Визуализация структуры лимфатических узлов и клеточной локализации с помощью ex-Vivo Confocal Микроскопии

Резюме

Этот протокол описывает метод изображения различных популяций клеток в осушении лимфатических узлов без изменений в структуре органа.

Аннотация

Лимфатические узлы (LNs) являются органами, распространяемыми внутри организма, где врожденные иммунные реакции могут соединиться с адаптивным иммунитетом. В самом деле, LNs стратегически вмешались в пути лимфатических сосудов, что позволяет интимный контакт тканевых антигенов со всеми резидентами иммунных клеток в LN. Таким образом, понимание клеточного состава, распределения, местоположения и взаимодействия с помощью ex vivo всего LN изображений будет добавить к знаниям о том, как тело координирует местные и системные иммунные реакции. Этот протокол показывает стратегию визуализации ex vivo после введения виво флуоресцентных антител с меткой, что позволяет очень воспроизводимую и простую в выполнении методологии с помощью обычных конфокальных микроскопов и фондовых реагентов. С помощью подкожной инъекции антител, можно маркировать различные популяции клеток в слива ЛН, не влияя на структуры тканей, которые могут быть потенциально повреждены с помощью обычной иммунофлуоресцентной микроскопии техники.

Введение

Лимфатические узлы (LNs) являются яйцевидными органами, широко присутствующими по всему телу с важнейшей функцией преодоления врожденных и адаптивных иммунных реакций. LNs фильтруют лимфу для того, чтобы определить посторонние частицы и раковые клетки, чтобы смонтировать иммунный ответ против них¹. Антиген, представляющий клетки (APCs), Т-клетки и В-клетки работают вместе с генерацией антиген-специфических антител (гуморальный иммунитет) и цитотоксических лимфоцитов (клеточный иммунитет) для устранения посторонних частиц и раковых клеток². Таким образом, понимание динамики иммунных клеток, присутствующих в лимфатической системе, будет иметь важные последствия для разработки вакцины и иммунотерапии рака.

Появление мощных микроскопов - в том числе новых конфокальных и супер разрешение микроскопов - позволило чрезвычайный прогресс в понимании того, как различные популяции иммунных клеток ведут себя в их родной среде³. Теперь можно изображение нескольких одновременных подтипов клеток с помощью комбинации зондов с генетически модифицированными мышами, которые выражают флуоресцентные белки под контролем конкретных целей^4,5. В самом деле, высокомерные методы, в том числе массовой цитометрии и мульти-параметрического анализа потока имеют решающее значение для расширения наших знаний о различных иммунных клеток разобщенности и функциональности в области здоровья и болезни^{6, 7}. Однако, для подготовки образцов для этих методов, ткани нуждаются в пищеварении и клетки отделены от их естественной среде для анализа в клеточных суспензий. Чтобы превзойти эти ограничения и позволить лучший перевод в биологии, цель протокола, предложенного здесь, заключается в применении простой методологии изображения ex vivo целые лимфатические узлы с помощью фондовых конфокальных микроскопов с преимуществом улучшенной скорости, ткани сохранение структуры, и жизнеспособность клеток по сравнению с обычными иммунофлуоресцентными окрашивания. Используя этот подход, мы смогли показать, что мыши не хватает для Т-клеток, подтип Т-лимфоцитов, участвующих в принимающей ранней защиты от патогенов⁴, имеют скомпрометированы фолликулов и Т-клеточных зон по сравнению с дикими мышами типа. Эти выводы позволили нам продолжить исследование, в котором мы показали, что Т-клетки играют важную роль в гомеостазе лимфоидных органов и гуморальный иммунный ответ⁴. Кроме того, этот протокол обеспечивает физиологические пути для зондов и антител для достижения лимфатических узлов, так как они управляются подкожно и рассеивать через ткани лимфатической циркуляции, опираясь на предыдущие доклады, которые используются в situ маркировки с антителами для визуализации лимфатических ассоциированных структур^8,9, динамика зародышевого центра^10,11,12,и цели легко доступны для кровотока^{13 ,14,15}.

