« Foie-on-a-Chip » Cultures d’hépatocytes primaires et des cellules de Kupffer pour Infection de Virus de l’hépatite B

Résumé

Le but du présent protocole est de fournir un guide étape par étape pour réaliser des expériences 3D « foie-on-a-chip » infection par le virus de l’hépatite B.

Résumé

Malgré l’infectivité exceptionnelle du virus de l’hépatite B (VHB) in vivo, où seulement trois génomes viraux peuvent entraîner une chronicité des chimpanzés infectés expérimentalement, plus les modèles in vitro nécessitent plusieurs centaines de milliers de génomes viraux par cellule chez afin d’initier une infection transitoire. En outre, les cultures d’hépatocytes humains primaires (PHH) 2D statiques permettent uniquement les études à court terme en raison de leur rapide dédifférenciation. Nous décrivons ici 3D cultures de foie-on-a-chip de PHH, soit en monocultures cocultures avec d’autres cellules de foie-résident parenchymateuses. Ceux-ci offrent une amélioration significative à l’étude des infections à HBV à long terme avec les réponses des cellules hôtes physiologiques. En plus de faciliter les études de l’efficacité des médicaments, analyses toxicologiques et enquêtes sur la pathogenèse, ces systèmes microfluidiques permettent l’évaluation des thérapies curatives visant à éliminer par covalence fermé, infection par le VHB circulaire (ccc) ADN. Ceci présente méthode décrit la mise en place de PHH monocultures et les cultures de cellules co PHH/Kupffer, leur infection par le VHB purifiée et l’analyse des réponses de l’hôte. Cette méthode s’applique à l’évaluation des effets à long terme de l’infection à VHB, combinaisons de traitements et pathogenèse.

Introduction

L’étude du VHB a été compliquée par la mauvaise sensibilité des systèmes de culture, obligeant plusieurs centaines de milliers de copies de génome du VHB par cellule pour lancer l' infection¹. En outre, des hépatocytes humains primaires sont généralement extrêmement fragiles et dédifférencient rapidement au cours des cultures classiques². Ceci est principalement dû au fait que les surfaces en plastique plats et durs ne pas imiter les milieux extracellulaires naturels que se trouves dans le foie de l’absence générale d’oxygénation des cultures en l’absence de circulation de la microfluidique. Rapidement, des cultures d’hépatocytes statiques classiques sur des plaques recouvertes de collagène dédifférencient et perdent leur susceptibilité à l' infection de HBV³. Nous décrivons ici la mise en place et l’infection de PHH en cultures de foie-on-a-chip 3D, qui sont très avantageuses sur les cultures PHH statiques 2D classiques sur des plaques recouvertes de collagène en raison de leur compétence étendue de métabolique et fonctionnel, facilitant cultures à long terme d’au moins 40 jours⁴. Dans ce système, PHH sont ensemencées sur des échafauds enduit de collagène, qui sont continuellement perfusés avec milieu de culture pour fournir l’oxygène et des nutriments vers les cellules. Même si les systèmes de culture alternative pour PHH basée sur cocultures complexes de fibroblastes murins ou croissance 3D en sphéroïdes ont été validées et sont sensibles à l’infection par le VHB à l’aide des multiplicités d’infection de 500 génomes (GE) du VHB par cellule, 3D foie-on-a-chip cultures restent le système unique modèle in vitro sensible à 0,05 GE du VHB par cellule⁴. C’est en outre étayé par la nécessité d’utiliser des concentrations élevées de diméthylsulfoxyde (DMSO) et le polyéthylène glycol (PEG) pour établir l’infection par le VHB dans ces cultures, qui est dispensable pour l’infection des systèmes de culture de foie-on-a-chip 3D ⁴. parmi les principales caractéristiques du VHB, l’infection est la piscine cccDNA, constituant ainsi le modèle transcriptional pour tous de novo–produit des virions,^5,6. Même si cccDNA peut être détectée dans les hépatocytes classiques cultures^7,8, on ne sait pas quant à savoir si la réglementation de cccDNA et toute approche thérapeutique visant à éliminer est récapitulées dans partiellement ou hépatocytes complètement dédifférenciées. Nous avons montré que cccDNA est formé sur le plan fonctionnel dans les cultures de foie-on-a-chip 3D, répond à des stimuli physiologiques et peut être ciblé en interférant avec l’accessibilité de la machinerie transcriptionnelle au génome cccDNA⁴.

Réactions de l’hôte à l’infection par le VHB dans 3D imitateur de foie-on-a-chip ceux observés chez les patients infectés par le VHB, permettant l’identification de biomarqueurs de l’infection, mais aussi le succès thérapeutique. Parmi les caractéristiques uniques du foie-on-a-chip cultures est la possibilité d’évaluer à long terme h6te entre PHH et autres cellules parenchymateuses dans le foie, y compris les cellules⁴Kupffer, cellules étoilées⁹et foie sinusoïdal les cellules endothéliales^10,11. Cela offre l’occasion unique pour évaluer les interactions cellule/cellule dans un micro-environnement 3D complexe.

En outre, la période de culture prolongée de cette plate-forme facilite l’évaluation des traitements médicamenteux séquentiel et leur impact sur la persistance du VHB, qui ne sont pas possibles à l’aide de systèmes de culture conventionnels hépatocyte.

