Pankreas Kanserinin Ortotopik Rezeksiyonlu Fare Modeli

Özet

Klinik bağlamda lokalize pankreas kanseri olan hastalar pankreastektomi ve ardından adjuvan tedavi görecektir. Burada bildirilen bu protokol, pankreas kanserinin ortotopik implantasyonu ve ardından distal pankreasektomi ve splenektomi yoluyla çıplak farelerde bu klinik senaryoyu modellemek için güvenli ve etkili bir yöntem oluşturmayı amaçlamaktadır.

Özet

Pankreas kanseri (PC) cerrahisi için düşünülen hastalarda adjuvan ve/veya neoadjuvan tedaviyi incelemek için tatmin edici hayvan modellerinin eksikliği vardır. Bu eksikliği gidermek için, PC'nin ortotopik implantasyonunu ve ardından distal pankreastomi ve splenektomi içeren bir fare modelini tarif ediyoruz. Modelin, adjuvan ve neo adjuvan ortamlarda çeşitli terapötik yaklaşımların incelenmesi için güvenli ve uygun şekilde esnek olduğu gösterilmiştir.

Bu modelde, pankreas tümörü ilk olarak balb/c athymic çıplak farelerin distal pankreasına insan pankreas kanseri hücrelerinin (luciferaz etiketli AsPC-1) ve insan kanseri ilişkili pankreas yıldız hücrelerinin bir karışımının yerleştirilmesiyle üretilir. Üç hafta sonra, kanser yeniden laparotomi, distal pankreastomi ve splenektomi ile resected edilir. Bu modelde biyolüminesans görüntüleme, kanser gelişiminin ilerlemesini ve rezeksiyon/tedavilerin etkilerini takip etmek için kullanılabilir. Rezeksiyondan sonra adjuvan tedavi verilebilir. Alternatif olarak, rezeksiyondan önce neoadjuvan tedavi verilebilir.

45 fareden temsili veriler sunulmaktadır. Tüm farelere hemostaz sorunu olmayan başarılı distal pankreastomi / splenektomi uygulandı. 43'te 5 mm'den büyük makroskopik proksimal pankreas marjı elde edildi (%96) Fare. Pankreas rezeksiyonunun teknik başarı oranı %100, erken mortalite ve morbiditesi %0 idi. Rezeksiyondan sonraki hafta boyunca hayvanların hiçbiri ölmedi.

Özetle, klinik senaryoyu taklit eden farelerde pankreas kanserinin cerrahi rezeksiyon modeli için sağlam ve tekrarlanabilir bir teknik tanımlıyoruz. Model hem adjuvan hem de neoadjuvan tedavilerin test edilmesi için yararlı olabilir.

Giriş

Pankreas düktal adenokarsinom (pankreas kanseri [PC]) zayıf bir prognoz ile ilişkilidir¹. Cerrahi rezeksiyon PC için potansiyel olarak iyileştirici tek tedavi olmaya devam etmektedir ve erken evre hastalığı olan hastalar için düşünülmelidir. Ne yazık ki, R0 rezeksiyonu (yani tümör içermeyen rezeksiyon marjları) ile bile, tekrarlama oranı (lokal veya tespit edilmemiş metastatik hastalıktan) yüksektir^2,3. Bu nedenle, rezeksiyon uygulanan hemen hemen tüm hastalarda sistemik adjuvan tedavi endikedir⁴. Ayrıca, neoadjuvan tedavi artık sadece borderline-rezeke edilebilir kanserler için tavsiye edilirken, endikasyonları rutin kullanımı çok klinik araştırmaların odak noktası olacak şekilde genişliyor^5,6,7,8. PC için rezeksiyon içeren yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için, bu yaklaşımların öncelikle klinik ayarları doğru bir şekilde yeniden deneyen klinik öncesi modellerde değerlendirilmesi gerekir.

