Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Resumo

Linfonodos (LNs) são órgãos espalhados dentro do corpo, onde as respostas imunes inatas podem se conectar com a imunidade adaptativa. Na verdade, os LNs são estrategicamente interpostos no caminho dos vasos linfáticos, permitindo o contato íntimo de antígenos de tecido com todas as células imunes residentes no LN. Assim, compreender a composição celular, a distribuição, a localização e a interação usando imagens de LN inteiras ex vivo acrescentarão ao conhecimento sobre como o corpo coordena as respostas imunes locais e sistêmicas. Este protocolo mostra uma estratégia ex vivo da imagem latente depois de uma administração in vivo de anticorpos fluorescente-etiquetados que permita uma metodologia muito reprodutível e fácil de executar usando microscópios confocal convencionais e reagentes do estoque. Através da injeção subcutânea de anticorpos, é possível rotular diferentes populações de células na drenagem de LNs sem afetar as estruturas teciduais que podem ser potencialmente danificadas por uma técnica de microscopia de imunofluorescência convencional.

Introdução

Os gânglios linfáticos (LNs) são órgãos em forma de ovóide amplamente presentes em todo o corpo com a função crucial de colmatar as respostas imunes inatas e adaptativas. Os LNs filtram a linfa a fim identificar partículas extrangeiras e pilhas cancerosas para montar uma resposta imune de encontro a elas¹. Células de apresentação de antígeno (APCs), células T e células B trabalham ao lado para gerar anticorpos antígeno-específicos (imunidade humoral) e linfócitos citotóxicos (imunidade celular) para eliminar as partículas estrangeiras e células cancerosas². Assim, compreender a dinâmica das células imunes presentes no sistema linfático terá implicações importantes para o desenvolvimento da vacina e a imunoterapia do câncer.

O advento de microscópios poderosos-incluindo novos microscópios confocais e de super resolução-permitiu um avanço extraordinário na compreensão de como diferentes populações de células imunes se comportam em seu ambiente nativo³. Agora é possível a imagem de vários subtipos de células simultâneas usando uma combinação de sondas com camundongos geneticamente modificados que expressam proteínas fluorescentes controle de alvos específicos^4,5. De fato, técnicas de alta dimensão, incluindo citometria de massas e análise de fluxo Multiparamétrico, têm sido cruciais para ampliar nosso conhecimento sobre diferentes compartimentos e funcionalidades da célula imune na saúde e na doença^{6, 7}. no entanto, para preparar amostras para estas técnicas, os tecidos necessitam de digestão e as células são separadas do seu ambiente natural para serem analisadas em suspensões celulares. Para superar essas limitações e permitir uma melhor tradução em biologia, o objetivo do protocolo proposto aqui é aplicar uma metodologia direta para a imagem de linfonodos inteiros ex vivo usando microscópios confocais de estoque com o benefício de velocidade melhorada, tecido preservação da estrutura, e viabilidade da pilha comparada à mancha convencional da imunofluorescência. Usando esta aproximação, nós pudemos mostrar que os ratos deficientes para as pilhas de ltγδ T, um SubType do linfócito de T envolvidos na defesa adiantada do anfitrião de encontro aos micróbios patogénicos⁴, têm os folículos comprometidos e as zonas da pilha de t em comparação aos ratos selvagens do tipo. Estes resultados permitiram que nós prosseguisse um estudo em que nós demonstramos que as pilhas de ltγδ T jogam um papel crítico na homeostase de órgãos lymphoid e da resposta imune humoral⁴. Além disso, este protocolo fornece um caminho fisiológico para sondas e anticorpos para alcançar o linfonodo, como eles são administrados por via subcutânea e dissipar-se através da circulação linfática do tecido, com base em relatos prévios que utilizaram a rotulagem in situ com anticorpos para visualizar as estruturas linfáticas-associadas^{8,9, a}dinâmica do centro germinais^10,11,12, e alvos prontamente acessíveis ao fluxo sanguíneo^{13 ,14,15}.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Permanente de animais da faculdade de medicina de Harvard e do hospital Brigham and Women, protocolo 2016N000230.