протокол

Протокол был одобрен Постоянным комитетом по животным гарвардской медицинской школы и Бригамской женской больницы, протокол 2016N000230.

1. Мыши, используемые для эксперимента

1. Используйте 8-недельных мышей мужского и женского пола на фоне B6 для администрирования смеси антител.
2. Используйте CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT мышей, чтобы определить, может ли ex vivo всего LN изображения также могут быть применены к репортер умысла без введения антитела смесь, а также для расследования присутствия моноядерных клеток, в том числе антиген представления клеток и фагоцитов, и их распределение в LN.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT репортер мышей зеленый флуоресцентный белок (GFP) и красный флуоресцентный белок (RFP) вставляется под контролем CX3CR1 и CCR2 промоутеров, соответственно. Репортер мышей могут быть использованы с или без инъекции смеси антител. Пожалуйста, смотрите ссылку⁴ для инъекции смеси антител в мышь репортера. Приступайке к операции, если не будет введено антитела.

2. Препарат смеси антител и инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги на мышах, описанных в шаге 1.1.

1. Разбавить 1:10 блестящего фиолетового (BV) 421 анти-CD4 (GK1.5; 0,2 мг/мл), 1:10 яркого синего (BB) 515 анти-CD19 (1D3; 0,2 мг/мл) и 1:20 фикеритрина (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 мг/мл) в PBS с соответствующим окончательным объемом для введения во внутреннюю бедро (к изображение паховой) или в лапу площадку (к изображению popliteal) лимфы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование в качестве изотипов: BV421 Мышь IgG2b, k Изотип управления (R35-38; 0,2 мг/мл); PE Rat IgG2a, изотипный контроль (R35-95; 0,2 мг/мл); BB515 Крыса IgG2a, изотипный контроль (R35-95; 0,2 мг/мл). При изменении окрашивания антитела, используйте правильный изотип.
2. Для изображения inguinal LN, вводят 100 л смеси антител subcutaneously в внутреннее бедро(рисунок 1A). Кроме того, вводить 50 л подкожно смесь антител в лапу площадку для изображения popliteal LN (Рисунок 2A). Используйте тонкие 1 мл инсулиновых шприцев, (Инсулин U-100) с иглой размером 0,30 мм и 13 мм (30 калибровочных и 1/2 дюйма).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что инъекция для окрашивания inguinal LN является подкожной и не внутримышечной (т.е.), так как смесь антител не будет должным образом сливаться, если i.m. администрация выполняется.
3. Не обезврежайте животных перед инъекцией смеси антител.
4. Подождите как минимум 3 ч (ангинальное dLN) и 12 ч (popliteal dLN) после инъекции для удаления органов.
5. Если маркировка клеток LN не полностью наблюдается с использованием больших полимерных флуоресцентных красителей, таких как блестящий фиолетовый или блестящий синий, используйте меньшие флюорофоры, в том числе флуоресцеин изотиоцианат (FITC), ПЭ и аллофиццанин (APC) в качестве альтернативы.

3. Хирургическая процедура для удаления слива етбивья слива етбивного узла

1. Эвтаназия мышей с помощью CO₂ асфиксии с последующим вывихом шейки матки.
2. Иммобилизованные мыши на акриловой стадии с клейкой лентой и применять минеральное масло с ватным тампоном на брюшной кожи для предотвращения осаждения меха вокруг разреза(Рисунок 1B). Удаление меха не требуется.
3. Выполните разрез средней линии с использованием микрохирургии изогнутые ножницы (11,5 см) и микрохирургии изогнутые щипцы (12,5 см) в брюшной полости от лобка к процессу xiphoid(рис. 1С).
4. Отмежевать мускулатуру брюшной полости от кожи(рисунок 1D).
5. Сделать горизонтальные разрезы кожи в верхней и нижней части вертикальной линии разреза для создания кожи лоскуты на стороне интереса (в соответствии с стороны инъекции смеси антитела) и лоскут кожи, чтобы визуализировать лимфатический узел(рисунок 1E).
6. Лента кожи лоскут на акриловой пластине(рисунок 1F).
7. Удалите слив пахового лимфатического узла с помощью микрохирургии изогнутых щипц(рисунок 1F). Лимфатический узла будет выглядеть как транслюцидный, как правило, билогубный, сфера под кожей.

