Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Résumé

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Résumé

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes répartis dans le corps, où les réponses immunitaires innées peuvent se connecter à l'immunité adaptative. En fait, les LN sont stratégiquement interposés dans le chemin des vaisseaux lymphatiques, permettant le contact intime des antigènes de tissu avec toutes les cellules immunitaires résidentes dans le LN. Ainsi, la compréhension de la composition cellulaire, de la distribution, de l'emplacement et de l'interaction à l'aide de l'imagerie LN complète ex vivo permettra d'ajouter à la connaissance sur la façon dont le corps coordonne les réponses immunitaires locales et systémiques. Ce protocole montre une stratégie d'imagerie ex vivo à la suite d'une administration in vivo d'anticorps fluorescents qui permet une méthodologie très reproductible et facile à réaliser en utilisant des microscopes confocals conventionnels et des réactifs. Grâce à l'injection sous-cutanée d'anticorps, il est possible d'étiqueter différentes populations cellulaires dans le drainage des LN sans affecter les structures tissulaires qui peuvent être potentiellement endommagées par une technique conventionnelle de microscopie d'immunofluorescence.

Introduction

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes en forme d'ovoïde largement présents dans tout le corps avec la fonction cruciale de combler les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les LN filtrent la lymphe afin d'identifier les particules étrangères et les cellules cancéreuses pour monter une réponse immunitaire contre eux¹. Les cellules de présentation d'antigènes (APC), les lymphocytes T et les cellules B travaillent aux côtés pour générer des anticorps spécifiques à l'antigène (immunité humoristique) et des lymphocytes cytotoxiques (immunité cellulaire) pour éliminer les particules étrangères et les cellules cancéreuses². Ainsi, la compréhension de la dynamique des cellules immunitaires présentes dans le système lymphatique aura des implications importantes pour le développement du vaccin et l'immunothérapie contre le cancer.

L'avènement de microscopes puissants - y compris de nouveaux microscopes confocal et super résolution - a permis un progrès extraordinaire dans la compréhension de la façon dont les différentes populations de cellules immunitaires se comportent dans leur environnement indigène³. Il est maintenant possible d'imager plusieurs sous-types cellulaires simultanés à l'aide d'une combinaison de sondes avec des souris génétiquement modifiées qui expriment des protéines fluorescentes sous contrôle de cibles spécifiques^4,5. En fait, les techniques de haute dimension, y compris la cytométrie de masse et l'analyse multi-paramétrique de flux ont été cruciales pour élargir nos connaissances sur la compartimentation et la fonctionnalité de cellules immunitaires différentes dans la santé et la maladie^{6, 7}. Cependant, pour préparer des échantillons pour ces techniques, les tissus ont besoin de digestion et les cellules sont séparées de leur milieu naturel pour être analysées dans des suspensions cellulaires. Pour dépasser ces limitations et permettre une meilleure traduction en biologie, l'objectif du protocole proposé ici est d'appliquer une méthodologie simple pour l'image ex vivo ganglions lymphatiques entiers en utilisant des microscopes confocal stock avec l'avantage d'une vitesse améliorée, tissu la préservation de la structure et la viabilité cellulaire par rapport à la coloration immunofluorescence conventionnelle. En utilisant cette approche, nous avons pu montrer que les souris déficientes pour les lymphocytes T, un sous-type de lymphocyte T impliqué dans la défense précoce de l'hôte contre les agents pathogènes⁴, ont compromis les follicules et les zones de cellules T par rapport aux souris de type sauvage. Ces résultats nous ont permis de poursuivre une étude dans laquelle nous avons démontré que les lymphocytes T jouent un rôle critique dans l'homéostasie des organes lymphoïdes et la réponse immunitaire humoristique⁴. En outre, ce protocole fournit une voie physiologique pour que les sondes et les anticorps atteignent le ganglion lymphatique, car ils sont administrés sous-cutanée et se dissipent par la circulation lymphatique de tissu, s'appuyant sur les rapports précédents qui ont employé l'étiquetage in situ avec des anticorps pour visualiser les structures lymphatiques-associées^8,9, dynamique germinale centre^10,11,12, et les cibles facilement accessibles à la circulation sanguine^{13 ,14,15}.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité permanent des animaux de la Harvard Medical School et du Brigham and Women's Hospital, protocole 2016N000230.

