Un modèle murin de résection orthotopique du cancer du pancréas

Résumé

Dans le contexte clinique, les patients atteints d’un cancer pancréatique localisé subiront une pancréatectomie suivie d’un traitement adjuvant. Ce protocole rapporté ici vise à établir une méthode sûre et efficace de modélisation de ce scénario clinique chez les souris nues, par l’implantation orthotopic du cancer pancréatique suivie de pancreatectomy et de splenectomy distaux.

Résumé

Il y a un manque de modèles animaux satisfaisants pour étudier l’adjuvant et/ou la thérapie neoadjuvant dans les patients étant considérés pour la chirurgie du cancer pancréatique (PC). Pour adresser cette insuffisance, nous décrivons un modèle de souris impliquant l’implantation orthotopic du PC suivi de pancreatectomy et de splenectomy distaux. Il a été démontré que le modèle est sûr et suffisamment flexible pour l’étude de diverses approches thérapeutiques dans des arrangements adjuvants et néo-adjuvants.

Dans ce modèle, une tumeur pancréatique est d’abord générée en implantant un mélange de cellules cancéreuses pancréatiques humaines (AsPC-1 marqué par luciférase) et de cellules étoilées pancréatiques associées au cancer humain dans le pancréas distal de souris nues athymiques Balb/c. Après trois semaines, le cancer est réséqué par re-laparotomie, pancréatectomie distale et splénectomie. Dans ce modèle, l’imagerie par bioluminescence peut être utilisée pour suivre l’évolution du développement du cancer et les effets de la résection/des traitements. Après la résection, on peut donner un traitement adjuvant. Alternativement, le traitement neoadjuvant peut être donné avant la résection.

Des données représentatives de 45 souris sont présentées. Toutes les souris ont subi pancreatectomy/splenectomy distal réussi sans des issues de hemostasis. Une marge pancréatique proximale macroscopique plus grande que 5 millimètres a été réalisée dans 43 (96%) souris. Le taux de succès technique de la résection pancréatique était 100%, avec la mortalité et la morbidité tôt de 0%. Aucun des animaux n’est mort pendant la semaine après la résection.

En résumé, nous décrivons une technique robuste et reproductible pour un modèle chirurgical de résection du cancer pancréatique chez la souris qui imite le scénario clinique. Le modèle peut être utile pour l’essai des traitements adjuvants et néoadjuvants.

Introduction

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (cancer du pancréas [PC]) est associé à un pronostic pauvre^1. La résection chirurgicale demeure le seul traitement potentiellement curatif pour le PC et devrait être considérée pour des patients présent avec la maladie de partie. Malheureusement, même avec la résection R0 (c’est-à-dire, marges de résection exemptes de tumeur), le taux de récidive (local ou de la maladie métastatique non détectée) est élevé^2,3. Par conséquent, la thérapie adjuvante systémique est indiquée dans presque tous les patients qui subissent la résection⁴. En outre, alors que le traitement néoadjuvant n’est maintenant recommandé que pour les cancers borderline-résécables, ses indications se développent de telle sorte que son utilisation systématique est au centre de nombreuses recherches cliniques^5,6,7,8. Afin de développer des approches thérapeutiques originales pour le PC impliquant la résection, ces approches doivent d’abord être évaluées dans les modèles précliniques qui récapitulent exactement les arrangements cliniques.

Des modèles murins orthotopiques de PC ont été fréquemment utilisés dans le passé pour tester des traitements médicamenteux^9,10. Plusieurs de ces ceci ont été produits par l’injection des cellules cancéreuses seules dans le pancréas de souris, ayant pour résultat les tumeurs qui ont manqué du stroma en avant qui est caractéristique du PC. Plus récemment, les modèles orthotopiques de co-injection, tels que celui que nous avons d’abord développé en injectant un mélange de PC humain et de cellules étoilées pancréatiques humaines (PSCs, les producteurs primaires du stroma collagène dans le PC), sont entrés en usage régulier^11,12. Les tumeurs produites par une telle co-injection du cancer et des cellules stromal montrent (i) les éléments de cancer et le composant stromal caractéristique (desmoplastic) du PC, et (ii) la prolifération et la métastase augmentées de cellule cancéreuse^11. Ainsi, ce modèle ressemble étroitement au PC humain. Tandis qu’un certain nombre de modèles résectional de PC orthotopic ont été décrits^13,14,15,16,aucun n’a reflété les réalités cliniques de la résection pancréatique chez l’homme aussi précis que ce modèle, et ont donc été sous-optimaux pour tester des traitements auxiliaires ou neoadjuvants.