4. Хирургическая процедура для удаления поплавка осушение лимфатических узлов

1. Эвтаназия мышей с помощью CO₂ асфиксии с последующим вывихом шейки матки.
2. Иммобилизованные мыши в склонном положении на акриловой стадии с клейкой лентой и нанесите минеральное масло с ватным тампоном в теленка и колене(рисунок 2A-D).
3. Выполните разрез средней линии в теленка от пятки до колена(Рисунок 2E,F).
4. Отмежевать мускулатуру теленка от кожи(рисунок 2F,G).
5. Разоблачить popliteal ямки(Рисунок 2G). Поплитический лимфатический узло появится как транслюцидная сфера в поплитальной ямке.
6. Удалите поплит лимфатический узло с помощью микрохирургии изогнутых щипцы(рисунок 2G).
7. Кроме того, переверните мышь на месте на спине, и подойти к popliteal ямсы между бицепс феморис и semitendinosus для поплавка LN удаления, выполняя разрез средней линии в теленка от пятки до колена с последующим диссоциацией теленка мускулатуры из кожи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Popliteal ямка является мелкой депрессии, расположенной в задней части коленного сустава. Открыто тщательно, чтобы увидеть popliteal лимфатический узла.

5. Подготовка лимфатических узлов

1. Поместите весь орган в культурное блюдо со стеклянным дном (35 мм х 10 мм) и удалить жир, который окружает орган с помощью микрохирургии изогнутые щипцы (Рисунок 1G-I и Рисунок 2H).
2. Централизованно орган в середине блюда(рисунок 1J и рисунок 2H).
3. Обложка органа с фрагментом деликатной задачи стеклоочистителей и держать его пропитанной комнатной температуры сольник 0,9% или фосфатбуферное решение(Рисунок 1K-M и Рисунок 2H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно мыть лимфатические узлы после удаления или выполнять извлечения лимфатических узлов в капюшоне.

6. Ex-vivo конфокальная микроскопия (изображение)

1. Позиция чашку Петри в перевернутом слоте для конфокального микроскопа(рисунок 1N и рисунок 2H).
2. Изображение LNs под конфокальный микроскоп(Рисунок 1O и Рисунок 2H).
3. Во-первых, получить правильный фокус с помощью обычного света конфокального микроскопа с 4x или 10x цели. Затем перейти от функции света к лазерного режима.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если конфокальный микроскоп не содержит 4x цель, фокус может быть прекрасно полученс с помощью 10x цели.
4. Отрегулируйте мощность лазера, смещение и увеличение с помощью изотип-окрашенных, не окрашенных или не-флуоресцентных образец (Таблица 1) для удаления автофлюоресценции и неспецифических окрашивания от флуоресцентных этикеток антител, таких как те, которые используются в изображениях показано в этом рукопись (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 и PE anti-F4/80).
5. Отрегулируйте позиции К и XY, используя микрометрические и колесницы, соответственно, на область интереса к лимфатии узла.
6. Приобретайте изображения под 4x, 10x и 20x целями, ориентируясь на структуру LN и сотовую дистрибуцию. Используйте определение 1024 x 1024 пикселей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приобрести как минимум пять изображений в различных полях на цель на одно животное.
7. Анализ изображений с помощью программного обеспечения изображения для разделения каналов, добавить масштаб и цвета, представляющие интерес, и реконструировать 3D-вид.

Результаты

Данная рукопись показывает методы удаления паховых и поплитетовых лимфатических узлов, не повреждая их структуру после инъекции флуоресцентных антител для окрашивания конкретных клеточных популяций в этих органах (Рисунок 1 и Рисунок 2 ).

Обсуждение

Сочетание изображений с другими методами, включая молекулярную биологию и высокомерную иммунофенотипирование, повысило нашу способность исследовать иммунные клетки в их родном контексте. В самом деле, в то время как другие подходы могут потребовать переваривания тканей и изоляции кл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)