Ce protocole décrit comment 3D foie-on-a-chip cultures sont générés, soit pour les monocultures de PHH cocultures de PHH avec des cellules de Kupffer. En outre, nous décrivons la production du VHB purifié pour les études de la basse-multiplicité de l’infection, ainsi que l’analyse subséquente de l’hôte et réponses virales.

Protocole

1. montage et équilibrage des plaques

1. Vérifiez que le compresseur et la pompe à vide associé à la plate-forme de LiverChip sont sous tension. Effectuer le montage et l’équilibrage des plaques dans une classe II du cabinet.
2. Aseptiquement assembler les plaques microfluidique en plaçant une membrane stérile entre la plaque de base et en ajoutant la plaque contenant bien supérieure (Figure 1 a).
3. Veiller à ce que la membrane stérile sans à-coup repose sur les deux broches de la plaque de base, depuis le compromis de placement membrane inégale la circulation de la microfluidique.
4. Ajouter un couvercle de plaque stérile et serrer les vis à la base de la plaque à l’aide d’un couple de précision automatisé à 33 lb à l’aide d’une spirale séquence de serrage. Veiller à ce que toutes les vis sont serrées à 35lbs couple manuel. Au cours de cette étape, s’assurer que les vis sont serrées de façon symétrique (Figure 1 a).
5. Réchauffer au préalable les hépatocytes semis moyenne contenant Williams E moyenne, primaires d’hépatocytes dégel et placage de suppléments, 5 % sérum fœtal (SVF) et 1 µM dexaméthasone à 37 ° C avant l’amorçage.
6. Amorcer la plaque entièrement Assemblée en le plaçant dans la station de lavage et ajout de 400 µL d’hépatocytes ensemencement moyen sur le côté du réservoir de chaque puits. Assurez-vous que la plaque s’enclenche dans le dock de laver complètement.
7. Ouvrir le flux vers le haut pour 3,5 min 1 µL/s. La fonction réussie de la microfluidique de circulation peut être déterminée grâce à des indicateurs rouges sur le côté de la plaque (Figure 1 a).
8. Une fois que le milieu est pompé vers le côté de la croissance cellulaire de la plaque, assurer un montage correct du chenal d’écoulement, ajouter 1,2 mL d’hépatocytes ensemencement moyen supplémentaire.
9. Soigneusement la plaque de transfert dans la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO₂ et ouvrir le flux vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 16 h (Figure 1C).
10. La plaque de transfert à la station de lavage et d’éliminer les bulles dans le puits de pipetage doucement verticalement.
11. Add-on de stériles, round papier-filtre, suivi d’un échafaudage d’attachement cellulaire et un circlips, dans chaque puits à l’aide d’une pince stérile. Appuyer chaque puits avec un piston stérile pour bloquer les anneaux de retenue et les échafaudages en place (Figure 1 b).
12. Aspirer tous les moyen et ajouter 400 µL de milieu semis hépatocyte préchauffée doucement sur l’échafaud et initier le flux dans la direction vers le bas pour 3,5 min 1 µL/s.
13. Aspirer toutes les moyennes pompée hors du côté du réservoir de la plaque. Cette étape est nécessaire pour remplacer le milieu contenu dans le canal d’écoulement.
14. Ajouter 1,4 mL d’hépatocytes ensemencement moyen dans chaque puits avant de regagner le quai pour compléter le volume total par puits de la plaque. Le volume de chaque puits est maintenant 1,6 mL (1,4 mL dans le puits et 0,2 mL dans le chenal d’écoulement).

2. dégel et l’ensemencement des hépatocytes de Monocultures

1. Réchauffer au préalable les hépatocytes dégel moyenne et moyenne semis hépatocytes à 37 ° C avant le dégel d’un flacon de PHH conformément aux instructions du fournisseur. Utiliser une centrifugeuse à température ambiante pendant cette étape afin d’éviter les changements brusques de température. Effectuer la fonte et l’ensemencement des hépatocytes dans une classe du cabinet II.
2. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de semis hépatocyte et compter les cellules à l’aide de bleu trypan. Veiller à ce que la viabilité des cellules est supérieur à 90 %.
3. Garder les cellules sur la glace jusqu'à ce qu’ils sont ajoutés dans les puits.
4. Transférer la plaque équilibrée et entièrement Assemblée à la station de lavage et aspirer toutes les moyennes des puits.
5. Ajouter 600 000 hépatocytes dans chaque puits dans un volume de 500 µL de milieu semis hépatocytaire.
6. Ouvrir le flux dans la direction vers le bas à un débit de 1 µL/s et porter le volume total dans le puits à 1,6 mL en ajoutant 900 µL d’hépatocytes ensemencement moyen.
7. La plaque de transfert à la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂.
8. Ouvrir le flux dans la direction vers le bas à un débit de 1 µL/s pendant 8 h, suivie d’une inversion de flux vers le vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 8 h.
9. La plaque de transfert vers le quai de laver et aspirer toutes les moyennes des puits.
10. Ajouter 400 µL de milieu de maintenance de hépatocytaire (Williams E milieu additionné de suppléments entretien hépatocyte et 100 nM dexaméthasone) pour chaque flux de bien et initier la vers le bas à un débit de 1 µL/s pendant 3,5 minutes.
11. Aspirer toutes les moyennes du réservoir et ajouter 1,4 mL du milieu de maintenance hépatocytaire (Figure 1D).
12. Remplacez le support par moyen de maintenance hépatocyte toutes les 48 h. Afin d’assurer que tous les moyens dans le puits est remplacé, effectuer une étape de lavage avant l’ajout du support de maintenance hépatocyte fraîches.
13. Pour le lavage, la plaque de transfert à la station de lavage, aspirer toutes les moyennes des puits et ajouter 400 µL de milieu de l’entretien.
14. Initier flux dans la direction vers le bas à 1 µL/s pour 3,5 min. aspirer tous les médium qui apparaissent sur le côté du réservoir des puits.
15. Ajouter 1,4 mL de support de maintenance hépatocyte et, au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂, la plaque de transfert dans la station d’accueil et initier le flux vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 48 h (Figure 1f).
    Remarque : Pour les monocultures d’hépatocytes utilisés comme témoins pour cocultures, afin d’assurer des conditions contrôlées, un deuxième type de support de maintenance est utilisé, qui est spécifique pour une utilisation dans les cocultures avec des cellules de Kupffer humaines primaires. 48 h après avoir remplacé l’hépatocyte ensemencement moyenne avec support de maintenance hépatocytaire (jour 3 après semis), le support de maintenance régulière hépatocyte sera remplacé par le moyen de maintenance de coculture II, surtout dans les monocultures de PHH lorsque l'on compare au cocultures des cellules PHH et Kupffer, comme les composantes moyennes diffèrent légèrement.