Les buts du modèle murin présenté étaient de démontrer comment : (i) implanter avec succès le cancer pancréatique orthotopic tout en réduisant au minimum la diffusion péritonéale négligente et (ii) plus tard réséquer complètement le cancer. L’article met en évidence les astuces et les pièges potentiels de cette technique.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud (17/109A). Des souris nues athymiques femelles de Balb/c, âgées 8-10 semaines pesant 16-19 g, ont été employées pour ce protocole. Les souris ont été logées dans des cages de micro-isolateur et nourries ad libitum avecdes granulés disponibles dans le commerce.

1. Implantation orthotopique du cancer du pancréas

1. Préparer les cellules pour l’implantation. Tout d’abord, calculer le nombre de cellules requises pour la procédure (1 x^{10 6} cellules AsPC-1 marquées par luciférase et 1 x 10⁶ cellules étoilées pancréatiques humaines associées au cancer [CAhPSCs] sont nécessaires pour chaque animal).
   1. Maintenir ces cellules dans un incubateur de CO₂ humidifié à température contrôlée et effectuer des tests de routine sur les mycoplasmes. Les milieux de culture utilisés pour l’AsPC-1 et les CAhPSC sont les RPMI 1640 (avec 300 mg/L de L-glutamine, 20 % v/v de sérum fœtal bovin, 1 % v/v pénicilline/streptomycine) et imdm (avec 4 mM de L-glutamine, 10 % v/v de sérum fœtal bovin, 1 % v/v pénicilline/streptomycine).
   2. Utilisez des techniques de culture cellulaire standard pour trypsiniser les cellules dans une suspension cellulaire. Neutraliser la trypsine en utilisant le milieu de culture complet respectif à un volume deux fois supérieur à celui de la solution de trypsine utilisée.
   3. Laver ces cellules deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les remettre en suspension dans un mélange contenant 1 x^{10 6} cellules AsPC-1 et 1 x 10⁶ CAhPSCs dans une suspension cellulaire de 50 μL.
   4. Gardez cette suspension sur la glace jusqu’à son utilisation.
2. Préparer une armoire de biosécurité de classe II pour la procédure. Utilisez un tapis chauffant recouvert d’un rideau en plastique stérile. Pour le grossissement pendant la procédure, utilisez une paire de loupes chirurgicales à grossissement de 2,5x à 3,5x.
3. Préparez des écouvillons de cordon de bourse en coupant un trou de 1 cm de diamètre dans un écouvillon de gaze. Fixez ce trou avec une suture de cordon de bourse. Toute suture fine tressée peut être utilisée pour cela (par exemple, suture à l’acide polyglycolique 5/0). Le matériau de suture tressé est recommandé car il permet au nœud lâche de rester en place après le serrage. Ceci est illustré à la figure 1a.
4. Anesthésier la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale.
5. Administrer 5 mg/kg d’antibiothérapie prophylactique à l’enrofloxacine, 2,5 mg/kg d’analgésie à la flunixine et 1 ml de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée.
6. Une fois anesthésiée, placez la souris sur le champ stérile en décubitus dorsal et appliquez de la povidone-iode suivie de 70% d’éthanol pour la préparation de la peau.
7. Faites une incision longitudinale dans la peau du quadrant crânien gauche de l’abdomen, puis entrez dans l’abdomen en incisant la couche musculaire entre les pinces.
8. Chargez une seringue à insuline de 29 G avec 50 μL de suspension cellulaire, ce qui équivaut à 1 x^{10 6} CAhPSCs et 1 x 10⁶ cellules AsPC-1 marquées à la luciférase par injection. Montez-le sur le dispositif d’injection. La conception et la fonction de ce dispositif d’injection sont expliquées en détail à la figure 1b et dans sa légende.
9. Placez l’écouvillon de la bourse sur l’incision de la laparotomie, puis extériorisez la rate et la queue pancréatique par l’ouverture de cet écouvillon. Serrez le cordon de la bourse pour encercler doucement le corps du pancréas, exposant la queue pancréatique pour injection. Il est important d’être suffisamment serré pour que la gaze entre en contact avec le pancréas de manière circonférentielle tout en ne le resserrant pas.
10. À l’aide d’une paire de pinces, saisissez la queue du pancréas et placez-y doucement une tension latérale. Percer la surface péritonéale ventrale avec l’aiguille à un angle peu profond, puis injecter la suspension cellulaire dans le pancréas de manière lente et contrôlée (plus de 10−15 s) avec le dispositif d’injection.
11. Au cours du processus d’injection, observez attentivement les fuites, à la fois autour du site d’injection (à partir du reflux) et de l’autre côté du lobule pancréatique (en cas de pénétration à travers et à travers). Si une fuite visible se produit, arrêtez l’injection et notez le volume de fuite en vérifiant le volume d’injection restant dans la seringue. Si la fuite est de petit volume (<10 μL), puis absorbez toute fuite avec de la gaze et repositionnez l’aiguille dans un lobule pancréatique différent pour compléter l’injection.
12. Remplacez la rate et le pancréas et fermez la paroi abdominale par une suture d’acide polyglycolique 5/0 de manière continue. Fermez la peau avec des clips.
13. Surveillez la souris dans une cage réchauffée jusqu’à ce qu’elle soit remise de l’anesthésique. Une fois éveillé et alerte, ramenez la souris à sa cage.