1. camundongos utilizados para o experimento

1. Use ratos machos e fêmeas velhos de 8 semanas no fundo B6 para administrar a mistura do anticorpo.
2. Use camundongos CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT para determinar se a imagem latente completa ex vivo de ln pode igualmente ser aplicada aos ratos do repórter sem administrar a mistura do anticorpo assim como para investigar a presença de pilhas mononucleares, incluindo o antígeno que apresenta células e fagócitos, e sua distribuição no LN.
   Nota: os camundongos CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT reporter têm proteína fluorescente verde (GFP) e proteína vermelha fluorescente (RFP) inseridas o controle dos promotores CX3CR1 e CCR2, respectivamente. Os ratos do repórter podem ser usados com ou sem a injeção da mistura do anticorpo. Veja por favor a referência⁴ para a injeção da mistura do anticorpo em um rato do repórter. Prossiga para a cirurgia se nenhum anticorpo será injetado.

2. preparação e injeção da mistura do anticorpo

Nota: efectue estes passos em ratos descritos no passo 1,1.

1. Diluir 1:10 de violeta brilhante (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 de azul brilhante (BB) 515 anti-CD19 (1d3; 0,2 mg/ml) e 1:20 de ficoeritrina (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) em PBS com o volume final apropriado para injetar na coxa interna (para imagem inguinal) ou na pata Pad (para imagem popliteal) linfática.
   Nota: use como isotypes: BV421 mouse IgG2b, k controle isotipo (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, κ controle isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ controle isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL). Se alterar o anticorpo de coloração, use o isotipo correto.
2. Para a imagem ln inguinal, injete 100 μl da mistura de anticorpos por via subcutânea na coxa interna (Figura 1a). Alternativamente, injete 50 μL por via subcutânea da mistura do anticorpo no coxim da pata à imagem poplítea LN (Figura 2a). Use delicadas 1 mL de seringas de insulina, (insulina U-100) com a agulha de tamanho 0,30 mm × 13 mm (30 Gauge × 1/2 polegada).
   Nota: Assegure-se de que a injeção para coloração inguinal do LN seja subcutânea e não intramuscular (IM), pois a mistura de anticorpos não será drenada corretamente se a administração por via intramuscular for realizada.
3. Não anestesiar animais antes da injecção de mistura de anticorpos.
4. Aguarde um mínimo de 3 h (dLN inguinal) e 12 h (dLN popliteal) pós-injecção para remover os órgãos.
5. Se a rotulagem de células LN não for completamente observada usando grandes corantes fluorescentes de polímero, como violeta brilhante ou azul brilhante, use fluoróforos menores, incluindo isotiocianato de fluoresceina (FITC), PE e alfiscocianina (APC) como alternativa.

3. procedimento cirúrgico para remover o linfonodo de drenagem inguinal

1. Eutanizar camundongos usando CO₂ asfixia seguido de luxação cervical.
2. Imobilize os camundongos na fase acrílica com fita adesiva e aplique óleo mineral com um cotonete na pele abdominal para evitar a deposição de peles ao redor da incisão (Figura 1b). A remoção da pele não é necessária.
3. Realize uma incisão na linha média usando Microcirurgia de tesoura curvada (11,5 cm) e fórceps curvo microcirúrgico (12,5 cm) no abdômen do púis ao processo xifóide (Figura 1C).
4. Dissociar a musculatura abdominal da pele (Figura 1D).
5. Faça incisões cutâneas horizontais na parte superior e inferior da linha de incisão vertical para criar retalhos de pele no lado do interesse (de acordo com o lado da injeção de mistura de anticorpos) e bata a pele para visualizar o linfonodo (Figura 1e).
6. Tape a aba da pele na placa acrílica (Figura 1F).
7. Remover o linfonodo de drenagem inguinal usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 1F). O linfonodo aparecerá como uma esfera translúcida, geralmente bilobular, a pele.