3. dégel et ensemencement des cellules de Kupffer et les hépatocytes des co-cultures

1. Afin d’assurer une comparaison précise des résultats, toujours comparer les cocultures cellule PHH/Kupffer aux monocultures PHH
2. Pour décongeler les cocultures des cellules de Kupffer et de PHH, un flacon de cellules de Kupffer dans avancé de Dulbecco aigle modifié (AdDMEM) sans dexaméthasone mais additionné de dégel primaires d’hépatocytes et placage complète (co-culture ensemencement moyen) selon aux instructions du fournisseur. Effectuer la fonte et l’ensemencement des cellules de Kupffer et hépatocytes dans une classe du cabinet II.
3. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de coculture ensemencement moyen et compter les cellules à l’aide de bleu trypan. Veiller à ce que la viabilité des cellules est supérieur à 90 %.
4. Garder les cellules sur la glace avant en les ajoutant dans les puits pour éviter l’adhérence cellulaire.
5. Suivez les instructions par étapes 2.1 – 2.3 pour le dégivrage des hépatocytes humains primaires.
6. Transférer la plaque équilibrée et entièrement Assemblée à la station de lavage et aspirer toutes les moyennes des puits.
7. Ajouter des cellules de Kupffer 60 000 ou 600 000 hépatocytes dans chaque puits dans un volume total de 250 µL de chaque de coculture ensemencement moyen.
8. Ouvrir le flux dans la direction vers le bas à un débit de 1 µL/s et ajouter 900 µL de coculture ensemencement moyen dans chaque puits.
9. Transvaser la plaque dans la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂.
10. Ouvrir le flux dans la direction vers le bas à un débit de 1 µL/s pendant 8 h, suivie d’inversion de flux vers le vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 8 h.
11. La plaque de transfert vers le quai de laver et aspirer toutes les moyennes des puits.
12. Ajouter 400 µL de milieu de coculture entretien j’ai (AdDMEM sans dexaméthasone mais additionné de suppléments de maintenance des hépatocytes) pour chaque flux de bien et initier la vers le bas à un débit de 1 µL/s pendant 3,5 minutes.
13. Aspirer toutes les moyennes sur le côté du réservoir et ajouter 1,4 mL de coculture entretien milieu j’ai dans chaque puits.
14. La plaque de transfert dans la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂ et ouvrir le flux vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 48 h.
15. La plaque de transfert vers le quai de laver et aspirer toutes les moyennes des puits. Ajouter 400 µL de milieu de coculture entretien II (moyennement Williams E sans dexaméthasone mais additionné de 100 nM hydrocortisone et hépatocytes entretien des suppléments) et lancer le flux dans la direction vers le bas à 1 µL/s pendant 3,5 minutes.
16. Aspirer toutes les moyennes qui apparaissent sur le côté du réservoir des puits.
17. Ajouter 1,4 mL de coculture entretien milieu II et transférer la plaque dans la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂.
18. Ouvrir le flux vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 48 h (Figure 1e).
19. Remplacer le support de toutes les 48 h avec support de maintenance de coculture II. Afin d’assurer que tous les moyens dans le puits est remplacé, effectuer une étape de lavage avant l’ajout du milieu frais.
20. À laver, la plaque de transfert à la station de lavage, aspirer toutes les moyennes des puits et ajouter 400 µL de milieu de coculture entretien II.
21. Initier flux dans la direction vers le bas à 1 µL/s pour 3,5 min. aspirer tous les médium qui apparaissent sur le côté du réservoir des puits.
22. Ajouter 1,4 mL de coculture entretien milieu II et transférer la plaque dans la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂et initier le flux vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 48 h (Figure 1f).