PC'nin ortotopik fare modelleri geçmişte ilaç tedavilerini test etmek için sıklıkla kullanılmıştır^9,10. Bunların çoğu, kanser hücrelerinin tek başına fare pankreasına enjekte ederek üretildi ve PC'nin karakteristik özelliği olan belirgin stromadan yoksun tümörlerle sonuçlandı. Daha yakın zamanda, ilk olarak insan PC ve insan pankreas yıldız hücrelerinin bir karışımını enjekte ederek geliştirdiğimiz gibi ortak enjeksiyon ortotopik modeller (PC'deki kollajenöz stromanın birincil üreticileri olan PSC'ler) düzenli olarak kullanıma girdi^11,12. Kanser ve stromal hücrelerin bu tür ko-enjeksiyonu ile üretilen tümörler (i) hem kanser elementlerini hem de PC'nin karakteristik stromal (desmoplastik) bileşenini ve (ii) gelişmiş kanser hücresi çoğalması ve metastazını sergiler^11. Bu nedenle, bu model insan PC'ye çok benziyor. Ortotopik PC'nin bir dizi rezeksiyon modeli tanımlanmış olsa da^13,14,15,16, hiçbiri insanlarda pankreas rezeksiyonunun klinik gerçeklerini bu model kadar doğru yansıtmamıştır ve bu nedenle adjuvan veya neoadjuvan tedavileri test etmek için suboptimal olmuştur.

Sunulan fare modelinin amacı şu şekildeydi: (i) yanlışlıkla periton yayılımını en aza indirirken ortotopik pankreas kanserinin başarılı bir şekilde implante edildiğini ve (ii) daha sonra kanserin tamamen resect olduğunu göstermekti. Makale, bu tekniğin ipuçlarını ve potansiyel tuzaklarını vurgulamaktadır.

Protokol

Tüm prosedürler Yeni Güney Galler Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Kurulu tarafından onaylandı (17/109A). Bu protokol için 8-10 haftalık 16-19 g ağırlığında dişi athymic Balb/c çıplak fareler kullanılmıştır. Fareler mikro izolatör kafeslerinde barındırıldı ve ticari olarak mevcut peletlenmiş yiyecek ve su ad libitumile beslendi.

