Um modelo de rato resemcional ortotópico de câncer pancreático

Resumo

No contexto clínico, pacientes com câncer pancreático localizado serão submetidos à pancreatectomia seguida de tratamento adjuvante. Este protocolo aqui relatado visa estabelecer um método seguro e eficaz de modelagem deste cenário clínico em camundongos nus, através da implantação ortotópica de câncer pancreático seguido de pancreatectomia distal e esplenectomia.

Resumo

Faltam modelos animais satisfatórios para estudar terapia adjuvante e/ou neoadjuvante em pacientes que estão sendo considerados para cirurgia de câncer de pâncreas (PC). Para suprir essa deficiência, descrevemos um modelo de camundongos envolvendo implantação ortotópica de PC seguido de pancreatectomia distal e esplenectomia. O modelo demonstrou ser seguro e adequadamente flexível para o estudo de diversas abordagens terapêuticas em ambientes adjuvante e neo adjuvante.

Neste modelo, um tumor pancreático é gerado pela primeira vez pela implantação de uma mistura de células cancerígenas pancreáticas humanas (luciferase-tagged AsPC-1) e células estelares pancreáticas associadas ao câncer humano no pâncreas distal de ratos nus atímicos Balb/c. Após três semanas, o câncer é ressecado por re-laparotomia, pancreatectomia distal e esplenectomia. Neste modelo, a bioluminescência pode ser usada para acompanhar o progresso do desenvolvimento do câncer e os efeitos da ressecção/tratamentos. Após a ressecção, a terapia adjuvante pode ser dada. Alternativamente, o tratamento neoadjuvante pode ser dado antes da ressecção.

Dados representativos de 45 ratos são apresentados. Todos os camundongos foram submetidos a pancreatectomia distal bem sucedida/esplenectomia sem problemas de hemostasia. Uma margem pancreática proximal macroscópica maior que 5 mm foi alcançada em 43 (96%) mouses. A taxa de sucesso técnico da ressecção pancreática foi de 100%, com mortalidade e morbidade precoce de 0%. Nenhum dos animais morreu durante a semana após a ressecção.

Em resumo, descrevemos uma técnica robusta e reprodutível para um modelo de ressecção cirúrgica de câncer de pâncreas em camundongos que imita o cenário clínico. O modelo pode ser útil para o teste de tratamentos adjuvante e neoadjuvante.

Introdução

O adenocarcinoma ductal pancreático (câncer de pâncreas [PC]) está associado a um prognóstico ruim¹. A ressecção cirúrgica continua sendo o único tratamento potencialmente curativo para PC e deve ser considerada para pacientes que apresentam doença em estágio inicial. Infelizmente, mesmo com ressecção de R0 (ou seja, margens de ressecção livres de tumor), a taxa de recidiva (doença metastática local ou não detectada) é alta^2,3. Portanto, a terapia adjuvante sistêmica é indicada em quase todos os pacientes submetidos à ressecção⁴. Além disso, enquanto a terapia neoadjuvante é agora recomendada apenas para cânceres limítrofes ressecáveis, suas indicações estão se expandindo de modo que seu uso rotineiro é o foco de muita pesquisa clínica^5,6,7,8. Para desenvolver novas abordagens terapêuticas para PC envolvendo ressecção, essas abordagens precisam ser primeiramente avaliadas em modelos pré-clínicos que recapitulem com precisão os cenários clínicos.

Modelos ortotópicos de camundongos de PC têm sido frequentemente usados no passado para testar tratamentos medicamentosos^9,10. Muitas delas foram produzidas apenas pela injeção de células cancerígenas no pâncreas do rato, resultando em tumores que não tinham o estroma proeminente característico do PC. Mais recentemente, modelos ortotópicos co-injetores, como o que desenvolvemos pela primeira vez injetando uma mistura de PC humano e células estelares pancreáticas humanas (PSCs, os principais produtores do estroma colágeno em PC), entraram em uso regular^11,12. Os tumores produzidos por essa co-injeção de câncer e células estrômicas exibem (i) tanto os elementos cancerígenos quanto o componente escrogórico característico (desmoplástico) do PC, e (ii) maior proliferação celular cancerígeno e metástase¹¹. Assim, este modelo se assemelha muito ao PC humano. Embora uma série de modelos resseccionais de PC ortotópico tenham sido descritos^13,14,15,16, nenhum refletiu as realidades clínicas da ressecção pancreática em humanos tão precisa quanto este modelo, e, portanto, têm sido subótimais para testar tratamentos adjuvante ou neoadjuvante.