4. production d’un Virus de l’hépatite infectieuse B pour les études d’Infection

1. Effectuez cette section du protocole dans un niveau de confinement laboratoire III. Les semis, modifications moyennes, collection medium et concentration du virus dans une classe du cabinet II.
2. La culture de cellules productrices de VHB (par exemple, HepDE19, HepAD38) dans des flacons de 5 couches de T1000 enduit de collagène dans 120 mL de complet DMEM/F12 (10 % FBS, pénicilline/streptomycine, les acides aminés non essentiels, 500 μg/mL G418 et tétracycline 1 μg/mL) jusqu'à ce qu’ils atteignent 90 % confluence.
3. Changer le support au milieu de l’induction (DMEM complet sans la tétracycline) pour induire la production de VHB.
4. Recueillir le volume moyen complet toutes les 48 h retrait après 12 jours de la tétracycline et conserver à 4 ° C.
5. Filtrer le milieu recueilli sur un filtre supérieur de bouteille de 0,45 µm.
6. Ajouter stérile PEG 8000 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) au milieu de prélevés à une concentration finale de 4 % w/w, mélanger en retournant le 8 x x-10 et incuber à 4 ° C pendant 16 h. centrifuger à 10 000 x g pendant 1 h à 4 ° C, pour recueillir le virus PEG-précipité et remettre en suspension le culot dans du PBS contenant 10 % FBS.
7. Combiner le virus PEG-précipité de tous les points de temps récolte et il couche sur un coussin de saccharose de 20 %. Centrifuger à 140 000 x g pendant 16 h à 4 ° C à l’aide d’un rotor SW28.
8. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans du PBS additionné de 10 % FBS et partie aliquote et conserver à-80 ° C.
9. Déterminer le nombre de copies de l’ADN du VHB présent dans le surnageant par ADN-VHB qPCR (étape 6).

5. infection des Cultures 3D par le VHB

1. Effectuer des infections dans une classe II du cabinet au sein d’un niveau de confinement laboratoire III.
2. 3 jours après l’ensemencement les monocultures ou cocultures, décongeler le nombre requis d’aliquotes contenant HBV à température ambiante et diluer la dose requise de virus dans 1,8 mL d’hépatocytes entretien moyen ou support de maintenance de coculture II / puits, respectivement.
3. Ce virus dilué de 1,8 mL est suffisant pour l’étape de lavage (400 µL) et le remplacement du support, le puits (1,4 mL). Toutefois, la nécessaire multiplicité d’infection doit être rajusté pour tenir compte du volume de culture finale de 1,6 mL.
4. La plaque de transfert vers le quai de laver et aspirer toutes les moyennes des puits. Ajouter 400 µL de milieu contenant du VHB et initier le flux dans la direction vers le bas à 1 µL/s pour 3,5 min. aspirer toutes les moyennes apparaissant sur le côté du réservoir des puits.
5. Ajouter 1,4 mL de contenant du VHB moyen/coculture entretien moyen II par bien et la plaque de transfert dans la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂. Ouvrir le flux dans la direction vers le bas à un débit de 1 µL/s pendant 8 h, suivie d’un retournement à vers le haut à un débit de 1 µL/s.
6. 24h après l’ajout du VHB, la plaque de transfert vers le quai de laver et aspirer toutes les moyennes des puits.
7. Laver chaque bien dans la plaque 3 x avec le milieu correspondant, selon le type de culture comme indiqué dans les étapes 2.12 – 2.14, afin d’éliminer les virus restes du puits. Contrairement aux étapes 2.12 – 2.14, ajouter 1,6 mL de milieu dans chaque cupule pour tenir compte du volume supplémentaire à échantillonner pour exclure le report de l’inoculum (Figure 1 g).
8. Suite à ces étapes de lavage, recueillir 200 µL de milieu de chaque puits à confirmer la suppression complète de l’inoculum du VHB par quantification de l’ADN du VHB extracellulaire.
9. La plaque de transfert à la station d’accueil au sein d’un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO₂et de lancer des flux vers le haut à un débit de 1 µL/s pendant 48 h.
10. 48 h plus tard, recueillir le volume bien complet pour l’analyse en aval, suivi par trois lavages avec support maintenance hépatocyte décrites aux étapes 2.12 – 2.14. Remplacer le support et laver chaque puits 3 x toutes les 48 h jusqu'à fin expérimentale.

6. quantification de l’ADN du VHB extracellulaire

1. Isoler l’ADN total des surnageants de culture selon les instructions du fabricant avec l’ajout de 1 µg de transporteur RNA dans un niveau de confinement laboratoire III à assurer l’inactivation du virus dans les échantillons avant en les déplaçant vers une autre zone.
2. Préparer un mélange maître contenant mélange maître de quantitative PCR, apprêt avant de 600 nM, apprêt inverse de 600 nM et 300 nM de sonde.
3. Ajouter 7 µL du mélange maître dans chaque puits d’une plaque 384 puits.
4. Ajouter 5 µL d’échantillons d’ADN en deux exemplaires, un contrôle de non-modèle et duplicata des dilués en série HBV contenant du génome plasmidique norme basée sur (par exemple, le VHB cmvp) allant de 10⁹ copies par réaction à 10² copies par réaction dans chaque loge de la plaque de qPCR.
5. Placer une couverture de l’adhésive sur la plaque et faire en sorte que chacun est bien scellé correctement.
6. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 300 x g.
7. Démarrer le qPCR exécuter selon les instructions du fabricant. Les conditions de cycle de PCR en temps réel sont de 95 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min.
8. Quantifier le nombre de copies d’ADN du VHB dans les échantillons inconnus selon la courbe d’étalonnage.