1. Ortopedik pankreas kanseri implantasyonu

1. Hücreleri implantasyona hazırlayın. İlk olarak, prosedür için gerekli hücre sayısını hesaplayın (her hayvan için 1 x^{10 6} luciferaz etiketli AsPC-1 hücreleri ve 1 x^{10 6} kanser ilişkili insan pankreas yıldız hücreleri [CAhPSC'ler] gereklidir).
   1. Bu hücreleri nemlendirilmiş sıcaklık kontrollü bir CO₂ inkübatöründe koruyun ve rutin mikoplazma testi gerçekleştirin. AsPC-1 ve CAhPSC'ler için kullanılan kültür ortamı RPMI 1640'tır (300 mg/ L L-glutamin ile, %20 v/v foetal sığır serumu, %1 v/v penisilin/streptomisinin) ve IMDM (4 mM L-glutamin, %10 v/v foetal sığır serumu, %1 v/v penisilin/streptomisan ile).
   2. Hücreleri hücre süspansiyonuna dönüştürmeyi denemek için standart hücre kültürü tekniklerini kullanın. Kullanılan tripsin çözeltisinin iki katı bir hacimde ilgili tam kültür ortamını kullanarak tripsin nötralize edin.
   3. Bu hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve 50 μL hücre süspansiyonunda 1 x^{10 6} AsPC-1 hücresi ve 1 x^{10 6} CAhPSC içeren bir karışıma yeniden atın.
   4. Bu süspansiyonu kullanıma kadar buzda tutun.
2. Prosedür için sınıf II biyogüvenlik kabini hazırlayın. Steril plastik bir örtü ile kaplanmış bir ısıtma paspası kullanın. İşlem sırasında büyütme için, 2,5x ila 3,5x büyütme cerrahi loupes bir çift kullanın.
3. 1 cm çapında bir deliği gazlı bez çubuğuna keserek çanta ipli sürüntüler hazırlayın. Bu deliği bir çanta ipli dikişle sabitleyin. Bunun için herhangi bir ince örgülü dikiş kullanılabilir (örneğin, 5/0 poliglik asit dikiş). Örgülü dikiş malzemesi, gevşek düğümün sıkıldıktan sonra yerinde kalmasını sağladığı için önerilir. Bu şekil 1a'dagösterilmiştir.
4. Fareyi intraperitoneal enjeksiyonla 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin ile uyuşturun.
5. 5 mg/kg enrofloksasin antibiyotik profilaksisi, 2,5 mg/kg flunixin analjezi ve %0,9 salin deri altı 1 mL'si uygulanır.
6. Uyuşturuldktan sonra, fareyi steril alana bir destek pozisyonunda yerleştirin ve povidone-iyot uygulayın ve ardından cilt hazırlığı için% 70 etanol uygulayın.
7. Karnın sol kraniyal kadranının derisinde uzunlamasına bir kesi yapın ve ardından kas tabakasınıps arasında keserek karın içine girin.
8. 50 μL hücre süspansiyonu ile 29 G insülin şırıngası yükleyin - bu, enjekte başına 1 x^{10 6} CAhPSC ve 1 x^{10 6} luciferaz etiketli AsPC-1 hücrelerine eşittir. Enjeksiyon cihazına monte edin. Bu enjeksiyon cihazının tasarımı ve işlevi Şekil 1b ve göstergesinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
9. Çanta-string bezini laparotomi kesisinin üzerine yerleştirin ve ardından bu çubuğun açılmasıyla dalak ve pankreas kuyruğunu dış hale getirin. Pankreasın gövdesini hafifçe çevrelemek için çanta dizesini sıkın, pankreas kuyruğunu enjeksiyon için açığa koyun. Gazlı bez pankreası çevresine temas ederken aynı zamanda daraltmayacak kadar sıkı olmak önemlidir.
10. Bir çift tokmaca kullanarak pankreasın kuyruğunu kavrayın ve üzerine hafifçe yanal gerginlik yerleştirin. Ventral periton yüzeyini iğne ile sığ bir açıyla delin ve ardından hücre süspansiyonu enjeksiyon cihazı ile yavaş ve kontrollü bir şekilde (10−15 sn'nin üzerinde) pankreasa enjekte edin.
11. Enjeksiyon işlemi sırasında, hem enjeksiyon bölgesinin etrafında (reflüden) hem de pankreas lobülünün diğer tarafında (içinden ve içinden penetrasyon durumunda) sızıntıyı dikkatlice gözlemleyin. Görünür sızıntı meydana gelirse, şırınnada kalan enjekte hacmini kontrol ederek enjeksiyonu durdurun ve sızıntı hacmini not edin. Sızıntı küçük hacimdeyse (<10 μL) ve ardından herhangi bir sızıntıyı gazlı bezle emer ve enjeksiyonu tamamlamak için iğneyi farklı bir pankreas lobülüne yeniden konumlandırın.
12. Dalak ve pankreası değiştirin ve karın duvarını sürekli bir şekilde 5/0 poliglkolik asit dikişi ile kapatın. Cildi klipslerle kapatın.
13. Fareyi anesteziden kurtulana kadar ısıtılmış bir kafeste izleyin. Uyandıktan ve uyarıldıktan sonra fareyi kafesine geri taşıyın.