1. Souris utilisées pour l'expérience

1. Utilisez des souris mâles et femelles de 8 semaines sur le fond B6 pour administrer le mélange d'anticorps.
2. Utilisez des souris CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT pour déterminer si l'imagerie LN entière ex vivo peut également être appliquée à des souris reporters sans administrer de mélange d'anticorps ainsi que pour étudier la présence de cellules mononucléaires, y compris la présentation d'antigènes cellules et phagocytes, et leur distribution dans le LN.
   REMARQUE : Les souris^journaliste CX3CR1^GFP/WTCCR2 ont des protéines fluorescentes vertes (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (DP) insérées sous le contrôle des promoteurs CX3CR1 et CCR2, respectivement. Les souris reporter peuvent être utilisées avec ou sans l'injection du mélange d'anticorps. S'il vous plaît voir la référence⁴ pour l'injection de mélange d'anticorps dans une souris journaliste. Passez à la chirurgie si aucun anticorps ne sera injecté.

2. Préparation et injection de mélange d'anticorps

REMARQUE : Effectuez ces étapes sur des souris décrites à l'étape 1.1.

1. Diluer 1:10 de violette brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 de bleu brillant (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) et 1:20 de phycoérythrine (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) en PBS avec le volume final approprié à injecter dans la cuisse intérieure (à l'image inguinal) ou dans la patte pad (à l'image popliteal) lymphe.
   REMARQUE: Utiliser comme isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, contrôle de l'isotype (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, contrôle isotype (R35-95; 0,2 mg/mL). Si vous modifiez l'anticorps de coloration, utilisez un isotype correct.
2. Pour l'image inguinal LN, injecter 100 L du mélange d'anticorps sous-cutané dans la cuisse intérieure (Figure 1A). Alternativement, injectez 50 L sous-cutané de mélange d'anticorps dans le tampon de patte pour image popliteal LN (Figure 2A). Utilisez des seringues délicates d'insuline de 1 ml (insuline U-100) avec l'aiguille de taille 0,30 mm et 13 mm (30 jauge et 1/2 pouce).
   REMARQUE : Assurez-vous que l'injection pour la coloration inguinale de LN est sous-cutanée et non intramusculaire (i.m.), car le mélange d'anticorps ne sera pas correctement drainé si i.m. administration est exécutée.
3. Ne pas anesthésier les animaux avant l'injection de mélange d'anticorps.
4. Attendez un minimum de 3 h (inguinal dLN) et 12 h (popliteal dLN) après injection pour enlever les organes.
5. Si l'étiquetage des cellules LN n'est pas complètement observé à l'aide de grands colorants fluorescents polymères tels que le violet brillant ou le bleu brillant, utilisez de plus petits fluorophores, y compris l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), PE et allophycocyanin (APC) comme alternative.

3. Procédure chirurgicale pour enlever le ganglion lymphatique drainant inguinal

1. Euthanasier les souris à l'aide de l'asphyxie au CO₂ suivie d'une luxation cervicale.
2. Immobiliser les souris sur le stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale avec un coton-tige sur la peau abdominale pour empêcher le dépôt de fourrure autour de l'incision (Figure 1B). L'enlèvement de la fourrure n'est pas nécessaire.
3. Effectuer une incision de la ligne médiane à l'aide de ciseaux courbés par microchirurgie (11,5 cm) et de forceps courbés microchirurgie (12,5 cm) dans l'abdomen, du pubis au processus de xiphoïde (figure 1C).
4. Dissocier la musculature abdominale de la peau (Figure 1D).
5. Faire des incisions horizontales de la peau en haut et en bas de la ligne d'incision verticale pour créer des rabats de la peau sur le côté de l'intérêt (selon le côté de l'injection de mélange d'anticorps) et battre la peau pour visualiser le ganglion lymphatique (Figure 1E).
6. Tapez le rabat cutané sur la plaque acrylique (Figure 1F).
7. Enlever le ganglion lymphatique drainant inguinal à l'aide de forceps incurvés en microchirurgie (figure 1F). Le ganglion lymphatique apparaîtra comme une sphère translucide, habituellement bilobulaire, sous la peau.