7. quantification des intracellulaire VHB Prégénomique (pg) RNA

1. Isoler l’ARN total des échafaudages conformément aux instructions du fabricant. Afin d’assurer la lyse cellulaire complet, vortex chaque échafaudage 3 x pour 30 s, suivi par centrifugation à 300 g pendant 1 min entre chaque vortex. Effectuer la lyse cellulaire dans le niveau de confinement laboratoire III à assurer l’inactivation du virus dans les échantillons avant en les déplaçant vers une autre zone.
2. Transcrire le cDNA de l’ARN isolé selon les instructions du fabricant.
3. Les conditions de cycle pour le fut sont de 25 ° C pendant 10 min, 37 ° C pendant 120 min et 85 ° C pendant 5 min.
4. Conserver les échantillons d’ADNc à 4 ° C pendant à court terme ou à-20 ° C pour le stockage à long terme.
5. Préparer des mélanges maîtres Pan-RPGAA et mélange maître contenant du quantitative PCR de RPS11 et amorces et inverses pour Pan-RPGAA et RPS11 (utilisé comme gène de ménage) à une concentration finale de 0,2 µM.
6. Ajouter 7,5 µL du mélange maître et 2,5 µL du cDNA / puits sur une plaque 384 puits. Mesurer RPS11 et Pan-RPGAA de chaque échantillon en double exemplaire et inclure un contrôle non-modèle bien pour les deux gènes.
7. Placer une couverture de l’adhésive sur la plaque et faire en sorte que chaque bien est parfaitement étanches.
8. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 300 x g.
9. Insérer la plaque dans le cycleur qPCR et commencer le qPCR en utilisant le protocole standard de PCR quantitatif selon les instructions du fabricant. Les conditions de cycle de PCR en temps réel sont de 50 ° C pour 2 min, 95 ° C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min.
10. Calculer l’expression de Pan-RPGAA par rapport à RPS11.

8. immunofluorescence souillant d’antigène Viral

1. Retirez la bague de retenue du puits et retirez l’échafaud avec une pince dans une classe du cabinet II dans le laboratoire III niveau de confinement.
2. Fixer les cellule contenant les échafaudages avec 4 % de paraformaldéhyde dans 1 mL de PBS pendant 30 min à température ambiante dans le niveau de confinement laboratoire III. Les étapes suivantes peuvent être effectuées dans un domaine différent.
3. Laver les échafaudages 3 x 1 ml de PBS.
4. Permeabilize des cellules à l’aide de 0,1 % Triton X 100 dans 1 mL de PBS pendant 1 h à température ambiante.
5. Laver les échafaudages 3 x 1 ml de PBS.
6. Bloc non-spécifiques en incubant les échafaudages avec 1 % de BSA dans 1 mL de PBS pendant 16 h à 4 ° C.
7. Laver les échafaudages 3 x 1 ml de PBS.
8. Effectuer l’anticorps primaire de coloration à l’aide de l’antigène de noyau virus lapin contre l’hépatite B à une dilution de 1 : 200 à 1 % de BSA dans 1 mL de PBS pendant 16 h à 4 ° C.
9. Laver les échafaudages 1 x 0,1 % Tween dans 1 mL de PBS (PBS-Tween) et 3 x 1 ml de PBS.
10. Effectuer l’anticorps secondaire de coloration à l’aide de chèvre anti-lapin IgG (H + L) croix-adsorbé Alexa Fluor 594 secondaires anticorps conjugué à une dilution de 1:2,000 1 % BSA dans 1 mL de PBS pendant 16 h à 4 ° C.
11. Laver les échafaudages 1 x 1 ml de 0.1 % PBS-Tween et 3 x 1 ml de PBS.
12. Contre-coloration les échafaudages à l’aide de DAPI dans 1 mL de PBS à une concentration de 2 µg/mL pendant 10 min à température ambiante.
13. Laver les échafaudages 1 x 1 ml de 0.1 % PBS-Tween et 3 x 1 ml de PBS.
14. Transférer les échafaudages sur une lame de microscope et montez-le pour l’imagerie.
15. Les échafaudages à l’aide d’un microscope à fluorescence de l’image.

