Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Zusammenfassung

Lymphknoten (LNs) sind Organe, die sich im Körper ausbreiten, wo sich die angeborenen Immunantworten mit der adaptiven Immunität verbinden können. Tatsächlich sind LNs strategisch im Pfad der Lymphgefäße intergesetzt, was einen intimen Kontakt von Gewebeantigenen mit allen ansässigen Immunzellen in der LN ermöglicht. So wird das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Verteilung, Lage und Interaktion mit ex vivo ganze LN-Bildgebung das Wissen darüber, wie der Körper lokale und systemische Immunantworten koordiniert, ergänzen. Dieses Protokoll zeigt eine ex vivo-Bildgebungsstrategie nach einer In-vivo-Verabreichung von fluoreszierend markierten Antikörpern, die eine sehr reproduzierbare und leicht durchzuführende Methodik mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopen und Stoffreagenzien ermöglicht. Durch subkutane Injektion von Antikörpern ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen in entwässernden LNs zu kennzeichnen, ohne Gewebestrukturen zu beeinträchtigen, die durch eine herkömmliche Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik potenziell beschädigt werden können.

Einleitung

Lymphknoten (LNs) sind eiförmige Organe, die weit verbreitet im ganzen Körper vorhanden sind, mit der entscheidenden Funktion, die angeborenen und adaptiven Immunantworten zu überbrücken. LNs filtern die Lymphe, um Fremdpartikel und Krebszellen zu identifizieren, um eine Immunantwort gegen sie zu montieren¹. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), T-Zellen und B-Zellen arbeiten zusammen, um antigenspezifische Antikörper (humorale Immunität) und zytotoxische Lymphozyten (zelluläre Immunität) zu erzeugen, um die Fremdpartikel und Krebszellen zu beseitigen². Das Verständnis der Dynamik der im Lymphsystem vorhandenen Immunzellen wird daher wichtige Auswirkungen auf die Impfstoffentwicklung und die Krebsimmuntherapie haben.

Das Aufkommen leistungsstarker Mikroskope - einschließlich neuer konfokaler und superhochauflösender Mikroskope - hat einen außergewöhnlichen Fortschritt im Verständnis des Verständnisses ermöglicht, wie sich verschiedene Immunzellpopulationen in ihrer heimischen Umgebung verhalten³. Es ist nun möglich, mehrere simultane Zellsubtypen mit einer Kombination von Sonden mit genetisch veränderten Mäusen abzubilden, die fluoreszierende Proteine unter Kontrolle spezifischer Targets^4,5ausdrücken. In der Tat waren hochdimensionale Techniken, einschließlich Massenzytometrie und multiparametrische Strömungsanalyse, entscheidend für die Erweiterung unseres Wissens über verschiedene Immunzellabteilalisation und Funktionalität in Gesundheit und Krankheit^{6, 7}. Um jedoch Proben für diese Techniken vorzubereiten, müssen Gewebe verdaut werden und Zellen werden von ihrem natürlichen Milieu getrennt, um in Zellsuspensionen analysiert zu werden. Um diese Grenzen zu übertreffen und eine bessere Übersetzung in die Biologie zu ermöglichen, ist das Ziel des hier vorgeschlagenen Protokolls, eine einfache Methodik anzuwenden, um ex vivo ganze Lymphknoten mit Stock-Konfokalmikroskopen mit dem Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeit, Gewebe Strukturerhaltung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur herkömmlichen Immunfluoreszenzfärbung. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass Mäuse, die einen Mangel an T-Zellen haben, einem Subtyp von T-Lymphozyten, der an der frühen Abwehr von Krankheitserregern beteiligt ist⁴, Follikel und T-Zellzonen im Vergleich zu Wildtypmäusen kompromittiert haben. Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, eine Studie zu verfolgen, in der wir zeigten, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Homöostase von Lymphorganen und der humoralen Immunantwort spielen⁴. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll einen physiologischen Weg für Sonden und Antikörper, um den Lymphknoten zu erreichen, da sie subkutan verabreicht werden und sich durch die Lymphzirkulation des Gewebes ableiten, aufbauend auf früheren Berichten, die in situ-Kennzeichnung verwendet wurden. mit Antikörpern zur Visualisierung lymphatischer Strukturen^8,9, Keimzentrumsdynamik^10,11,12und Targets leicht zugänglich für den Blutfluss^{13 ,14,15}.

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Standing Committee on Animals an der Harvard Medical School und dem Brigham and Women es Hospital, Protokoll 2016N000230, genehmigt.