Os objetivos do modelo de camundongos apresentados foram demonstrar como: (i) implantar com sucesso câncer de pâncreas ortotópico, minimizando a disseminação peritoneal inadvertida e (ii) posteriormente resseccionar completamente o câncer. O trabalho destaca dicas e potenciais armadilhas dessa técnica.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Ética Animal da Universidade de Nova Gales do Sul (17/109A). Camundongos nus atímicos fêmeas, com idade entre 8 e 10 semanas pesando 16-19 g, foram usados para este protocolo. Os ratos estavam alojados em gaiolas micro-isoladores e alimentados comercialmente com alimentos e ad libitumde água.

1. Implantação de câncer pancreático ortotópico

1. Prepare as células para implantação. Primeiro, calcule o número de células necessárias para o procedimento (1 x 10⁶ células AsPC-1 com marca de luciferase e 1 x 10⁶ células estelares pancreáticas humanas associadas ao câncer [CAhPSCs] são necessárias para cada animal).
   1. Mantenha essas células em uma incubadora de CO₂ controlada pela temperatura umidificada e realize testes de mycoplasma rotineiros. O meio de cultura utilizado para AsPC-1 e CAhPSCs são RPMI 1640 (com 300 mg/L-glutamina, 20% v/v soro bovino fetal, 1% v/v penicilina/estreptomicina) e IMDM (com 4 mM L-glutamina, 10% v/v soro bovino fetal, 1% v/v penicilina/estreptomicina).
   2. Use técnicas padrão de cultura celular para tentarpsinizar as células em uma suspensão celular. Neutralizar a trippsina usando o respectivo meio de cultura completa em um volume duas vezes maior do que a solução de trippsina utilizada.
   3. Lave essas células duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e resuspend em uma mistura contendo 1 x 10⁶ células AsPC-1 e 1 x 10⁶ CAhPSCs em uma suspensão celular de 50 μL.
   4. Mantenha esta suspensão no gelo até usar.
2. Prepare um armário de biossegurança classe II para o procedimento. Use um tapete de aquecimento sobreposto por uma cortina de plástico estéril. Para ampliação durante o procedimento, utilize um par de lupas cirúrgicas de ampliação de 2,5x a 3,5x.
3. Prepare os cotonetes de corda da bolsa cortando um orifício de 1 cm de diâmetro, em um cotonete de gaze. Segure este orifício com uma sutura de corda de bolsa. Qualquer sutura trançada fina pode ser usada para isso (por exemplo, sutura de ácido poliglicóclico 5/0). O material de sutura trançada é recomendado, pois permite que o nó solto permaneça no lugar após o aperto. Isto é ilustrado na Figura 1a.
4. Anestesiar o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina por injeção intraperitoneal.
5. Administre 5 mg/kg de profilaxia antibiótico enrofloxacina, 2,5 mg/kg de analgesia flunixina e 1 mL de 0,9% de soro fisiológico subcutâneamente.
6. Uma vez anestesiado, coloque o rato no campo estéril em uma posição supina e aplique povidone-iodo seguido de 70% de etanol para preparação da pele.
7. Faça uma incisão longitudinal na pele do quadrante craniano esquerdo do abdômen, e depois entre no abdômen incisando a camada muscular entre fórceps.
8. Carregue uma seringa de insulina de 29 G com 50 μL de suspensão celular – isso equivale a 1 x 10⁶ CAhPSCs e 1 x 10⁶ células AsPC-1 com marca de luciferase por injeção. Monte-o no dispositivo de injeção. O design e a função deste dispositivo de injeção são explicados em detalhes na Figura 1b e sua legenda.
9. Coloque o cotonete de corda de bolsa sobre a incisão laparotomia e, em seguida, exteriorize o baço e a cauda pancreática através da abertura deste cotonete. Aperte a corda da bolsa para cercar suavemente o corpo do pâncreas, expondo a cauda pancreática para injeção. É importante estar apertado o suficiente para que a gaze entre em contato com o pâncreas circunferencialmente enquanto ao mesmo tempo não a constrita.
10. Usando um par de fórceps, segure a cauda do pâncreas e coloque suavemente a tensão lateral sobre ele. Puna a superfície peritoneal ventral com a agulha em um ângulo raso e, em seguida, injete a suspensão celular no pâncreas de forma lenta e controlada (mais de 10-15 s) com o dispositivo de injeção.
11. Durante o processo de injeção, observe cuidadosamente o vazamento — tanto ao redor do local da injeção (do refluxo) quanto do outro lado do lobule pancreático (em caso de penetração através e através). Se ocorrer vazamento visível, pare a injeção e observe o volume de vazamento verificando o volume de injeção restante na seringa. Se o vazamento for de pequeno volume (<10 μL), e então absorver qualquer vazamento com gaze e reposicionar a agulha em um lobule pancreático diferente para completar a injeção.
12. Substitua o baço e o pâncreas e feche a parede abdominal com sutura de ácido poliglicólico 5/0 de forma contínua. Feche a pele com clipes.
13. Monitore o rato em uma gaiola aquecida até se recuperar do anestésico. Uma vez acordado e alerta, mova o rato de volta para sua gaiola.

