldırmak için. Adımlar 2.12-2,14, aksine orta 1.6 mL her kuyuya hesap inoculum ertelenmiş (Şekil 1 g) dışlamak için tatmak ilave birim için ekler.
8. Bu çamaşır merdiven orta 200 µL ekstraselüler HBV DNA miktar tarafından HBV inoculum tümüyle kaldırılmasını onaylamak için her şey toplamak.
9. Plaka 37 ° C'de ve % 5 CO₂oksijen inkübatör içinde belgili tanımlık rıhtım istasyon takabilir ve akışını 1 µL/s 48 h için akış hızında yukarı doğru yönde başlatmak.
10. 48 saat sonra aşağı akım analizi, hepatosit bakım orta ile üç yıkama 2.12-2,14 adımlarda açıklandığı şekilde ardından tam iyi birimde toplamak. Orta yerine ve her iyi 3 x her 48 saat kadar deneysel fesih yıkayın.

6. miktar ekstraselüler HBV DNA'ın

1. Kültür supernatants taşıyıcı RNA bir koruma düzey III lab 1 µg ilavesi ile üretici yönergelerine farklı bir alana taşımak önce örneklerinde virüs inactivation sağlamak göre toplam DNA izole et.
2. Kantitatif PCR ana mix, 600 nM ileri astar, 600 nM ters astar, içeren bir ana karışım hazırlamak ve 300 nM sonda.
3. 7 µL 384-şey plaka her kuyuya ana karışımı ekleyin.
4. DNA örnekleri 5 µL yinelenen, bir no-şablon kontrol ve seri olarak seyreltilmiş HBV-standart genom içeren (örneğin, pCMV-HBV) plazmid tabanlı tepki tepki her kuyu başına 10² kopya başına 10⁹ kopya arasında değişen kopyası eklemek qPCR plaka.
5. Plaka üzerinde bir yapıştırıcı kapağını yerleştirin ve her şey doğru şekilde kilitlendi emin olun.
6. 1dk 300 x gde plaka santrifüj kapasitesi.
7. Üreticinin yönergelerine göre çalıştırmak qPCR başlayın. 95 ° C 10 min 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip için döngüsü koşullardır gerçek zamanlı PCR 15 s ve 60 ° C için 1 dk için.
8. Bilinmeyen örnekleri standart eğri göre içinde HBV DNA kopya sayısını ölçmek.

7. miktar, hücre içi HBV Pregenomic (pg) RNA

1. Üreticinin yönergelerine göre iskele üzerinden toplam RNA yalıtmak. Tam hücre lizis sağlamak amacıyla, girdap her İskele yapısı-3 x 30 s her vortexing arasında aralıklarla 300 x g 1 dk. için de izledi. Hücre lizis koruma düzeyi farklı bir alana taşımak önce örneklerinde virüs inactivation sağlamak için III laboratuvar gerçekleştirin.
2. CDNA dan izole RNA üretici yönergelerine göre uyarlamak.
3. 25 ° C 10 dk, 37 ° C 120 dakika için döngüsü koşullar için retrotranscription ve 5 min için 85 ° C.
4. CDNA örnekleri için 4 ° C'de tutmak kısa vadeli veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de.
5. PgRNA ve RPS11 içeren kantitatif PCR ana mix ve pgRNA ve RPS11 (kat hizmetleri gen kullanılan) için ileriye ve geriye doğru astar 0.2 µM son bir konsantrasyon, ana karışımları hazırlayın.
6. 7.5 µL ana mix ve cDNA iyi başına 2.5 µL 384-şey tabağa ekleyin. RPS11 ve pgRNA yinelenen her örneğinin ölçmek ve no-şablonu her iki genler de kumandasında içerir.
7. Plaka üzerinde bir yapıştırıcı kapağını yerleştirin ve her şey tamamen kilitlendi emin olun.
8. 1dk 300 x gde plaka santrifüj kapasitesi.
9. QPCR cycler eklemek plaka ve üreticinin yönergelerine göre standart kantitatif PCR protokolü kullanarak çalıştırmak qPCR başlar. 2 dk, 95 ° C için 2 dk, 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip döngüsü gerçek zamanlı PCR 50 ° C koşullar 15 s ve 60 ° C için 1 dk için.
10. PgRNA RPS11 göre ifade hesaplayın.

