Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Özet

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Özet

Lenf düğümleri (LNs) organlar vücuda yayılmış, doğuştan gelen bağışıklık yanıtları adaptif bağışıklık ile bağlayabilirsiniz nerede. Aslında, LNs stratejik lenfdamarların yolunda interposed, LN tüm yerleşik bağışıklık hücreleri ile doku antijenleri samimi temas sağlayan. Böylece, hücresel kompozisyon, dağılım, yer ve etkileşim ex vivo bütün LN görüntüleme kullanarak anlamak vücudun yerel ve sistemik bağışıklık yanıtları koordine nasıl bilgi katacak. Bu protokol, geleneksel konfokal mikroskoplar ve stok reaktifleri kullanılarak çok tekrarlanabilir ve kolay bir metodoloji sağlayan floresan etiketli antikorların in vivo uygulamasının ardından bir ex vivo görüntüleme stratejisi göstermektedir. Antikorların deri altı enjeksiyonu ile, geleneksel immünoreskans mikroskobu tekniği ile potansiyel olarak zarar görebilir doku yapılarını etkilemeden, nn'lerin boşaltılmasında farklı hücre popülasyonlarının etiketedilmesi mümkündür.

Giriş

Lenf düğümleri (LNs) doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları köprü önemli işlevi ile vücutta yaygın olarak mevcut oval şekilli organlardır. NNs yabancı parçacıklar ve kanserli hücreleri tanımlamak için onlara karşı bir bağışıklık yanıtı monte etmek için lenf filtre¹. Antijen sunan hücreler (AAP' ler), T hücreleri ve B hücreleri yabancı parçacıkları ve kanserli hücreleri ortadan kaldırmak için antijene özgü antikorlar (humoral bağışıklık) ve sitotoksik lenfositler (hücresel bağışıklık) oluşturmak için birlikte çalışır². Böylece, lenfatik sistemde mevcut bağışıklık hücrelerinin dinamikleri anlamak aşı gelişimi ve kanser immünoterapisi için önemli etkileri olacaktır.

Yeni konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar da dahil olmak üzere güçlü mikroskopların ortaya çıkışı, farklı bağışıklıkhücre popülasyonlarının doğal ortamlarında nasıl davranışlarını anlamada olağanüstü bir ilerleme sağladı 3. Floresan proteinleri belirli^hedeflerinkontrolü altında ifade eden genetiği değiştirilmiş farelerle sondaların bir kombinasyonunu kullanarak birkaç eşzamanlı hücre alt tipini görüntülemek artık mümkün . Aslında, kitle sitometri ve multi-parametrik akış analizi de dahil olmak üzere yüksek boyutlu teknikler, sağlık ve hastalık 6 farklı bağışıklık hücresi bölümleme ve işlevsellik hakkındaki bilgimizi genişletmek için çok önemli olmuştur^{6, 7}. Ancak, bu teknikler için örnek hazırlamak için, dokular sindirim gerekir ve hücreler hücre süspansiyonları analiz edilecek doğal ortamdan ayrılır. Bu sınırlamaları aşmak ve biyolojide daha iyi bir çeviri sağlamak için, burada önerilen protokolün amacı gelişmiş hız, doku yararı ile stok konfokal mikroskoplar kullanarak ex vivo bütün lenf düğümleri görüntü için basit bir metodoloji uygulamaktır konvansiyonel immünoffloresan boyama ile karşılaştırıldığında yapı koruma ve hücre canlılığı. Bu yaklaşımı kullanarak, γδ T hücreleri için eksik fareler göstermek başardık, Patojenlere karşı konak erken savunmadahil T lenfosit bir alt türü 4, yabani tip fareler ile karşılaştırıldığında folikülleri ve T hücre bölgeleri tehlikeye var. Bu bulgular, γδ T hücrelerinin lenfoid organların homeostazında ve humoral immün yanıtta kritik bir rol oynadığını gösterdiğimiz bir çalışma sürdürmemizi sağladı⁴. Ayrıca, bu protokol, sondalar ve antikorlar lenf düğümü ulaşmak için fizyolojik bir yol sağlar, onlar deri altı uygulanır ve doku lenfatik dolaşım yoluyla dağıtmak gibi, yerinde etiketleme kullanılan önceki raporlar üzerine bina lenfatik ilişkili yapıları görselleştirmek için antikorlar ile^8,9, germinal merkezi dinamikleri^10,11,12, ve hedefleri kolayca kan akışı için erişilebilir^{13 ,14,15}.

Protokol

Protokol Harvard Tıp Fakültesi Hayvanlar Daimi Komitesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi, protokol 2016N000230 tarafından onaylandı.