4. Procédure de chirurgie pour enlever le ganglion lymphatique drainant popliteal

1. Euthanasier les souris à l'aide de l'asphyxie au CO₂ suivie d'une luxation cervicale.
2. Immobiliser les souris en position couchée sur un stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale avec un coton-tige dans le mollet et le genou (Figure 2A-D).
3. Effectuer une incision de la ligne médiane dans le mollet du talon au genou (Figure 2E,F).
4. Dissocier la musculature du veau de la peau (Figure 2F,G).
5. Exposer la fossa popliteal (Figure 2G). Le ganglion lymphatique popliteal apparaîtra comme une sphère translucide dans la fossa popliteal.
6. Enlever le ganglion lymphatique popliteal à l'aide de forceps incurvés en microchirurgie (Figure 2G).
7. Alternativement, retournez la souris sur la position de supine, et approchez la fossa popliteal entre le femoris de biceps et le semitendinosus pour l'enlèvement popliteal de LN en effectuant une incision de midline dans le veau du talon au genou suivie de la dissociation du veau musculature de la peau.
   REMARQUE: Popliteal fossa est une dépression superficielle située à l'arrière de l'articulation du genou. Ouvrez soigneusement pour voir le ganglion lymphatique popliteal.

5. Préparation des ganglions lymphatiques

1. Placer l'organe entier dans un plat de culture avec fond de verre (35 mm x 10 mm) et enlever la graisse qui entoure l'organe à l'aide de forceps incurvés microchirurgie (Figure1G-I et Figure 2H).
2. Centraliser l'orgue au milieu du plat (figure1J et figure 2H).
3. Couvrir l'organe d'un fragment d'essuie-glaces délicats et le garder imbibé de température ambiante saline de 0,9 % ou de phosphate buffer Solution (figure1K-M et figure 2H).
   REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de laver les ganglions lymphatiques après l'ablation ou d'effectuer l'extraction des ganglions lymphatiques dans le capot.

6. Microscopie confocale ex-vivo (imagerie)

1. Placez le plat Petri dans la fente de microscope confocaline inversée (figure1N et figure 2H).
2. Image LNs sous un microscope confocal (Figure1O et Figure 2H).
3. Tout d'abord, obtenir la mise au point correcte en utilisant la lumière conventionnelle du microscope confocal avec objectif 4x ou 10x. Ensuite, passer de la fonction de lumière au mode laser.
   REMARQUE : Si le microscope confocal ne contient pas d'objectif 4x, la mise au point peut être parfaitement obtenue en utilisant l'objectif 10x.
4. Ajuster la puissance laser, compenser et gagner à l'aide d'un échantillon isotype, non taché ou non fluorescent (tableau 1) pour éliminer l'autofluorescence et la coloration non spécifique des anticorps fluorescents tels que ceux utilisés dans les images montrées dans ce manuscrit (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 et PE anti-F4/80).
5. Ajustez les positions Z et XY, en utilisant respectivement le micrométrique et le char sur la zone d'intérêt dans le ganglion lymphatique.
6. Acquérir des images dans le cadre d'objectifs 4x, 10x et 20x axés sur la structure LN et la distribution cellulaire. Utilisez la définition 1024 x 1024 pixels.
   REMARQUE : Acquérez un minimum de cinq images dans différents champs par objectif et par animal.
7. Analysez les images à l'aide d'un logiciel d'image pour séparer les canaux, ajouter de l'échelle et des couleurs d'intérêt, et reconstruire la vue 3D.

Résultats

Ce manuscrit présente des techniques pour enlever les ganglions lymphatiques inguinaux et popliteal sans endommager leur structure à la suite de l'injection d'anticorps fluorescents pour tacher des populations cellulaires spécifiques dans ces organes (figure1 et figure 2 ).

La combinaison puissante de l'immunolabeling des cellules de LN avec BV421 anti-CD4 et BB515 anti-CD19 et l'analyse de formation image confocale a défini la lo...

Discussion

La combinaison de l'imagerie avec d'autres techniques, y compris la biologie moléculaire et l'immunophénotypage de haute dimension a amélioré notre capacité d'étudier les cellules immunitaires dans leur contexte natif. En fait, alors que d'autres approches peuvent nécessiter la digestion des tissus et l'isolement cellulaire - ce qui peut conduire à la perte de l'intégrité des tissus - l'utilisation de l'imagerie in vivo ou ex vivo accorde un grand avantage dans l'étude de différents sous-types cellulaires d'u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)