2. Kanser rezeksiyon cerrahisi: Distal pankreastomi ve splenektomi

1. İmplantasyon ile ilgili rezeksiyon zamanlaması deneysel protokole bağlı olarak değişebilir. Genel olarak, tümörlerin rezeksiyondan önce en az 3 hafta büyümesine izin verin, ancak bunu belirli implante edilmiş kanser hücresi hattı için ampirik olarak optimize edin.
2. Rezeksiyon ameliyatından bir gün önce, lokalize primer tümörün varlığını doğrulamak için hayvanlar üzerinde biyolüminesans görüntülemesi gerçekleştirin. Bu görüntüleme çalışmasının, bariz ekstra pankreas hastalığı olan fareleri rezeksiyondan dışlamak için kullanıldığını unutmayın. Rezeksiyon için uygunluğu belirlemek için eşik olarak ne boyut ne de parlak akı kullanılmamalıdır.
   1. Fareleri tartın ve D-luciferin intraperitoneally (150 mg / kg) ile enjekte edin.
   2. Luciferin kinetik eğrisinin performansına göre her deney için luciferin enjeksiyonu ile ilgili görüntüleme adımının zamanlamasını belirleyin. Işıltılı akısının maksimumun% 90'ının üzerinde olduğu süre, biyolüminesans görüntüleme için en uygun zamanı temsil eder (bu deneyde, enjeksiyon sonrası 18 ila 26 dakika)
   3. Anesteziye neden olur ve izofluran (sırasıyla% 4 ve% 3 oksijen ile) kullanmaya devam eder ve biyolüminesan görüntüleme cihazı (örneğin, IVIS Lumina II) kullanarak görüntüleme gerçekleştirir. Otomatik pozlama ve binning ayarlarını kullanın (ancak bu, beklenen parlak akı için optimize edilebilir).
3. Sınıf II biyogüvenlik kabinini prosedür için hazırlayın. Steril plastik bir örtü ile kaplanmış bir ısıtma paspası kullanın. Diseksiyon sırasında büyütme için, 2,5x ila 3,5x büyütme cerrahi loupes bir çift kullanın.
4. Fareyi intraperitoneal enjeksiyonla 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin ile uyuşturun.
5. 5 mg/kg enrofloksasin antibiyotik profilaksisi, 2,5 mg/kg flunixin analjezi ve %0,9 salin deri altı 1 mL'si uygulanır.
6. Fareyi steril alana bir destek pozisyonunda yerleştirin ve povidone-iyot ve ardından cilt hazırlığı için% 70 etanol uygulayın.
7. Karnın sol kraniyal kadranının derisinde, tercihen önceki kesi bölgesinden uzunlamasına bir kesi yapın.
8. Alttaki kas karın duvarındaki deriyi künt bir şekilde parçalara ayrıştırın ve ardından cilt yarasını açık tutmak için bir Alm kendi kendini koruyan retraktör yerleştirin.
9. Perküsler tabakayı, önceki operasyonun dikiş hattının hemen bir tarafına kadar perküler tabakayı inkütleyin ve daha sonra kesiği genişleterek önceki dikiş hattının tamamını kesin.
10. Dalak ve distal pankreası dışlayın ve kraniyal olarak geri çekin. Pankreasın kaudal yönünde, kolon film yapışmaları ile tutturulmuş olarak bulunabilir. Bu bulunursa, kolonu açıkça parçalara ayırın.
11. Pankreas ve dalak damarlarının vücuduna dikkatlice bir çift tokmak dorsal geçirin ve bu alanı açın. Bu, sonraki ligasyon için bir pankreas segmentini serbest bıraktı.
12. Pankreasın proksimal gövdesini bir titanyum ligasyon klipsi ile tümöre yapıştırın ve sonra pankreas distalini koter ile buna çevirin. Pankreas kütüğünü kontrol etmenin alternatif bir yolu, transeksiyondan önce 5/0 poliglkolik asit dikişi ile süreklilik içinde lige etmektir.
13. Pankreası kaudal olarak geri çekin ve dalak ve midenin kraniyal kutbu arasındaki gastrosplenik damarları dağlayın.
14. Örneği çıkarın ve hemostazı onaylayın.
15. Karın duvarını 5/0 poliglkolik asit dikişi ile sürekli bir şekilde kapatın. Cildi klipslerle kapatın.