8. ayirt Viral antijen ile boyama

1. İstinat Yüzük kuyudan çıkarın ve bir sınıf II kabine koruma düzey III laboratuarında forseps ile iskele kaldırın.
2. Hücreyi içeren iskele %4 paraformaldehyde PBS 1 ml koruma düzey III laboratuvar oda sıcaklığında 30 dakika ile düzeltmek. Aşağıdaki adımları farklı bir alanda gerçekleştirilir.
3. İskele 3 yıkama x 1 mL PBS ile.
4. % 0.1 kullanarak hücreleri permeabilize Triton-X 100 PBS 1 ml oda sıcaklığında 1 h için.
5. İskele 3 yıkama x 1 mL PBS ile.
6. 4 ° C'de 16 h blok non-spesifik bağlama tarafından PBS 1 ml %1 BSA ile iskele kuluçka
7. İskele 3 yıkama x 1 mL PBS ile.
8. 16 h 4 ° C'de 1: %200 1 BSA PBS 1 ml içinde seyreltme, tavşan anti-hepatit B virüs core antijeni kullanarak birincil antikor boyama gerçekleştirmek
9. İskele 1 yıkama x % 0.1 ile 1 mL PBS (PBS-ara) ve 3 x 1 mL PBS ile ara.
10. Kullanarak ikincil antikor boyama gerçekleştirmek keçi Anti-tavşan IgG (H + L) çapraz adsorbe Alexa Fluor 594 Birleşik ikincil antikor 1:2,000 PBS 1 ml için 16 h 4 ° C'de % 1 BSA içinde seyreltme,
11. İskele 1 yıkama x 1 mL % 0.1 ile PBS-ara ve 3 x 1 mL PBS ile.
12. Oda sıcaklığında 10 dakika için PBS 1 ml 2 µg/mL bir konsantrasyon, DAPI kullanarak iskele counterstain.
13. İskele 1 yıkama x 1 mL % 0.1 ile PBS-ara ve 3 x 1 mL PBS ile.
14. İskele mikroskop slayda aktarmak ve görüntüleme için monte edin.
15. Bir floresan mikroskop kullanarak iskele görüntü.

9. İnsan Albumini ELISA

1. Bulaşıcı malzeme ile çalışıyorsanız koruma düzeyini III laboratuvar ayrılan bu bölüm iletişim kuralının bir sınıf II kabine içinde gerçekleştirin.
2. Canlılık ve metabolik PHH işlevselliğini değerlendirmek için insan albumini üretiminde ELISA değerlendirin.
3. Kat 96-şey pilakalar ve keçi anti-insan antikor kuyu başına 50 µL 1:800 kaplama arabellek (100 mM bikarbonat/karbonik asit, pH 9,6) içinde seyreltilmiş. Kuruyucu ve 37 ° C'de 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
4. Kaplama antikor plaka Aspire edin ve yıkayın 4 x %0,05 200 µL ile PBS-ara.
5. Engelleme arabelleği (PBS % 1 BSA) 200 µL ekleme, kuruyucu ve onları 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya veya 4 ° C'de 3 ay için stok onları. Uzun süreli depolama için % 0.05 sodyum azid engelleme arabelleğe ekleyin.
6. Engelleme arabellek Aspire edin ve 1 x %0,05 200 µL ile yıkayın PBS-ara.
7. Daha önce seyreltilmiş örnek iyi (1: 100) / 50 µL ekleyin. Örnek seyreltici %0,05 %1 BSA içeren PBS-ara. 1 h 37 ° C'de veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
   Not: standartları örnekleri aynı anda kuluçkaya. Bir konsantrasyon aralığı 500 – 0.488 ng/mL (1:2 seri dilutions) önerilir. İnsan Albumini tüm seri dilutions örnek seyreltici gerçekleştirin.
8. Plaka örneklerinden Aspire edin ve yıkayın 4 x %0,05 200 µL ile PBS-ara.
9. HRP-Birleşik keçi anti-insan albumini antikor 50 µL daha önce 1:10,000 örnek seyreltici içinde seyreltilmiş ekleyin. 37 ° C'de 2 h veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
10. Plaka antikor Aspire edin ve yıkayın 6 x %0,05 200 µL ile PBS-ara.
11. TMB reaktif 100 µL ekleyin ve en kısa zamanda en yüksek standartları tam olarak gelişmiş, 100 µL 1 M H₂yani ekleyin kolorimetrik reaksiyon durdurmak için₄ .
12. 450 absorbans okumak nm bir 96-şey plaka okuyucu analiz için.

