Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Zusammenfassung

Im klinischen Kontext werden Patienten mit lokalisierten Bauchspeicheldrüsenkrebs einer Pankreastektomie unterzogen, gefolgt von einer adjuvanten Behandlung. Dieses hier berichtete Protokoll zielt darauf ab, eine sichere und effektive Methode zur Modellierung dieses klinischen Szenarios bei nackten Mäusen durch orthotopische Implantation von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu etablieren, gefolgt von distaler Pankreatektomie und Splenektomie.

Zusammenfassung

Es mangelt an zufriedenstellenden Tiermodellen, um eine adjuvante und/oder neoadjuvante Therapie bei Patienten zu untersuchen, die für eine Operation von Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC) in Betracht gezogen werden. Um diesen Mangel zu beheben, beschreiben wir ein Mausmodell mit orthotopischer Implantation von PC, gefolgt von distaler Pankreatektomie und Splenektomie. Das Modell hat sich als sicher und geeignet flexibel für die Untersuchung verschiedener therapeutischer Ansätze in adjuvanten und neoadjuvanten Umgebungen erwiesen.

In diesem Modell wird ein Pankreastumor zunächst erzeugt, indem eine Mischung aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (Luciferase-markiertes AsPC-1) und humanen krebsassoziierten Pankreas-Sternzellen in die distale Bauchspeicheldrüse von Balb / c athymischen Nacktmäusen implantiert wird. Nach drei Wochen wird der Krebs durch Re-Laparotomie, distale Pankreatektomie und Splenektomie reseziert. In diesem Modell kann die Biolumineszenz-Bildgebung verwendet werden, um den Fortschritt der Krebsentwicklung und die Auswirkungen von Resektion / Behandlungen zu verfolgen. Nach der Resektion kann eine adjuvante Therapie gegeben werden. Alternativ kann eine neoadjuvante Behandlung vor der Resektion erfolgen.

Repräsentative Daten von 45 Mäusen werden vorgestellt. Alle Mäuse wurden einer erfolgreichen distalen Pankreatektomie / Splenektomie ohne Probleme mit der Hämostase unterzogen. Ein makroskopischer proximaler Pankreasrand größer als 5 mm wurde bei 43 (96%) Mäuse. Die technische Erfolgsrate der Pankreasresektion betrug 100%, mit 0% früher Mortalität und Morbidität. Keines der Tiere starb in der Woche nach der Resektion.

Zusammenfassend beschreiben wir eine robuste und reproduzierbare Technik für ein chirurgisches Resektionsmodell von Bauchspeicheldrüsenkrebs bei Mäusen, das das klinische Szenario nachahmt. Das Modell kann für die Prüfung von adjuvanten und neoadjuvanten Behandlungen nützlich sein.

Einleitung

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (Bauchspeicheldrüsenkrebs [PC]) ist mit einer schlechten Prognose verbunden¹. Die chirurgische Resektion bleibt die einzige potenziell heilende Behandlung für PC und sollte für Patienten mit Erkrankungen im Frühstadium in Betracht gezogen werden. Leider ist selbst bei R0-Resektion (d.h. tumorfreie Resektionsränder) die Rezidivrate (lokal oder von unentdeckter metastasierter Erkrankung) hoch^2,3. Daher ist eine systemische adjuvante Therapie bei fast allen Patienten indiziert, die sich einer Resektion^{4 unterziehen.} Während die neoadjuvante Therapie heute nur noch für grenzwertig resezierbare Krebsarten empfohlen wird, erweitern sich ihre Indikationen so, dass ihre routinemäßige Anwendung im Mittelpunkt vieler klinischer^{Forschungen steht 5,6,7,8}. Um neuartige Therapieansätze für PC mit Resektion zu entwickeln, müssen diese Ansätze zunächst in präklinischen Modellen bewertet werden, die klinische Settings genau rekapitulieren.

Orthotope Mausmodelle von PC wurden in der Vergangenheit häufig verwendet, um medikamentöse Behandlungen zu testen^9,10. Viele davon wurden durch Injektion von Krebszellen allein in die Bauchspeicheldrüse der Maus produziert, was zu Tumoren führte, denen das für PC charakteristische prominente Stroma fehlte. In jüngerer Zeit sind orthotopische Co-Injektionsmodelle, wie das, das wir zuerst durch Injektion einer Mischung aus menschlichen PC- und menschlichen Pankreas-Sternzellen (PSCs, die Hauptproduzenten des kollagenen Stromas im PC) entwickelt haben, regelmäßig verwendet^11,12. Die Tumoren, die durch eine solche Co-Injektion von Krebs und Stromazellen erzeugt werden, weisen (i) sowohl die Krebselemente als auch die charakteristische stromale (desmoplastische) Komponente von PC auf und (ii) eine verbesserte Proliferation und Metastasierung von Krebszellen¹¹. Somit ähnelt dieses Modell stark dem menschlichen PC. Während eine Reihe von Resektionsmodellen des orthotopischen PC^{beschrieben wurden 13,14,15,16}, hat keines die klinischen Realitäten der Pankreasresektion beim Menschen so genau wie dieses Modell widergespiegelt und war daher suboptimal für die Prüfung adjuvanter oder neoadjuvanter Behandlungen.