1. Mäuse, die für das Experiment verwendet werden

1. Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse auf dem B6-Hintergrund für die Verabreichung der Antikörpermischung.
2. Verwenden Sie CX3CR1^GFP/WTCCR2^{RFP/WT-Mäuse,} um festzustellen, ob ex vivo ganze LN-Bildgebung auch auf Reportermäuse angewendet werden kann, ohne Antikörpermischung zu verabreichen, sowie um das Vorhandensein von mononukleären Zellen zu untersuchen, einschließlich Antigen, die Zellen und Phagozyten und ihre Verteilung in den LN.
   HINWEIS: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT Reportermäuse haben grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) unter der Kontrolle von CX3CR1 bzw. CCR2-Promotoren eingesetzt. Reportermäuse können mit oder ohne Injektion der Antikörpermischung verwendet werden. Bitte beachten Sie Referenz⁴ für Antikörper-Mix-Injektion in einer Reportermaus. Fahren Sie mit der Operation fort, wenn kein Antikörper injiziert wird.

2. Antikörper-Mix-Vorbereitung und Injektion

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte an Mäusen aus, die in Schritt 1.1 beschrieben sind.

1. 1:10 von brillantviolett (BV) 421 anti-CD4 verdünnen (GK1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 von brillantblau (BB) 515 Anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) und 1:20 Von Phycoerythrin (PE) Anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) in PBS mit dem entsprechenden Endvolumen, um in den inneren Oberschenkel zu injizieren (zu Bild leisten) oder in die Pfotenpad (um popliteal) Lymphe zu bilden.
   HINWEIS: Verwendung als Isotypen: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0,2 mg/ml); PE Ratte IgG2a, Isotype Control (R35-95; 0,2 mg/ml); BB515 Ratte IgG2a, Isotype Control (R35-95; 0,2 mg/ml). Wenn Sie den Färbeantikörper ändern, verwenden Sie den richtigen Isotyp.
2. Um die Leistenbild LN abzubilden, injizieren Sie 100 l des Antikörper-Mix subkutan in den inneren Oberschenkel (Abbildung 1A). Alternativ können Sie eine subkutane Antikörpermischung von 50 l in das Pfotenpad in das Bild popliteal LN (Abbildung 2A) einspritzen. Verwenden Sie empfindliche 1 ml Insulinspritzen (Insulin U-100) mit der Nadel der Größe 0,30 mm x 13 mm (30 Gauge bei 1/2 Zoll).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Injektion für die Braunfärbung von LN subkutan und nicht intramuskulär ist (i.m.), da die Antikörpermischung nicht ordnungsgemäß entleert wird, wenn die i.m. Verabreichung durchgeführt wird.
3. Anästhesisieren Sie Tiere nicht vor der Injektion von Antikörpermischungen.
4. Warten Sie mindestens 3 h (leistend) und 12 h (popliteal dLN) nach der Injektion, um die Organe zu entfernen.
5. Wenn die LN-Zellbeschriftung nicht vollständig mit großen Polymerfluoreszenzfarbstoffen wie brillanten Violett- oder Brillantblau-Farbstoffen beobachtet wird, verwenden Sie als Alternative kleinere Fluorophore, einschließlich Fluoresceinisothiocyanat (FITC), PE und Allophycocyanin (APC).

3. Chirurgisches Verfahren zur Entfernung des leistend entwässernden Lymphknotens

1. Euthanisieren Sie Mäuse mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen.
2. Immobilisieren Sie Mäuse auf der Acrylbühne mit Klebeband und tragen Sie Mineralöl mit einem Wattestäbchen auf die Bauchhaut auf, um Fellablagerungen um den Schnitt zu verhindern (Abbildung 1B). Pelzentfernung ist nicht notwendig.
3. Führen Sie einen Mittellinienschnitt mit einer mikrochirurgischen gekrümmten Schere (11,5 cm) und einer mikrochirurgischen gekrümmten Zange (12,5 cm) im Bauch vom Schambein bis zum xiphoiden Prozess durch (Abbildung 1C).
4. Dissoziieren Sie die Bauchmuskulatur von der Haut (Abbildung 1D).
5. Machen Sie horizontale Hauteinschnitte an der Ober- und Unterseite der vertikalen Schnittlinie, um Hautklappen auf der Seite des Interesses zu erstellen (entsprechend der Seite der Antikörper-Mix-Injektion) und klappern Sie die Haut, um den Lymphknoten zu visualisieren (Abbildung 1E).
6. Kleben Sie die Hautklappe auf die Acrylplatte (Abbildung 1F).
7. Entfernen Sie den inguinal entwässernden Lymphknoten mit mikrochirurgischen gekrümmten Zangen (Abbildung 1F). Lymphknoten erscheint als transluzider, in der Regel bilobular, Kugel unter der Haut.