10. interlökin (IL) 6 ve tümör nekroz faktör (TNF) α üretimi 3D Co kültürlerde

1. Bulaşıcı malzeme ile çalışıyorsanız koruma düzeyini III laboratuvar ayrılan bu bölüm iletişim kuralının bir sınıf II kabine içinde gerçekleştirin.
2. Birincil Kupffer hücreleri canlılığı ve işlevlerinin değerlendirmek için IL6 ve TNFα üretim ölçmek. Bu sitokinler Kupffer hücreleri tarafından üretimi ikna etmek için cocultures 1 µg/mL lipopolysaccharide (LPS) 9 d sonrası 48 h coculture bakım orta II tohum ile tedavi.
3. Gün sonrası 11 Ekim tarihi, her şey ortamından hasat ve-80 ° C'de depolayın
4. Kültür orta IL6 ve TNFα konsantrasyon tarafından uygun bir tahlil ve üreticinin yönergelerine göre ölçmek.

Sonuçlar

Biz birincil insan Kupffer hücreleri ve/veya tetkikine ve onların enfeksiyon HBV ile uzun vadeli kültür için basit ve çok yönlü bir platform tanımlamak. Birincil insan hücreleri kollajen kaplı polistren iskele sürekli büyüme orta (Şekil 1a) hücrelerle perfuses bir mikrosıvısal plaka derleme içindeki seribaşı.

Genellikle sadece sınırlı bir süre için geleneksel kültür sistemlerinde istikrarlı, PHH işlevsel olarak uzun bir süre için muhafaza edilebilir. Fonksiyonel hepatositler tarafından salgılanan ve hepatik metabolizma değerlendirilmesi için en iyi işareti olarak kabul edilir, insan albümin, stabil ve son derece 3D kültürler tarafından gün 40 sonrası tohum kadar (Şekil 2) ifade edilir. Cocultures için belirli sitokinler (örneğin, IL6 ve TNFα) salgılanmasını Kupffer hücre işlevselliği ve canlılığı değerlendirilebilir. Sitokin üretim ölçmek için LPS-cocultures uyarılması üzerine yakalama tabanlı algılama araçlarının kullanımı (Şekil 3) tavsiye edilir.

Hücreleri genellikle 3 gün içinde işlevsel safra kanalcık ve tam hücre polarizasyon (Şekil 2) gösteren PHH tohum, hepatik microtissues oluştururlar. Onların fizyolojik hücre metabolizması istinat ek olarak, bu kültürler HBV enfeksiyonu için son derece duyarlı hale gelir. HBV DNA ve diğer kültür sistemleri, aksine diğer viral işaretleri 2 gün sonrası enfeksiyondan (Şekil 4) kolayca algılanabilir hale gelir. Viral enfeksiyon salgılanan işaretleri yanı sıra, hepatosit içeren iskele alınabilir kültürler ve viral antijenler ayirt tespiti için kullanılan (örneğin, HBsAg, HBcAg) (Şekil 4). Nerede geleneksel hepatosit kültürler aşılama ile en az 500 HBV GE hücre ve % 2 DMSO ek ücret isteyen ve % 4 PEG, 0,05 HBV GE az olan DMSO veya PEG (Şekil 4) 3-b kültürlerde zorunluluğu olmadan enfeksiyon başlatmak mümkün.