4. procedimento cirúrgico para remover o linfonodo de drenagem poplítea

1. Eutanizar camundongos usando CO₂ asfixia seguido de luxação cervical.
2. Imobilize os camundongos em posição propensa no estágio acrílico com fita adesiva e aplique óleo mineral com cotonete na panturrilha e joelho (Figura 2a-D).
3. Realize uma incisão na linha média na panturrilha do calcanhar até o joelho (Figura 2E, F).
4. Dissociar a musculatura da panturrilha da pele (Figura 2F, G).
5. Expor a fossa poplítea (Figura 2G). O linfonodo poplíteo aparecerá como uma esfera translúcida na fossa poplítea.
6. Remover o linfonodo poplíteo usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 2G).
7. Alternativamente, gire o rato sobre na posição supina, e aproxime a fossa poplítea entre o bíceps femoral e o semitendíneo para a remoção poplítea do ln realizando uma incisão do midline na vitela do salto ao joelho seguida pela dissociação da vitela musculatura da pele.
   Nota: a fossa poplítea é uma depressão rasa localizada na parte de trás da articulação do joelho. Abra com cuidado para ver o linfonodo poplíteo.

5. preparação do linfonodo

1. Coloque todo o órgão em um prato de cultura com fundo de vidro (35 mm x 10 mm) e retire a gordura que rodeia o órgão usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 1G-I e Figura 2h).
2. Centralize o órgão no meio do prato (Figura 1J e Figura 2h).
3. Cubra o órgão com um fragmento de limpadores de tarefas delicadas e mantenha-o embebido com a temperatura ambiente salina 0,9% ou solução tampão fosfato (Figura 1K-M e Figura 2h).
   Nota: não é necessário lavar os gânglios linfáticos após a remoção ou para realizar a extração do linfonodo no capô.

6. microscopia confocal ex-vivo (Imaging)

1. Posicione o prato de Petri na ranhura do microscópio confocal invertido (Figura 1N e Figura 2h).
2. Imagem LNs um microscópio confocal (Figura 1o e Figura 2h).
3. Primeiramente, obtenha o foco correto usando a luz convencional do microscópio confocal com o objetivo 4x ou 10x. Em seguida, mude da função de luz para o modo de laser.
   Nota: se o microscópio confocal não contiver um objetivo de 4x, o foco pode perfeitamente ser obtido usando o objetivo 10x.
4. Ajuste o poder do laser, o offset e o ganho usando uma amostra isotipo-manchada, não-manchada ou não-fluorescente (tabela 1) para remover o autofluorescence e a mancha inespecífica dos anticorpos fluorescente-etiquetados tais como esses usados nas imagens mostradas neste manuscrito (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 e PE anti-F4/80).
5. Ajuste as posições Z e XY , utilizando a micrométrica e a carruagem, respectivamente, na área de interesse no linfonodo.
6. Adquira imagens com objetivos de 4x, 10x e 20x com foco na estrutura do LN e na distribuição celular. Use a definição 1024 x 1024-pixel.
   Nota: Adquira um mínimo de cinco imagens em diferentes campos por objetivo por animal.
7. Analise imagens usando um software de imagem para separar canais, adicionar escala e cores de interesse, e para reconstruir a vista 3D.

Resultados

Este manuscrito mostra técnicas para remover linfonodos inguinal e poplítea sem prejudicar sua estrutura após a injeção de anticorpos fluorescentes rotulados para manchar populações de células específicas nesses órgãos (Figura 1 e Figura 2 ).

A combinação poderosa de Immunolabeling de pilhas de ln com BV421 anti-CD4 e BB515 a análise da imagem latente de CD19 e confocal definiu a localização de pilhas de T (CD4 +) e de...

Discussão

A combinação da imagem latente com outras técnicas, incluindo a biologia molecular e o imunofenotipagem dimensional elevado realçou nossa habilidade de investigar pilhas imunes em seu contexto nativo. Na verdade, enquanto outras abordagens podem requerer digestão tecidual e isolamento celular-o que pode levar à perda de integridade tecidual-o uso de imagens in vivo ou ex vivo concede uma grande vantagem na investigação de diferentes subtipos de células em uma forma geográfica^{3 ,}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)