3. Ameliyat sonrası yönetim

1. Anestezi sonrası hemen dönemde (yukarıdaki prosedürlerin her ikisi için), fareyi anesteziden kurtulana kadar ısıtılmış bir kafeste izleyin. Uyandıktan ve uyarıldıktan sonra fareyi kafesine geri taşıyın. Ameliyat sonrası dönemde, hayvanları ağrı ve sıkıntı belirtileri için izleyin. Deri altı enjeksiyonu ile 0,05 mg/ kg buprenorfin uygulayın ve hayvanları 12 saat boyunca yakından gözlemleyin.
2. Daha sonra, fareleri günlük olarak kilo, yiyecek alımı ve aktivite için izleyin. Kesi bölgelerini ve palpate tümör büyüklüğü için inceleyin. Ameliyat sonrası yedinci günde cilt klipslerini çıkarın.
3. İnsancıl uç noktalara ulaşılırsa fareyi ötenazi edin. Bu insancıl uç noktalar şunlardır: vücut ağırlığının kaybı >20%, tedavi edilemeyen sıkıntı özellikleri (kambur duruş, hareket eksikliği veya tımar dahil) ve dış palpasyon tarafından tahmin edildiği gibi 1 cm^3'ten büyük tümör boyutu.

Sonuçlar

Ardışık 59 fare implantasyon ameliyatı geçirdi. Brüt sızıntı sekizde meydana geldi (%14) Fare. Enjeksiyon anında sızıntı derecesi, protokol bölümünde yukarıda açıklandığı gibi tahmin edilmektedir. Bu implante tümörlerin büyümesine izin vermek için üç hafta sonra, rezeksiyon öncesi biyolüminesans görüntülemesi, rezeksiyondan önce brüt metastatik hastalığı olan fareleri dışlamak için yapıldı. Kırk beş (%76) farelere cerrahi rezeksiyon uygulandı.

Hep...

Tartışmalar

Pankreas kanserinin rezeksiyonlu ortotopik fare modeli önemlidir, çünkü adjuvan ve neoadjuvan tedavilerin testine izin verir. Bu özellikle cerrahinin en etkili tedavi olmaya devam ettiği ancak yüksek nüks riski ile ilişkili olduğu pankreas kanserinde önemlidir. Bu makalede, neoadjuvan / adjuvan tedavinin gerekli olduğu klinik senaryoyu çoğaltarak, rezeksiyonla tedavi edilebilen pankreas kanserini güvenilir bir şekilde üretecek bir yöntem açıklanmaktadır.

Mevcut yö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure
AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid)	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA		supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan
Autoclip wound clips, 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia
Cancer associated human pancreatic stellate cells	Pancreatic Research Group cell bank		In house cell bank
Cryogenic tubes, 1.0 mL	Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia	366656
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Foetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	16000044
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female	Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	21056023
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	15140122
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	11875085
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Trypsin 0.05%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25300054	For pancreatic stellate cells
Trypsin 0.25%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25200056	For ASPC-1 cells
U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA
Equipment for Resection Procedure
Alm self-retaining retractor			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Autoclip wound clips 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia	08-559NP
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Hand-held high temperature fine tip cautery	Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA	AA01
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device	Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex wound clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Titanium “Weck style” Ligaclip, small	HZMIM, Hangzhou, China
Titanium Ligaclip applier for open surgery, small	HZMIM, Hangzhou, China
Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber	Generic		Generic vapouriser and induction chamber
Drugs for Procedures
70% w/w ethanol solution	Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia		Applied topically as surgical skin preparation
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 0.05 mg/kg s.c.
D-Luciferin (1 U/g)	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA	122799	diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p
Enrofloxacin 50 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 5 mg/kg s.c.
Flunixin 50 mg/mL	Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia		Dose: 2.5 mg/kg s.c.
Isoflurane	Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia		Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance
Ketamine 100 mg/mL	Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia		Dose: 80 mg/kg i.p.
Povidone-Iodine 10% w/v solution	Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia	RIO00802F	Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation
Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w)	Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia		Applied to both eyes
Sodium chloride 0.9% w/v	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	9481P	Dose: 900 μL s.c.
Water for injections BP	Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia		For dilution of drugs
Xylazine 20 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 10 mg/kg i.p.