Şekil 1: 3-b karaciğer-on-a-chip kültürlerin Set-up. (bir) Bu bir Şematik düzeni kültür plaka Meclisi mikrosıvısal dolaşım kurulmasını sağlamak için 's. (b) Bu panel gösterir de dahil olmak üzere kültür wells, yakından görmek filtre kağıdı, iskele ve istinat yüzük. (c) Bu panel kültürler tohum önce plaka denge süreci gösterir. Sonraki iki panel (d) hepatosit monocultures ve (e) hepatosit/Kupffer hücre için cocultures tohumlama işlemi gösterir. (f) Bu panel çamaşır adımları fiş boşaltmaya karışan orta değişiklikler gösterir. (g) HBV enfeksiyonu kurulumu inoculum kaldırılması da dahil olmak üzere, bu panel gösterir. S.M. tohumlama orta, mm = bakım orta =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: hepatik microtissue oluşumu ve hepatosit canlılığı. (bir) Bu panel gösterir takip microtissue oluşumu gösteren 3D hepatosit monocultures görüntülerini boyuna aydınlık alan tohumlama. (b) Bu panel gösterir ayirt görüntüleme çekirdeği (mavi) kültürler ve insan albumini (yeşil). (c) Bu panel boyuna toplam albümin gösterir, hem de hücre başına hepatosit monocultures, 40 gün boyunca albümin üretim ELISA tarafından belirlendiği şekilde ayarlanabilir. Gösterilen veriler ortalama ± SD vardır Bu rakam Ortega Prieto ve ark.⁴den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: 3-b cocultures Kupffer hücre işlevindeki. Bu paneller göstermek salgılanmasını (bir) IL6 ve (b) TNFα hepatosit monocultures ve 11 gün insan manyetik kullanarak belirlenen tohum sonrası gün 9 mesaj tohum, exogenously eklenen LPS karşılık olarak hepatosit/Kupffer hücre cocultures Luminex tahlil. Bu rakam Ortega Prieto ve ark.⁴den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: HBV enfeksiyonu karaciğer-on-a-chip kültürlerde. (bir) Bu panel ayirt mikroskobu algılama HBcAg (kırmızı), HBsAg (yeşil) ve çekirdek (mavi) kültürleri ile HBV enfeksiyonu izleyen 10 gün gösterir. (b) Bu panel HBV DNA bir miktar olarak kültür supernatants tarafından belirlenen enfeksiyon, farklı çeşitlilikler kullanarak HBV enfeksiyonu kültürlerin duyarlılık gösterir. (c) Bu panel HBV pgRNA temizlik gen RPS11 göre boyuna birikimi miktar gösterir. Gösterilen veriler ortalama ± SD vardır Bu rakam Ortega Prieto ve ark.⁴den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Uzun vadeli PHH kültürleri korumak zorluklar birçok kültür modeli geliştirilmesi artırılmış işlevsellik ve uzun ömürlü, her farklı avantajları ve dezavantajları sergilenmesi ile tahrik. O şimdi 2D kültürleri statik PHH zaman çok sınırlı miktarda hepatosit biyoloji bazı yönlerini taklit eden yaygın kabul edilmektedir. Böylece, micropatterned^12,13, küresel kültürler^14,15, cocultures ve 3D karaciğer-on-a-chip kültürler^16,17 hızla bu daha temel sistemleri değiştirme. Özellikle belirli microenvironments kullanmak için ev sahibi ile coevolved, bulaşıcı hastalıklar, okurken fizyolojik ortamlar sağlamak için gereksinim insan-tropic kültür kez zorlu doğa tarafından desteklenen bulaşıcı hastalıklar, Hepatit C virüsü, HBV ve sıtma gibi.