9. humain albumine ELISA

1. Effectuer cette section du protocole dans une classe II armoire consacrés dans le niveau de confinement laboratoire III si vous travaillez avec des matières infectieuses.
2. Pour évaluer la viabilité et la fonctionnalité métabolique de PHH, évaluer la production de l’albumine humaine par ELISA.
3. Plaques de couche 96 puits avec 50 µL / puits des anticorps de chèvre anti-humain dilué 1:800 dans un tampon enduit (carbonate/bicarbonate de 100 mM, pH 9,6). Recouvrir les plaques et incuber pendant 2 h à 37 ° C ou toute une nuit à 4 ° C.
4. Aspirer l’anticorps de revêtement de la plaque et lavez-le 4 x avec 200 µL de 0.05 % PBS-Tween.
5. Ajouter 200 µL de tampon de blocage (1 % de BSA dans du PBS), recouvrir les plaques et les incuber pendant 1 heure à 37 ° C ou les stocker à 4 ° C pendant 3 mois. Pour le stockage à long terme, ajouter 0,05 % d’azide de sodium au tampon de blocage.
6. Aspirer le tampon de blocage et laver 1 fois avec 200 µL de 0.05 % PBS-Tween.
7. Ajouter 50 µL de sérums préalablement dilués par puits (au 1/100). Le diluant pour échantillons contient 1 % de BSA à 0.05 % PBS-Tween. Incuber pendant 1 h à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C.
   NOTE : Incuber les normes en même temps que les échantillons. Une gamme de concentrations de 500 – 0.488 ng/mL (1 / 2 dilutions successives) est recommandé. Effectuer toutes les dilutions en série d’albumine humaine en diluant de l’échantillon.
8. Aspirer les échantillons de la plaque et lavez-le 4 x avec 200 µL de 0.05 % PBS-Tween.
9. Ajouter 50 µL d’anticorps de chèvre conjugué HRP anti-humain albumine préalablement dilué 1/10 000 en diluant de l’échantillon. Incuber pendant 2 h à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C.
10. Aspirer les anticorps de la plaque et le laver 6 x avec 200 µL de 0,05 % PBS-Tween.
11. Ajouter 100 µL de réactif de TMB et, dès que les normes les plus élevées sont entièrement développées, ajouter 100 µL 1 M H₂SO₄ pour arrêter la réaction colorimétrique.
12. Lire l’absorbance à 450 nm sur un lecteur de plaque à 96 puits pour analyse.

10. interleukine (IL) 6 et facteurs de nécrose tumorale (TNF) α la Production en 3D co-cultures

1. Effectuer cette section du protocole dans une classe II armoire consacrés dans le niveau de confinement laboratoire III si vous travaillez avec des matières infectieuses.
2. Quantifier la production IL6 et TNFα afin d’évaluer la fonctionnalité et la viabilité des cellules de Kupffer primaires. Pour induire la production de ces cytokines par les cellules de Kupffer, traiter les cocultures avec 1 lipopolysaccharide de µg/mL (LPS) 9d après ensemencement dans le milieu de maintenance de coculture II pendant 48 h.
3. Au jour 11 après semis, récolte le milieu de chaque puits et conserver à-80 ° C.
4. Mesurer la concentration d’IL6 et TNFα dans le milieu de culture par un test approprié et selon les instructions du fabricant.

Résultats

Nous décrivons une plateforme simple et versatile pour la culture à long terme de leur infection par le VHB et/ou les hépatocytes et les cellules de Kupffer humaines primaires. Des cellules humaines primaires sont ensemencées sur des échafaudages en polystyrène enduit de collagène au sein d’un assemblage de plaque de microfluidique, qui alimente en continu les cellules avec le milieu de croissance (Figure 1 a).

PHH, qui sont habituellement seulement stable pour un temps limité dans les systèmes de culture conventionnels, peut être maintenue sur le plan fonctionnel pendant de longues périodes de temps. L’albumine humaine, qui est sécrétée par les hépatocytes fonctionnels et est considéré comme le meilleur marqueur pour l’évaluation du métabolisme hépatique, est stable et hautement exprimé par cultures 3D jusqu’au jour 40 après ensemencement (Figure 2). Pour les cocultures, viabilité et fonctionnalités de cellules de Kupffer peuvent être évaluées par la sécrétion de cytokines spécifiques (p. ex., IL6 et TNFα). Pour mesurer la production de cytokines, l’utilisation de moyens de détection basée sur les captures par LPS-stimulation des cocultures est recommandée (Figure 3).

Les cellules forment microtissues hépatique, habituellement dans les 3 jours des semis de PHH, démontrant les canalicules biliaires fonctionnels et polarisation cellulaire complet (Figure 2). En plus de retenir leur métabolisme cellulaire physiologique, ces cultures deviennent exceptionnellement sensibles à l’infection par le VHB. L’ADN du VHB et autres marqueurs viraux, contrairement aux autres systèmes de culture deviennent facilement détectables post-d’infection jour 2 (Figure 4). En plus sécrétées marqueurs d’infection virale, hépatocytes contenant les échafaudages peuvent être provient de cultures et utilisés pour la détection par immunofluorescence des antigènes viraux (par exemple, AgHBs, AgHBc) (Figure 4). Où les cultures d’hépatocytes conventionnels exigent l’inoculation avec au moins 500 GE de VHB par cellule et par l’ajout de 2 % DMSO et 4 % PEG, aussi peu que 0,05 VHB GE sont capables de déclencher l’infection dans les cultures 3D sans avoir besoin de DMSO ou PEG (Figure 4).