1. Deney için kullanılan fareler

1. Antikor karışımı nı yönetmek için B6 arka planında 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanın.
2. Ex vivo bütün LN görüntülemenin muhabir farelere antikor karışımı uygulanmadan uygulanıp uygulanamayacağını belirlemek ve antijen ibraz da dahil olmak üzere mononükleer hücrelerin varlığını araştırmak için CX3CR1^{GFP1 GFP/WT}CCR2^RFP/WT farelerini kullanın hücreler ve fagositler ve LN'deki dağılımları.
   NOT: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT muhabiri farelerde sırasıyla CX3CR1 ve CCR2 organizatörleri kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ve kırmızı floresan protein (RFP) vardır. Muhabir fareler antikor karışımı enjeksiyonu ile veya olmadan kullanılabilir. Bir muhabir fare antikor karışımı enjeksiyon için referans⁴ bakın. Antikan enjekte edilmezse ameliyata devam edin.

2. Antikor karışımı hazırlama ve enjeksiyon

NOT: Adım 1.1'de açıklanan fareler üzerinde bu adımları gerçekleştirin.

1. Seyreltik 1:10 parlak menekşe (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0.2 mg/mL), 1:10 parlak mavi (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0.2 mg/mL) ve 1:20 phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) pbs uygun son hacmi ile iç uyluk içine enjekte etmek (için görüntü inguinal) veya pençe ped içine (görüntü popliteal için) lenf.
   NOT: İzotip olarak kullanın: BV421 Mouse IgG2b, k İzotip Kontrolü (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, κ İzotip Kontrolü (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ İzotip Kontrolü (R35-95; 0.2 mg/mL). Boyama antikor değiştirerek, doğru isotip kullanın.
2. LN'yi görüntülemek için, antikor karışımının 100 μL'sini alttan iç uyluk içine enjekte edin (Şekil1A). Alternatif olarak, 50 μL'lik antikor karışımını pençe yastığına enjekte ederek popliteal LN (Şekil2A). Hassas 1 mL İnsülin şırıngalar kullanın, (İnsülin U-100) boyutu 0.30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 inç) iğne ile.
   NOT: Inguinal LN boyama enjeksiyonunun subkutan olduğundan ve intraküler (i.m.) olmadığından emin olun, çünkü i.m. uygulaması yapılırsa antikor karışımı düzgün bir şekilde boşaltılmayacaktır.
3. Antikor karışımı enjeksiyonundan önce hayvanları anestezi etmeyin.
4. Organları çıkarmak için en az 3 saat (inguinal dLN) ve 12 saat (popliteal dLN) sonrası enjeksiyon için bekleyin.
5. LN hücre etiketleme tamamen parlak menekşe veya parlak mavi gibi büyük polimer floresan boyalar kullanılarak gözlenen değilse, alternatif olarak floresan izotiyoyanat (FITC), PE ve allofikokokyanin (APC) dahil olmak üzere küçük floresan kullanın.

3. Inguinal drenaj lenf düğümü kaldırmak için cerrahi prosedür

1. Co₂ boğulma sıyrık ve ardından servikal çıkış kullanarak ötenazi fareleri.
2. Yapışkan bant ile akrilik aşamada fareler immobilize ve kesi etrafında kürk birikimini önlemek için karın derisine bir pamuklu bez ile mineral yağ uygulayın (Şekil1B). Kürk kaldırma gerekli değildir.
3. Mikrocerrahi kavisli makas (11,5 cm) ve mikrocerrahi kavisli forceps (12,5 cm) ile pubis'ten ksifoid sürecine kadar mikrocerrahi eğri kesit (Şekil1C)kullanarak orta hat kesisini gerçekleştirin.
4. Karın kaslarını deriden ayırın ( Şekil1D).
5. Dikey kesi hattının üst ve alt kısmında yatay deri kesileri yapmak ilgi tarafında deri flepleri oluşturmak için (antikor karışımı enjeksiyon tarafına göre) ve lenf düğümü görselleştirmek için cilt flep (Şekil1E).
6. Cilt kapağını akrilik plakaya bantlayın (Şekil 1F).
7. Mikrocerrahi kavisli forsepsler kullanarak inguinal drenaj lenf düğümü çıkarın (Şekil 1F). Lenf düğümü cilt altında bir transaklı, genellikle bilobular, küre olarak görünür.