3D karaciğer-on-a-chip kültürler yerine en kritik kalite başlangıçta kaynaklı birincil hücre tiplerinin adımdır. Bu hücreler-meli var olmak sınav için onların bağlılık kapasitesi ve sadece plateable PHH çok başarılı doku oluşumu ve kültür üretimi sağlamak için kullanılmalıdır. Taze izole PHH kullanılabilir olsa bile, onların dondurma genellikle karmaşık ve özel dondurucular oranı kontrol gerektirir.

Geleneksel statik 2D kültürler, aksine ana bilgisayar genetik arka plan HBV enfeksiyonu duyarlılık açısından ihmal edilebilir düzeydedir ve tüm böylece uzak test hepatosit bağış HBV enfeksiyonu⁴kurmak mümkün.

Rağmen hasta elde edilen HBV enfeksiyonlar 3D kültürlerin kurar, PEG çöktürülmüş kullanmak zorunludur ve sukroz yastık-HBV indüklenebilir HBV yapımcı hücre kullanarak viral inocula üretimi için hatları her saf. Doğrudan 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, inhibitör faktörleri veya tetkikine ile mevcut büyüme faktörlerinin bir uyumsuzluk nedeniyle yoluyla uygulanan hücre kültür supernatants kolayca enfeksiyonu neden değil. Plazma kaçınılmaz pıhtılaşıyor ve kültür platformu mikrosıvısal dolaşımını takunya beri Ayrıca, hasta kaynaklı viral inocula seçerken, yalnızca serum, kullanılmalıdır.

Kullanılan viral inoculum ne olursa olsun, hücresel canlılığı ve farklılaşma temin yanı sıra ilk HBV inoculum tümüyle kaldırılmasını sağlamak başarılı uzun vadeli enfeksiyon çalışmalar anahtarıdır. Bunu yapmak için en uygun yolu viral inoculum kaldırılması aşağıdaki gibi insan serum albümin düzeyleri kültür süresi boyunca ölçme kültürler örnekleme. Dikkat, tüm diğer açıklanan platformlar, HBV enfeksiyonu, benzer şekilde, bir kez kurulan, kolayca kandan hücrelere yayılmış değildir. HBV enfeksiyonu içinde vivo kolayca hepatosit karaciğer içinde çoğunluğu bulaşan beri bunun için altta yatan mekanizma zor kalır.

Açısından cocultures PHH ve Kupffer hücrelerinin tüm ticari olarak mevcut Kupffer hücre bağış eşit bir yanıt beri IL6 ve TNFα salgı LPS stimülasyon, yanıt olarak değerlendirmek için Kupffer hücrelerinin çok testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

Önemlisi, bütün ilaç tedavileri veya HBV ile kültürlerin ilk enfeksiyon için kuyu (1.4 mL), de mikrosıvısal kanal (0.2 mL), tarihi itibariyle toplam hacmi alınmalıdır dikkate uyuşturucu ya da inoculum konsantrasyonları hesaplanması için. Doğru dozaj sağlamak için mikrosıvısal kanal Başbakan için bir yıkama adım HBV veya uyuşturucu içeren orta ile gerçekleştirilir.

Platformu kullanılan iskele içinde çok katmanlı tetkikine sağlayan şey, başı 600.000 PHH kullanır. Cep numarası farklı olsa bile, seçilen hücre toplama en iyi sonuçları sağlar. Plaka biçimi için 36 iskele yükseltilebilir 12 iskele toplam tutar. Ancak, mikrosıvısal gereksinimleri nedeniyle, daha iyi numaralarına kadar ölçeklendirme bugüne kadar mümkün değildir.

