Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Abstract

I linfonodi (LN) sono organi sparsi all'interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l'immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell'interazione utilizzando l'imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l'iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.

Introduzione

I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro¹. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell'antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose². Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie presenti nel sistema linfatico avrà importanti implicazioni per lo sviluppo del vaccino e l'immunoterapia del cancro.

L'avvento di potenti microscopi - tra cui nuovi microscopi confocali e super-risoluzione - ha permesso uno straordinario progresso nella comprensione di come si comportano le diverse popolazioni di cellule immunitarie nel loro ambiente nativo³. È ora possibile immaginare diversi sottotipi di cellule simultanee utilizzando una combinazione di sonde con topi geneticamente modificati che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di specifici obiettivi^4,5. Infatti, tecniche ad alta dimensione, tra cui citometria di massa e analisi del flusso multi-parametrico sono state cruciali per espandere le nostre conoscenze su diverse compartimentazioni e funzionalità delle cellule immunitarie nella salute e nella malattia^{6, 7}. Tuttavia, per preparare campioni per queste tecniche, i tessuti hanno bisogno di digestione e le cellule sono separate dal loro ambiente naturale per essere analizzate nelle sospensioni cellulari. Per superare queste limitazioni e consentire una migliore traduzione in biologia, l'obiettivo del protocollo qui proposto è quello di applicare una metodologia semplice per immagini ex vivo interi linfonodi utilizzando microscopi confocali stock con il vantaggio di una migliore velocità, tessuto conservazione della struttura e vitalità cellulare rispetto alla colorazione dell'immunofluorescenza convenzionale. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di dimostrare che i topi carenti per le cellule T, un sottotipo di linfocito T coinvolto nella difesa precoce dell'ospite contro i patogeni⁴, hanno follicoli compromessi e zone di cellule T rispetto ai topi di tipo selvatico. Questi risultati ci hanno permesso di seguire uno studio in cui abbiamo dimostrato che le cellule T di z svolgono un ruolo critico nell'omeostasi degli organi linfoidi e nella risposta immunitaria umorale⁴. Inoltre, questo protocollo fornisce un percorso fisiologico per le sonde e gli anticorpi per raggiungere il linfonodo, in quanto vengono somministrati sottocutaneamente e dissipati attraverso la circolazione linfatica dei tessuti, basandosi su precedenti rapporti che hanno utilizzato nell'etichettatura situ con anticorpi per visualizzare strutture associate a linfatiche^8,9, dinamica del centro germinale^10,11,12, e bersagli facilmente accessibili al flusso sanguigno^{13 ,14,15}.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato permanente sugli animali della Harvard Medical School e Brigham and Women's Hospital, protocollo 2016N000230.

1. Topi usati per l'esperimento

1. Utilizzare 8-settimana vecchi topi maschi e femmine sullo sfondo B6 per somministrare il mix di anticorpi.
2. Utilizzare i mouse CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT per determinare se l'imaging LN intero ex vivo può essere applicato anche ai topi reporter senza somministrare la miscela di anticorpi, nonché per studiare la presenza di cellule mononucleari, inclusa la presentazione di antigene cellule e fagociti, e la loro distribuzione nella LN.
   NOTA: i topi cX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT presentano proteine fluorescenti verdi (GFP) e proteine fluorescenti rosse (RFP) inserite rispettivamente sotto il controllo dei promotori CX3CR1 e CCR2. I topi reporter possono essere utilizzati con o senza l'iniezione della miscela di anticorpi. Si prega di vedere il riferimento⁴ per l'iniezione di mix di anticorpi in un topo reporter. Procedere all'intervento chirurgico se non verrà iniettato alcun anticorpo.

2. Preparazione e iniezione del mix di anticorpi

NOTA: eseguire questa procedura sui mouse descritti nel passaggio 1.1.

1. Diluire 1:10 di viola brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 di blu brillante (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) e 1:20 di phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) in PBS con il volume finale appropriato per iniettare nella coscia (per iniettare nella coscia interna (per iniettare nella coscia) (per immagine inguinale) o nella zampa pad (all'immagine popliteal) linfa.
   NOTA: Utilizzare come isotipi: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, controllo isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, - Controllo isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL). Se si modifica l'anticorpo di colorazione, utilizzare l'isotipo corretto.
2. Per immaginare LN inguinale, iniettare 100 l del mix di anticorpi sottocutaneamente nella coscia interna (Figura 1A). In alternativa, iniettare 50 - L sottocutaneamente di miscela di anticorpi nel pad zampa per immagine popliteal LN (Figura 2A). Utilizzare delicate siringhe di insulina da 1 mL (Insulin U-100) con l'ago della taglia 0,30 mm x 13 mm (30 misuratore : 1/2 pollice).
   NOTA: Assicurarsi che l'iniezione per la colorazione LN inguinale sia sottocutanea e non intramuscolare (im.), poiché la miscela di anticorpi non verrà correttamente drenata se viene eseguita la somministrazione.
3. Non anestesizzare gli animali prima dell'iniezione di miscela di anticorpi.
4. Attendere un minimo di 3 h (dLN inguinale) e 12 h (dLN popliteal) dopo l'iniezione per rimuovere gli organi.
5. Se l'etichettatura delle cellule LN non è completamente osservata utilizzando grandi coloranti fluorescenti polimerici come viola brillante o blu brillante, utilizzare fluorofori più piccoli, tra cui l'isotociociocianato di fluoresceina (FITC), PE e allophycocyanin (APC) come alternativa.