4. Popliteal drenaj lenf düğümü kaldırmak için cerrahi prosedür

1. Co₂ boğulma sıyrık ve ardından servikal çıkış kullanarak ötenazi fareleri.
2. Yapışkan bant ile akrilik aşamada eğilimli bir pozisyonda fareler immobilize ve buzağı ve diz bir pamuk lu bez ile mineral yağ uygulayın (Şekil2A-D).
3. Topuktan dize kadar baldırda orta hat kesisi gerçekleştirin (Şekil 2E,F).
4. Buzağı kaslarını deriden ayırın ( Şekil2F,G).
5. Popliteal fossa maruz (Şekil 2G). Popliteal lenf nodu popliteal fossa bir transaklı küre olarak görünür.
6. Mikrocerrahi kavisli forseps (Şekil2G)kullanarak popliteal lenf nodünü çıkarın.
7. Alternatif olarak, fareyi supine pozisyonunda ters çevirin ve popliteal LN çıkarılması için pazı femoris ve semitendinosus arasındaki popliteal fossa'ya yaklaşArak baldırın topuktan dizine kadar olan kısmı ayrıştırMa deriden kas.
   NOT: Popliteal fossa diz ekleminin arkasında bulunan sığ bir depresyondur. Popliteal lenf düğümlerini görmek için dikkatlice açın.

5. Lenf nodu hazırlığı

1. Tüm organı cam alt (35 mm x 10 mm) içeren bir kültür kabına yerleştirin ve mikrocerrahi kavisli forceps kullanarak organı çevreleyen yağı çıkarın (Şekil1G-I ve Şekil 2H).
2. Yemeğin ortasındaki organı merkezileştirin (Şekil 1J ve Şekil 2H).
3. Hassas görev silecekleri bir parça ile organ kapağı ve oda sıcaklığında tuzlu ile ıslatılmış tutmak 0.9% veya Fosfat Tampon Çözeltisi (Şekil1K-M ve Şekil 2H).
   NOT: Çıkarıldıktan sonra lenf bezlerinin yıkanması veya kaputta lenf nodunu çıkarılmasının yapılması gerekli değildir.

6. Ex-vivo konfokal mikroskopi (Görüntüleme)

1. Petri kabını ters konfokal mikroskop yuvasına yerleştirin (Şekil 1N ve Şekil 2H).
2. Bir konfokal mikroskop altında görüntü nns (Şekil 1O ve Şekil 2H).
3. İlk olarak, 4x veya 10x hedefi ile konfokal mikroskobun konvansiyonel ışığını kullanarak doğru odak elde edin. Daha sonra ışık fonksiyonundan lazer moduna geçin.
   NOT: Konfokal mikroskop 4x nesnel içermiyorsa, odak 10x hedefi kullanılarak mükemmel bir şekilde elde edilebilir.
4. Bu görsellerde gösterilen görüntülerde kullanılanlar gibi floresan etiketli antikorlardan otofloresan vespesifik olmayan lekeleri gidermek için izotip lekeli, lekeli veya floresan olmayan bir numune (Tablo 1) kullanarak lazer gücünü, mahsup ve kazancını ayarlayın el yazması (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 ve PE anti-F4/80).
5. Lenf düğümünde ilgi alanında sırasıyla mikrometrik ve savaş arabası kullanarak Z ve XY pozisyonlarını ayarlayın.
6. LN yapısı ve hücresel dağılıma odaklanan 4x, 10x ve 20x hedefleri altında görüntüler edinin. 1024 x 1024 piksel tanımı kullanın.
   NOT: Hayvan başına amaç başına farklı alanlarda en az beş görüntü edinin.
7. Kanalları ayırmak, ölçek ve ilgi çekici renkler eklemek ve 3B görünümü yeniden oluşturmak için görüntü yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin.

Sonuçlar

Bu el yazması, bu organlardaki belirli hücre popülasyonlarını lekelemek için floresan etiketli antikorların enjeksiyonundan sonra yapılarına zarar vermeden inguinal ve popliteal lenf düğümlerini çıkarma tekniklerini göstermektedir (Şekil1 ve Şekil 2 ).

BV421 anti-CD4 ve BB515 anti-CD19 ve konfokal görüntüleme analizi ile LN hücrelerinin immünetiketleme güçlü kombinasyonu inguinal ve popliteal NNs T hücrelerin...

Tartışmalar

Moleküler biyoloji ve yüksek boyutlu immünofenotiotipleme de dahil olmak üzere diğer teknikler ile görüntüleme kombinasyonu kendi doğal bağlamda bağışıklık hücrelerini araştırmak için yeteneğimizi geliştirdi. Aslında, diğer yaklaşımlar doku sindirimi ve hücre izolasyonu gerektirebilir iken - doku bütünlüğünün kaybına yol açabilir - in vivo veya ex vivo görüntüleme kullanımı coğrafi bir şekilde farklı hücre alt tipleri araştırmada büyük bir avantaj sağlar^3<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)