Bu yaklaşımları kullanarak, kültürler, şimdiye kadar yanı sıra yeni ilaç adaylarının değerlendirmek için farklı karaciğer hücre arasındaki karmaşık etkileşim çalışma benzeri görülmemiş fırsatlar sunan en iyi cep performans için en az 40 gün, ile korunabilir nüfus HBV enfeksiyonu sırasında.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
William's E Medium, no phenol red	GIBCO	A12176-01
Hepatocyte Thaw Medium	GIBCO	CM7500
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	GIBCO	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	GIBCO	CM4000
DMEM/F-12	GIBCO	11320-033
Advanced DMEM	GIBCO	12491023
DPBS, no calcium, no magnesium	GIBCO	14190-144
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x	GIBCO	11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	GIBCO	15140-122
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture	SIGMA	12106C
Hydrocortisone	SIGMA	H0888
Trypan blue	Merck	T8154
Collagen from calf skin	Merck	C9791
G418	SIGMA	G418-RO
Tetracycline	SIGMA	T3258
Polyethylene glycol 8000	SIGMA	P2139
Sucrose	SIGMA	SO389
Sodium carbonate anhydrous	SIGMA	451614-25G
Sodium bicarbonate	SIGMA	S5761
Sodium azide	SIGMA	S2002-5G
Sulfuric acid, 99.999%	SIGMA	339741
4% Paraformaldehyde	SIGMA	252549
Triton-X 100	SIGMA	X100
Tween 20	SIGMA	P1379
DAPI	SIGMA	D9564
Albumin (human)	SIGMA	A9731
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisher Scientific	BP9701-100
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Applied Biosystems	4440040
SYBR Select Master Mix	Applied Biosystems	4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps
Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits/Consumables
Sterile membrane	CN Bio innovations	LC-SC
LiverChip Perfusion cell culture plate	CN Bio innovations	LC12
LiverChip culture plate lid	CN Bio innovations	LC-SC
Sterile round filter paper	CN Bio innovations	LC-SC
Cell attachment scaffold	CN Bio innovations	LC-SC
Retaining ring	CN Bio innovations	LC-SC
Sterile plunger	CN Bio innovations	LC-ST
Dneasy blood & tissue kit	Qiagen	69506
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
Human Magnetic Luminex assay	R&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution	ThermoFisher Scientific	34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set	Qiagen	1048147	Containing RNA carrier
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile	Millipore (Merck)	PFHYS1008
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Life technologies	4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film	Life technologies	4311971
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates	ThermoFisher Scientific	442404
Sealing Tape for 96-Well Plates	ThermoFisher Scientific	15036
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane	ThermoFisher Scientific	295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost	Fisher Scientific	FB58628
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	344058
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary cells / Cell lines
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified	Thermo Fisher Scientific	HMCPTS
Cryopreserved Human Kupffer Cells	Thermo Fisher Scientific	HUKCCS
HepDE19 cell line	Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA forward primer	Invitrogen		5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'
HBV DNA reverse primer	Invitrogen		5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'
HBV DNA probe	Invitrogen		5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA forward primer	Invitrogen		5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'
pgRNA reverse primer	Invitrogen		5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'
RPS11 forward primer	Invitrogen		5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'
RPS11 reverse primer	Invitrogen		5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'
pCMV-HBV	Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal)	DAKO	discontinued	Lot 10102505
Human Albumin Antibody, A80-129A	Bethyl Laboratories. inc	A80-129A
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P	Bethyl Laboratories. inc	A80-229P
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	# A-11072	Lot 1431810
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
LiverChip Vacuum pump	CN Bio innovations	LC-PN
LiverChip Pneumatic Hookup	CN Bio innovations	LC-PN
LiverChip platform	CN Bio innovations	LC-PN
LiverChip plate washing dock	CN Bio innovations
Autoclavable metal forceps	VWR	232-0106
Vortex Genie 2	Scientific industries	SKU: SI-0236
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95765
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	75004500
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow	MGE worldwide	SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERIES incubator	NUAIRE	NU-5841
Automated precision torgue	CN Bio innovations
Manual torque	CN Bio innovations
LiverChip compressor	CN Bio innovations
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1	Luminex
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block	ThermoFisher Scientific	Millipore™ 40-285
FluoStar Optima Plate Reader	BMG Labtech
KOLVER Precision electric screwdrivers	VTECH ltd	FAB10RE/FR
KOLVER Power supply	VTECH ltd	EDU1FR
BAMBI VTS75D	Air Equipment	Discontinued
Integra Vacuboy	INTEGRA
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	ThermoFisher Scientific	4453536