2. Cirurgia de ressecção do câncer: Pancreatectomia distal e esplenectomia

1. O tempo de ressecção em relação à implantação pode variar dependendo do protocolo experimental. Em geral, permitem que os tumores cresçam pelo menos por 3 semanas antes da ressecção, mas otimizem isso empiricamente para a linha de células cancerígenas implantadas em particular.
2. No dia anterior à cirurgia de ressecção, realize imagens de bioluminescência nos animais para confirmar a presença de um tumor primário localizado. Observe que este estudo de imagem é simplesmente usado para excluir camundongos com doença extra-pancreática óbvia da ressecção. Nem o tamanho nem o fluxo radiante devem ser usados como limiares para determinar a elegibilidade para a ressecção.
   1. Pese camundongos e injete com D-luciferin intraperitoneally (150 mg/kg).
   2. Determine o tempo da etapa de imagem em relação à injeção de luciferina para cada experimento pelo desempenho de uma curva cinética de luciferina. O período em que o fluxo radiante está acima de 90% do seu máximo representa o tempo ideal para a imagem de bioluminescência (neste experimento, 18 a 26 minutos após a injeção)
   3. Induzir anestesia e manter o uso de isoflurane (4% e 3% com oxigênio, respectivamente) e realizar imagens usando um dispositivo de imagem bioluminescente (por exemplo, IVIS Lumina II). Use configurações automáticas de exposição e binning (isso pode, no entanto, ser otimizado para o fluxo radiante esperado).
3. Prepare o armário de biossegurança classe II para o procedimento. Use um tapete de aquecimento sobreposto por uma cortina de plástico estéril. Para ampliação durante a dissecção, use um par de lupas cirúrgicas de ampliação de 2,5x a 3,5x.
4. Anestesiar o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina por injeção intraperitoneal.
5. Administre 5 mg/kg de profilaxia antibiótico enrofloxacina, 2,5 mg/kg de analgesia flunixina e 1 mL de 0,9% de soro fisiológico subcutâneamente.
6. Coloque o mouse no campo estéril em uma posição supina e aplique povidone-iodo seguido de 70% de etanol para preparação da pele.
7. Faça uma incisão longitudinal na pele do quadrante craniano esquerdo do abdômen, de preferência através do local de incisão anterior.
8. Dissecar sem rodeios a pele da parede abdominal muscular subjacente, e então coloque um retraínte auto-retentor de Alm para manter a ferida da pele aberta.
9. Incisar a camada muscular entre fórceps apenas para um lado da linha de sutura da operação anterior, e, em seguida, estender a incisão para extirpara extirpara toda a linha de sutura anterior.
10. Exteriorize o baço e o pâncreas distal e retraia-o cranialmente. No aspecto caudal do pâncreas, o cólon pode ser encontrado preso por aderências cinematográficas. Se isso for encontrado, disseca o cólon sem rodeios.
11. Passe cuidadosamente um par de fórceps dorsais para o corpo do pâncreas e vasos esplênicos e abra este espaço. Isso libera um segmento de pâncreas para a ligadura subsequente.
12. Ligate o corpo do pâncreas proximal ao tumor com um clipe de ligadura de titânio, e depois transecte o pâncreas distal para isso com cauteria. Uma maneira alternativa de controlar o toco pancreático é liga-lo em continuidade com sutura de ácido poliglicólico de 5/0 antes da transeção.
13. Retraia o pâncreas caudalmente e cauterize os vasos gastrospínicos entre o polo craniano do baço e o estômago.
14. Remova a amostra e confirme a haemostasis.
15. Feche a parede abdominal com sutura de ácido poliglicólico 5/0 de forma contínua. Feche a pele com clipes.