3. Procedura chirurgica per rimuovere il linfonodo drenante inguinale

1. Topi eutanasi che utilizzano asfissia di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
2. Immobilizza i topi sullo stadio acrilico con del nastro adesivo e applica l'olio minerale con un tampone di cotone sulla pelle addominale per evitare la deposizione di pelliccia intorno all'incisione (Figura 1B). La rimozione della pelliccia non è necessaria.
3. Eseguire un'incisione mediana utilizzando forbici curve di microchirurgia (11,5 cm) e pinze curve di microchirurgia (12,5 cm) nell'addome dal pube al processo xifoideo (Figura 1C).
4. Dissociare la muscolatura addominale dalla pelle (Figura 1D).
5. Fare incisioni orizzontali della pelle nella parte superiore e inferiore della linea di incisione verticale per creare lembi della pelle sul lato di interesse (secondo il lato dell'iniezione di mix anticorpo) e sbattere la pelle per visualizzare il linfonodo (Figura 1E).
6. Nastro la pelle-flap sulla piastra acrilica (Figura 1F).
7. Rimuovere il linfonodo drenante inguinale utilizzando pinze curve di microchirurgia (Figura 1F). Il nodo linfo-falgioco apparirà come una sfera traslucida, di solito bilobulare, sotto la pelle.

4. Procedura chirurgica per rimuovere il linfonodo di drenaggio popliteale

1. Topi eutanasi che utilizzano asfissia di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
2. Immobilizzai i topi in una posizione prona sullo stadio acrilico con nastro adesivo e applica l'olio minerale con un tampone di cotone nel polpaccio e nel ginocchio (Figura 2A-D).
3. Eseguire un'incisione mediana nel vitello dal tallonlo al ginocchio (Figura 2E,F).
4. Dissociare la muscolatura del vitello dalla pelle (Figura 2F,G).
5. Esporre la fossa popliteale (Figura 2G). Il linfonodo popliteale apparirà come una sfera traslucida nella fossa popliteale.
6. Rimuovere il linfonodo popliteale utilizzando le pappe curve di microchirurgia (Figura 2G).
7. In alternativa, capovolgere il mouse sulla posizione supina e avvicinarsi alla fossa popliteal tra bicipiti femoris e semitendinosus per la rimozione di LN popliteale eseguendo un'incisione mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio seguita da dissociazione del polpaccio muscolatura dalla pelle.
   NOTA: La fossa popliteale è una depressione poco profonda situata nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio. Aperto con attenzione per vedere il linfonodo popliteale.

5. Preparazione del linfonodo

1. Posizionare l'intero organo in un piatto di coltura con fondo di vetro (35 mm x 10 mm) e rimuovere il grasso che circonda l'organo utilizzando prate curve di microchirurgia (Figura 1G-I e Figura 2H).
2. Centralizzare l'organo al centro del piatto (Figura 1J e Figura 2H).
3. Coprire l'organo con un frammento di delicati tergicristalli compito e tenerlo inzuppato con temperatura ambiente salino 0.9% o Fosfato Buffer Solution (Figura 1K-M e Figura 2H).
   NOTA: Non è necessario lavare i linfonodi dopo la rimozione o eseguire l'estrazione del linfonodo nel cofano.

6. Microscopia confocale ex vivo (Imaging)

1. Posizionare il piatto Petri nello slot al microscopio confocale invertito (Figura1N e Figura 2H).
2. Image LN al microscopio confocale (Figura 1O e Figura 2H).
3. In primo luogo, ottenere la giusta messa a fuoco utilizzando la luce convenzionale del microscopio confocale con obiettivo 4x o 10x. Quindi passare dalla funzione di luce alla modalità laser.
   NOTA: Se il microscopio confocale non contiene un obiettivo 4x, la messa a fuoco può essere perfettamente ottenuta utilizzando l'obiettivo 10x.
4. Regolare la potenza del laser, l'offset e il guadagno utilizzando un campione macchiato di isotipo, non macchiato o non fluorescente (Tabella 1) per rimuovere l'autofluorescenza e la colorazione non specifica da anticorpi fluorescenti come quelli utilizzati nelle immagini mostrate in questo (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 e PE anti-F4/80).
5. Regolare le posizioni di xY, utilizzando rispettivamente la micrometrica e il carro, sull'area di interesse nel linfonodo.
6. Acquisire immagini sotto 4x, 10x e 20x obiettivi concentrandosi sulla struttura LN e distribuzione cellulare. Usa la definizione di 1024 x 1024 pixel.
   NOTA: Acquisire un minimo di cinque immagini in diversi campi per obiettivo per animale.
7. Analizza le immagini utilizzando un software di immagine per separare i canali, aggiungere scala e colori di interesse e ricostruire la vista 3D.

Risultati

Questo manoscritto mostra le tecniche per rimuovere i linfonodi inguinali e poplitali senza danneggiarne la struttura a seguito dell'iniezione di anticorpi fluorescenti per macchiare specifiche popolazioni cellulari in questi organi (Figura 1 e Figura 2 ).

La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule LN con BV421 anti-CD4 e BB515 anti-CD19 e analisi dell'imaging confocale ha definito la localizzazione delle cellule T (...

Discussione

La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l'immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l'uso dell'imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)