Figure 1 : mise en place de cultures de foie-on-a-chip 3-d. (un) c’est une présentation schématique pour le montage de la plaque de culture afin d’assurer la mise en place de la circulation de la microfluidique. (b) ce panneau montre une vue rapprochée des puits de culture, y compris le papier filtre, échafaudage et bague de retenue. (c) ce panneau montre le processus d’équilibration de la plaque avant le semis des cultures. Les deux panneaux montrent le processus d’ensemencement des monocultures d’hépatocytes (d) et (e) hépatocytes/Kupffer cell cocultures. (f) ce panneau montre les étapes de lavage moyen changements apportés. (g) ce panneau montre le montage infection VHB, y compris la suppression de l’inoculum. S.M. = moyen de semis, M.M. = entretien moyen. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : viabilité de formation et des hépatocytes hépatique micro-culture. (un) ce panneau montre des images de fond clair longitudinale de monocultures d’hépatocytes 3D démontrant micro-culture formation après l’ensemencement. (b) ce panneau montre l’imagerie immunofluorescence des cultures pour les noyaux (bleu) et l’albumine humaine (vert). (c) ce panneau montre albumine total longitudinale, ainsi que par cellule ajusté production d’albumine, pendant 40 jours de monocultures d’hépatocytes, tel que déterminé par ELISA. Les données présentées sont moyenne ± SD Ce chiffre est une adaptation d’Ortega-Prieto et al.,⁴. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : fonctionnalités de cellules de Kupffer dans cocultures 3-d. Ces panneaux montrent la sécrétion de (un) IL6 et (b) TNFα dans les monocultures d’hépatocytes et cellules hépatocytes/Kupffer cocultures 11 jours après l’ensemencement en réponse au LPS exogène au jour 9 post semis, tel que déterminé à l’aide humaine magnétique Luminex dosage. Ce chiffre est une adaptation d’Ortega-Prieto et al.,⁴. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : infection par le VHB dans les cultures de foie-on-a-chip. (a) ce panneau montre la détection de microscopie d’immunofluorescence AgHBc (rouge), Ag HBs (vert) et noyaux (bleu) 10 jours après l’infection des cultures par le VHB. (b) ce panneau montre la sensibilité des cultures à l’infection par le VHB à l’aide des multiplicités différentes d’infection, tel que déterminé par une quantification de l’ADN du VHB dans les surnageants de culture. (c) ce panneau montre la quantification de l’accumulation longitudinale de Pan-RPGAA VHB par rapport à la gène de ménage RPS11. Les données présentées sont moyenne ± SD Ce chiffre est une adaptation d’Ortega-Prieto et al.,⁴. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les défis dans le maintien des cultures à long terme de PHH ont conduit à l’élaboration de plusieurs modèles de culture avec une fonctionnalité accrue et de la longévité, chacun présentant des inconvénients et des avantages différentiels. Il est maintenant largement reconnu que les cultures 2D statiques de PHH sont imitant certains aspects de la biologie des hépatocytes pour une quantité très limitée de temps. Ainsi, micromotifs cocultures^12,13, sphéroïde cultures^14,15, et^16,de cultures de foie-on-a-chip 3D¹⁷ sont rapidement remplacer ces systèmes plus basiques. Surtout quand l’étude des maladies infectieuses, qui ont coévolué avec leur hôte à utiliser des micro-environnements spécifiques, l’obligation de remettre des environnements physiologiques repose sur la nature souvent difficile de culture homme-tropic maladies infectieuses, y compris les virus de l’hépatite C, le VHB et le paludisme.

L’étape la plus critique dans le cadre de cultures de foie-on-a-chip 3D est la qualité des types cellulaires initialement d’origine. Ces cellules doivent être testés pour leur capacité d’adhérence et uniquement des lots PHH plateable doivent être utilisés afin d’assurer la formation de tissu réussie et génération de culture. Même si PHH fraîchement isolée peut être utilisé, leur cryoconservation est généralement compliquée et exige spéciaux congélateurs vitesse contrôlée.

Par contraste avec les cultures conventionnelles de 2D statiques, le bagage génétique de l’hôte est négligeable en ce qui concerne la susceptibilité à l’infection par le VHB, et tous les donateurs de l’hépatocyte testés jusqu'à présent sont capables d’établir d’infection à VHB⁴.

Même si le patient dérivé VHB établit des infections des cultures 3D, il est impératif d’utiliser PEG-précipité et saccharose coussin purifié VHB quand utilisant inductible VHB producteur cellule lignes pour la production d’inoculum viral. Les surnageants de culture cellulaire directement appliquées aux cultures de foie-on-a-chip 3D, soit par le biais de la présence de facteurs inhibiteurs ou en raison d’une incompatibilité de facteurs de croissance présents avec les hépatocytes, ne résultent pas facilement dans l’infection. En outre, lorsque vous sélectionnez inoculum viral dérivé de patient, seulement le sérum doit être utilisé, car inévitablement, plasma coagule et obstrue la circulation de microfluidique de la plate-forme de la culture.

Indépendamment de l’inoculum viral utilisé, assurant la viabilité cellulaire et la différenciation, en plus d’assurer le retrait complet de l’inoculum initial de VHB, est la clé pour des études à long terme de l’infection. La façon la plus pratique de le faire est d’échantillonnage cultures après le retrait de l’inoculum viral, mais aussi de mesurer les niveaux de l’albumine sérique humaine tout au long de la période de culture. De note, de même pour toutes les autres plates-formes décrits, infection par le VHB, une fois établie, ne pas facilement se propage aux cellules non infectées. Le mécanisme sous-jacent pour que cela demeure difficile, étant donné que l’infection à VHB in vivo infecte facilement la plupart des hépatocytes dans le foie.

En ce qui concerne les cocultures des cellules de Kupffer et de PHH, il est conseillé d’effectuer des essais de beaucoup de cellules de Kupffer afin d’évaluer la sécrétion en réponse à la stimulation de la LPS, IL6 et TNFα puisque pas tous les donneurs de cellules de Kupffer disponibles dans le commerce ont une réactivité égale.