2. Chirurgie de résection du cancer : Pancréatectomie distale et splénectomie

1. Le moment de la résection par rapport à l’implantation peut varier selon le protocole expérimental. En général, permettre aux tumeurs de se développer au moins pendant 3 semaines avant la résection, mais optimiser empiriquement cela pour la lignée cellulaire cancéreuse implantée particulière.
2. La veille de la chirurgie de résection, effectuez une imagerie par bioluminescence sur les animaux pour confirmer la présence d’une tumeur primaire localisée. Notez que cette étude d’imagerie est simplement utilisée pour exclure de la résection les souris atteintes d’une maladie extra-pancréatique évidente. Ni la taille ni le flux radiant ne devraient être utilisés comme seuils pour déterminer l’admissibilité à la résection.
   1. Peser les souris et injecter de la D-luciférine par voie intrapéritonéale (150 mg/kg).
   2. Déterminer le moment de l’étape d’imagerie par rapport à l’injection de luciférine pour chaque expérience par l’exécution d’une courbe cinétique de luciférine. La période de temps où le flux radiant est supérieur à 90% de son maximum représente le temps optimal pour l’imagerie par bioluminescence (dans cette expérience, 18 à 26 minutes après l’injection)
   3. Induire une anesthésie et maintenir l’utilisation d’isoflurane (4% et 3% avec de l’oxygène, respectivement) et effectuer l’imagerie à l’aide d’un dispositif d’imagerie bioluminescente (par exemple, IVIS Lumina II). Utilisez les paramètres d’exposition et de binning automatiques (cela peut toutefois être optimisé pour le flux radiant attendu).
3. Préparer l’armoire de biosécurité de classe II pour la procédure. Utilisez un tapis chauffant recouvert d’un rideau en plastique stérile. Pour le grossissement pendant la dissection, utilisez une paire de loupes chirurgicales à grossissement de 2,5x à 3,5x.
4. Anesthésier la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale.
5. Administrer 5 mg/kg d’antibiothérapie prophylactique à l’enrofloxacine, 2,5 mg/kg d’analgésie à la flunixine et 1 ml de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée.
6. Placez la souris sur le champ stérile en décubitus dorsal et appliquez de la povidone-iode suivie d’éthanol à 70% pour la préparation de la peau.
7. Faire une incision longitudinale dans la peau du quadrant crânien gauche de l’abdomen, de préférence par le site d’incision précédent.
8. Disséquer brutalement la peau de la paroi abdominale musculaire sous-jacente, puis placer un rétracteur auto-retenant Alm pour maintenir la plaie de la peau ouverte.
9. Inciser la couche musculaire entre les pinces juste d’un côté de la ligne de suture de l’opération précédente, puis étendre l’incision pour exciser toute la ligne de suture précédente.
10. Extérioriser la rate et le pancréas distal et le rétracter crânien. À l’aspect caudal du pancréas, les deux points peuvent être trouvés attachés par des adhérences filmiques. Si cela est trouvé, disséquer carrément le côlon.
11. Passez soigneusement une paire de pinces dorsales au corps du pancréas et des vaisseaux spléniques et ouvrez cet espace. Cela libère un segment du pancréas pour une ligature ultérieure.
12. Ligate le corps du pancréas proximal à la tumeur avec un clip titane de ligature, et puis transecter le pancréas distal à ceci avec la cautérisation. Une autre manière de contrôler le moignon pancréatique est de le ligater dans la continuité avec la suture acide polyglycolique 5/0 avant transection.
13. Rétracter le pancréas caudalement et cautériser les vaisseaux gastrospléniques entre le pôle crânien de la rate et l’estomac.
14. Retirer l’échantillon et confirmer l’hémostase.
15. Fermez la paroi abdominale avec une suture d’acide polyglycolique 5/0 de manière continue. Fermez la peau avec des clips.