3. Gestão pós-operatória

1. No período pós-anestésico imediato (para ambos os procedimentos acima), monitore o rato em uma gaiola aquecida até ser recuperado do anestésico. Uma vez acordado e alerta, mova o rato de volta para sua gaiola. No pós-operatório, monitore os animais em busca de dor e sinais de angústia. Administre 0,05 mg/kg de buprenorfina por injeção subcutânea e observe de perto os animais por 12 horas.
2. Posteriormente, monitore os camundongos diariamente para o peso, a ingestão de alimentos e a atividade. Examine os locais de incisão e palpato para o tamanho do tumor. Remova os clipes de pele no sétimo dia pós-operatório.
3. Eutanize o rato se os pontos finais humanos forem alcançados. Estes pontos finais humanos incluem: perda de peso corporal >20%, características de angústia intratável (incluindo postura curvada, falta de movimento ou preparo) e tamanho do tumor superior a 1 cm^3, conforme estimado pela palpação externa.

Resultados

Cinquenta e nove camundongos consecutivos foram submetidos a cirurgia de implantação. Vazamento bruto ocorreu em oito (14%) mouses. O grau de vazamento no momento da injeção é estimado como descrito acima na seção de protocolo. Após três semanas para permitir que esses tumores implantados crescessem, a imagem de bioluminescência pré-ressecção foi realizada para excluir camundongos com doença metastática bruta antes da ressecção. Quarenta e cinco (76%) camundongos submetidos à ressecção cirúrgica.

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Discussão

Um modelo de camundongo ortotópico resectional de câncer de pâncreas é importante porque permite o teste de tratamentos adjuvantes e neoadjuvantes. Isso é particularmente importante no câncer de pâncreas, onde a cirurgia continua sendo o tratamento mais eficaz, mas está associada ao alto risco de recidiva. Este artigo descreve um método que produzirá de forma confiável um câncer pancreático potencialmente curável com ressecção, replicando o cenário clínico onde a terapia neoadjuvante/adjuvante é necess...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure
AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid)	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA		supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan
Autoclip wound clips, 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia
Cancer associated human pancreatic stellate cells	Pancreatic Research Group cell bank		In house cell bank
Cryogenic tubes, 1.0 mL	Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia	366656
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Foetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	16000044
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female	Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	21056023
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	15140122
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	11875085
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Trypsin 0.05%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25300054	For pancreatic stellate cells
Trypsin 0.25%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25200056	For ASPC-1 cells
U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA
Equipment for Resection Procedure
Alm self-retaining retractor			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Autoclip wound clips 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia	08-559NP
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Hand-held high temperature fine tip cautery	Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA	AA01
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device	Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex wound clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Titanium “Weck style” Ligaclip, small	HZMIM, Hangzhou, China
Titanium Ligaclip applier for open surgery, small	HZMIM, Hangzhou, China
Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber	Generic		Generic vapouriser and induction chamber
Drugs for Procedures
70% w/w ethanol solution	Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia		Applied topically as surgical skin preparation
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 0.05 mg/kg s.c.
D-Luciferin (1 U/g)	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA	122799	diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p
Enrofloxacin 50 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 5 mg/kg s.c.
Flunixin 50 mg/mL	Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia		Dose: 2.5 mg/kg s.c.
Isoflurane	Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia		Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance
Ketamine 100 mg/mL	Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia		Dose: 80 mg/kg i.p.
Povidone-Iodine 10% w/v solution	Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia	RIO00802F	Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation
Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w)	Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia		Applied to both eyes
Sodium chloride 0.9% w/v	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	9481P	Dose: 900 μL s.c.
Water for injections BP	Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia		For dilution of drugs
Xylazine 20 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 10 mg/kg i.p.