Ce qui est important, pour tous les traitements médicamenteux ou infection initiale des cultures par le VHB, le volume total du puits (1,4 mL), aussi bien à partir de la chaîne microfluidiques (0,2 mL), doit prendre en compte pour le calcul des concentrations de médicament ou d’un inoculum. Afin d’assurer un dosage précis, une étape de lavage avec le milieu contenant du VHB ou médicaments est effectuée pour amorcer le canal microfluidique.

La plate-forme utilisée utilise 600 000 PHH / puits, qui assure des hépatocytes multicouches dans les échafaudages. Même si le nombre de cellule peut être modifié, la concentration cellulaire choisi assure un résultat optimal. Le format de plaque détient un total de 12 échafaudages, qui peut être amélioré à 36 échafaudages. Toutefois, en raison des exigences de microfluidique, mise à l’échelle vers le haut à un nombre bien plus élevé n’est pas possible à ce jour.

Utilisant ces approches, les cultures peuvent être maintenus avec les performances de la cellule optimale pendant au moins 40 jours, qui, jusqu’ici, offre des possibilités sans précédent pour évaluer les nouveaux médicaments candidats, ainsi que l’étude de l’interaction complexe entre les différentes cellules hépatiques populations au cours de l’infection par le VHB.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
William's E Medium, no phenol red	GIBCO	A12176-01
Hepatocyte Thaw Medium	GIBCO	CM7500
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	GIBCO	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	GIBCO	CM4000
DMEM/F-12	GIBCO	11320-033
Advanced DMEM	GIBCO	12491023
DPBS, no calcium, no magnesium	GIBCO	14190-144
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x	GIBCO	11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	GIBCO	15140-122
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture	SIGMA	12106C
Hydrocortisone	SIGMA	H0888
Trypan blue	Merck	T8154
Collagen from calf skin	Merck	C9791
G418	SIGMA	G418-RO
Tetracycline	SIGMA	T3258
Polyethylene glycol 8000	SIGMA	P2139
Sucrose	SIGMA	SO389
Sodium carbonate anhydrous	SIGMA	451614-25G
Sodium bicarbonate	SIGMA	S5761
Sodium azide	SIGMA	S2002-5G
Sulfuric acid, 99.999%	SIGMA	339741
4% Paraformaldehyde	SIGMA	252549
Triton-X 100	SIGMA	X100
Tween 20	SIGMA	P1379
DAPI	SIGMA	D9564
Albumin (human)	SIGMA	A9731
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisher Scientific	BP9701-100
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Applied Biosystems	4440040
SYBR Select Master Mix	Applied Biosystems	4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps
Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits/Consumables
Sterile membrane	CN Bio innovations	LC-SC
LiverChip Perfusion cell culture plate	CN Bio innovations	LC12
LiverChip culture plate lid	CN Bio innovations	LC-SC
Sterile round filter paper	CN Bio innovations	LC-SC
Cell attachment scaffold	CN Bio innovations	LC-SC
Retaining ring	CN Bio innovations	LC-SC
Sterile plunger	CN Bio innovations	LC-ST
Dneasy blood & tissue kit	Qiagen	69506
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
Human Magnetic Luminex assay	R&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution	ThermoFisher Scientific	34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set	Qiagen	1048147	Containing RNA carrier
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile	Millipore (Merck)	PFHYS1008
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Life technologies	4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film	Life technologies	4311971
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates	ThermoFisher Scientific	442404
Sealing Tape for 96-Well Plates	ThermoFisher Scientific	15036
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane	ThermoFisher Scientific	295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost	Fisher Scientific	FB58628
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	344058
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary cells / Cell lines
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified	Thermo Fisher Scientific	HMCPTS
Cryopreserved Human Kupffer Cells	Thermo Fisher Scientific	HUKCCS
HepDE19 cell line	Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA forward primer	Invitrogen		5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'
HBV DNA reverse primer	Invitrogen		5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'
HBV DNA probe	Invitrogen		5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA forward primer	Invitrogen		5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'
pgRNA reverse primer	Invitrogen		5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'
RPS11 forward primer	Invitrogen		5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'
RPS11 reverse primer	Invitrogen		5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'
pCMV-HBV	Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal)	DAKO	discontinued	Lot 10102505
Human Albumin Antibody, A80-129A	Bethyl Laboratories. inc	A80-129A
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P	Bethyl Laboratories. inc	A80-229P
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	# A-11072	Lot 1431810
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
LiverChip Vacuum pump	CN Bio innovations	LC-PN
LiverChip Pneumatic Hookup	CN Bio innovations	LC-PN
LiverChip platform	CN Bio innovations	LC-PN
LiverChip plate washing dock	CN Bio innovations
Autoclavable metal forceps	VWR	232-0106
Vortex Genie 2	Scientific industries	SKU: SI-0236
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95765
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	75004500
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow	MGE worldwide	SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERIES incubator	NUAIRE	NU-5841
Automated precision torgue	CN Bio innovations
Manual torque	CN Bio innovations
LiverChip compressor	CN Bio innovations
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1	Luminex
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block	ThermoFisher Scientific	Millipore™ 40-285
FluoStar Optima Plate Reader	BMG Labtech
KOLVER Precision electric screwdrivers	VTECH ltd	FAB10RE/FR
KOLVER Power supply	VTECH ltd	EDU1FR
BAMBI VTS75D	Air Equipment	Discontinued
Integra Vacuboy	INTEGRA
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block	ThermoFisher Scientific	4453536