3. Prise en charge postopératoire

1. Dans la période post-anesthésique immédiate (pour les deux procédures ci-dessus), surveiller la souris dans une cage réchauffée jusqu’à ce qu’elle soit récupérée de l’anesthésique. Une fois éveillé et alerte, ramenez la souris à sa cage. Dans la période postopératoire, surveillez les animaux pour la douleur et les signes de détresse. Administrer 0,05 mg/kg de buprénorphine par injection sous-cutanée et observer de près les animaux pendant 12 heures.
2. Par la suite, surveillez quotidiennement le poids, l’apport alimentaire et l’activité des souris. Examinez les sites d’incision et palpez pour la taille de la tumeur. Enlever les clips cutanés le septième jour postopératoire.
3. Euthanasier la souris si des extrémités sans cruauté sont atteintes. Ces critères d’évaluation sans cruauté comprennent : la perte de poids corporel >20 %, les caractéristiques de détresse incurable (y compris la posture voûtée, le manque de mouvement ou de toilettage) et la taille de la tumeur supérieure à 1 cm³ telle qu’estimée par palpation externe.

Résultats

Cinquante-neuf souris consécutives ont subi une chirurgie d’implantation. Une fuite grossière s’est produite dans huit (14 %) souris. Le degré de fuite au moment de l’injection est estimé comme décrit ci-dessus dans la section protocole. Après trois semaines pour permettre à ces tumeurs implantées de se développer, la formation image de bioluminescence de pré-résection a été exécutée pour exclure des souris avec la maladie métastatique brute avant la résection. Quarante-cinq (76 %) Les souris ont s...

Discussion

Un modèle de souris orthotopic résectional de cancer pancréatique est important parce qu’il tient compte de l’essai des traitements auxiliaires et néoadjuvants. Ceci est particulièrement important dans le cancer du pancréas où la chirurgie reste le traitement le plus efficace, mais est associée à un risque élevé de récidive. Cet article décrit une méthode qui produira sûrement un cancer pancréatique qui est potentiellement curable avec la résection, reproduisant le scénario clinique où la thérapie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure
AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid)	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA		supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan
Autoclip wound clips, 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia
Cancer associated human pancreatic stellate cells	Pancreatic Research Group cell bank		In house cell bank
Cryogenic tubes, 1.0 mL	Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia	366656
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Foetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	16000044
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female	Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	21056023
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	15140122
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	11875085
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Trypsin 0.05%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25300054	For pancreatic stellate cells
Trypsin 0.25%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25200056	For ASPC-1 cells
U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA
Equipment for Resection Procedure
Alm self-retaining retractor			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Autoclip wound clips 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia	08-559NP
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Hand-held high temperature fine tip cautery	Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA	AA01
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device	Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex wound clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Titanium “Weck style” Ligaclip, small	HZMIM, Hangzhou, China
Titanium Ligaclip applier for open surgery, small	HZMIM, Hangzhou, China
Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber	Generic		Generic vapouriser and induction chamber
Drugs for Procedures
70% w/w ethanol solution	Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia		Applied topically as surgical skin preparation
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 0.05 mg/kg s.c.
D-Luciferin (1 U/g)	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA	122799	diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p
Enrofloxacin 50 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 5 mg/kg s.c.
Flunixin 50 mg/mL	Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia		Dose: 2.5 mg/kg s.c.
Isoflurane	Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia		Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance
Ketamine 100 mg/mL	Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia		Dose: 80 mg/kg i.p.
Povidone-Iodine 10% w/v solution	Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia	RIO00802F	Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation
Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w)	Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia		Applied to both eyes
Sodium chloride 0.9% w/v	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	9481P	Dose: 900 μL s.c.
Water for injections BP	Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia		For dilution of drugs
Xylazine 20 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 10 mg/kg i.p.