4. Chirurgisches Verfahren zur Entfernung des popliteal enzierenden Lymphknotens

1. Euthanisieren Sie Mäuse mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen.
2. Immobilisieren Sie Mäuse in einer anfälligen Position auf Acryl-Bühne mit Klebeband und wenden Sie Mineralöl mit einem Wattestäbchen in der Wade und Knie (Abbildung2A-D).
3. Führen Sie einen Mittellinienschnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie (Abbildung 2E,F).
4. Dissoziieren Sie die Kalbsmuskulatur von der Haut (Abbildung 2F,G).
5. Expose the popliteal fossa (Abbildung 2G). Popliteallymphknoten erscheint als transluziden Kugel in der poplitealen Fossa.
6. Entfernen Sie den poplitealen Lymphknoten mit mikrochirurgischen gekrümmten Zangen (Abbildung 2G).
7. Alternativ drehen Sie die Maus auf supine Position, und nähern Sie sich der poplitealen Fossa zwischen bizeps femoris und semitendinosus für popliteale LN Entfernung durch Durchführung einer Mittellinie Schnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie gefolgt von Dissoziation des Kalbs Muskulatur von der Haut.
   HINWEIS: Popliteal fossa ist eine flache Depression an der Rückseite des Kniegelenks. Öffnen Sie sorgfältig, um den poplitealen Lymphknoten zu sehen.

5. Lymphknotenvorbereitung

1. Legen Sie das ganze Organ in eine Kulturschale mit Glasboden (35 mm x 10 mm) und entfernen Sie das Fett, das das Organ umgibt, mit mikrochirurgischen gebogenen Zangen (Abbildung 1G-I und Abbildung 2H).
2. Zentralisieren Sie das Organ in der Mitte der Schale (Abbildung 1J und Abbildung 2H).
3. Bedecken Sie das Organ mit einem Fragment von empfindlichen Aufgabenwischern und halten Sie es mit Raumtemperatur-Saline 0,9% oder Phosphat-Puffer-Lösung (Abbildung 1K-M und Abbildung 2H) getränkt.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Lymphknoten nach der Entfernung zu waschen oder die Lymphknotenextraktion in der Haube durchzuführen.

6. Ex-vivo konfokale Mikroskopie (Imaging)

1. Positionieren Sie die Petrischale im invertierten konfokalen Mikroskopschlitz (Abbildung 1N und Abbildung 2H).
2. Bild-LNs unter einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 1O und Abbildung 2H).
3. Erhalten Sie zunächst den richtigen Fokus, indem Sie das herkömmliche Licht des konfokalen Mikroskops mit 4x oder 10x Objektiv verwenden. Wechseln Sie dann von der Lichtfunktion in den Lasermodus.
   HINWEIS: Wenn das konfokale Mikroskop kein 4-faches Objektiv enthält, kann der Fokus mit dem 10-fachen Objektiv perfekt erreicht werden.
4. Anpassen der Laserleistung, des Offsets und der Verstärkung mit einer isotypgefärbten, nicht gefleckten oder nicht fluoreszierenden Probe (Tabelle1), um Autofluoreszenz und unspezifische Färbung enthäut von fluoreszierenden Antikörpern, wie sie in den in diesem Bild gezeigten Manuskript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 und PE anti-F4/80).
5. Passen Sie Z- und XY-Positionen mit dem mikrometrischen bzw. wagen den Bereich des Interesses am Lymphknoten an.
6. Erfassen Sie Bilder unter 4x, 10x und 20x Objektiven, die sich auf die LN-Struktur und Zellverteilung konzentrieren. Verwenden Sie die Definition von 1024 x 1024 Pixel.
   HINWEIS: Erwerben Sie mindestens fünf Bilder in verschiedenen Feldern pro Ziel pro Tier.
7. Analysieren Sie Bilder mit einer Bildsoftware, um Kanäle zu trennen, Skalierung und Farben von Interesse hinzuzufügen und 3D-Ansicht zu rekonstruieren.

Ergebnisse

Dieses Manuskript zeigt Techniken zur Entfernung von Leisten- und Popliteal-Lymphknoten, ohne ihre Struktur nach der Injektion fluoreszierender Antikörper zu beschädigen, um bestimmte Zellpopulationen in diesen Organen zu färben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ).

Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von LN-Zellen mit BV421 Anti-CD4 und BB515 Anti-CD19 und konfokaler Bildgebungsanalyse definierte die Lokalisation von T-Ze...

Diskussion

Die Kombination von Bildgebung mit anderen Techniken, einschließlich Molekularbiologie und hochdimensionaler Immunphenotypisierung, hat unsere Fähigkeit verbessert, Immunzellen in ihrem nativen Kontext zu untersuchen. Während andere Ansätze gewebeverdauliche und zellisolierte Anwendungen erfordern – was zu einem Verlust der Gewebeintegrität führen kann – bietet die Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Bildgebung einen großen Vorteil bei der geographischen Untersuchung verschiedener Zellsubtypen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	-	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	-	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	-	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)