Ziel des vorgestellten Mausmodells war es, zu demonstrieren, wie man: (i) orthotopischen Bauchspeicheldrüsenkrebs erfolgreich implantiert und gleichzeitig die unbeabsichtigte peritoneale Verbreitung minimiert und (ii) den Krebs anschließend vollständig reseziert. Das Papier hebt Tipps und mögliche Fallstricke dieser Technik hervor.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Animal Care and Ethics Committee der University of New South Wales genehmigt (17/109A). Weibliche athymische Balb / c-Nacktmäuse im Alter von 8-10 Wochen mit einem Gewicht von 16-19 g wurden für dieses Protokoll verwendet. Mäuse wurden in Mikroisolatorkäfigen untergebracht und mit handelsüblichem pelletiertem Futter und Wasser ad libitumgefüttert.

1. Orthotope Bauchspeicheldrüsenkrebs-Implantation

1. Bereiten Sie die Zellen für die Implantation vor. Berechnen Sie zunächst die Anzahl der für das Verfahren erforderlichen Zellen (1 x 10⁶ Luciferase-markierte AsPC-1-Zellen und 1 x 10⁶ krebsindierte menschliche Pankreas-Sternzellen [CAhPSCs] sind für jedes Tier erforderlich).
   1. Halten Sie diese Zellen in einem befeuchteten, temperaturkontrollierten CO 2-Inkubator und führen Sie routinemäßige Mykoplasmentests durch. Kulturmedium für AsPC-1 und CAhPSCs sind RPMI 1640 (mit 300 mg/L L-Glutamin, 20% v/v fötalem Rinderserum, 1% v/v Penicillin/Streptomycin) und IMDM (mit 4 mM L-Glutamin, 10% v/v fötalem Rinderserum, 1% v/v Penicillin/Streptomycin).
   2. Verwenden Sie Standard-Zellkulturtechniken, um die Zellen zu einer Zellsuspension zu trypsinisieren. Neutralisieren Sie das Trypsin unter Verwendung des jeweiligen vollständigen Kulturmediums mit einem Volumen, das doppelt so groß ist wie das der verwendeten Trypsinlösung.
   3. Waschen Sie diese Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und resuspendieren Sie sie in eine Mischung, die 1 x 10⁶ AsPC-1-Zellen und 1 x 10⁶ CAhPSCs in einer 50 μL-Zellsuspension enthält.
   4. Halten Sie diese Suspension bis zum Gebrauch auf Eis.
2. Bereiten Sie eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II für das Verfahren vor. Verwenden Sie eine Heizmatte, die von einem sterilen Kunststoffvorhang überlagert wird. Verwenden Sie zur Vergrößerung während des Eingriffs ein Paar 2,5- bis 3,5-fache Vergrößerungslupen.
3. Bereiten Sie Geldbörsentupfer vor, indem Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1 cm in einen Mulltupfer schneiden. Sichern Sie dieses Loch mit einer Geldbörsennäht. Hierfür kann jede feine geflochtene Naht verwendet werden (z.B. 5/0 Polyglykolsäure naht). Geflochtenes Nahtmaterial wird empfohlen, da es den losen Knoten nach dem Anziehen an Ort und Stelle bleiben lässt. Dies ist in Abbildung 1adargestellt.
4. Betäuben Sie die Maus mit 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion.
5. 5 mg/kg Enrofloxacin Antibiotikaprophylaxe, 2,5 mg/kg Flunixin-Analgesie und 1 ml 0,9% Kochsalzlösung subkutan verabreichen.
6. Nach der Betäubung legen Sie die Maus auf das sterile Feld in Rückenlage und tragen Sie Povidon-Jod gefolgt von 70% Ethanol für die Hautvorbereitung auf.
7. Machen Sie einen Längsschnitt in die Haut des linken Schädelquadranten des Abdomens und betreten Sie dann den Bauch, indem Sie die Muskelschicht zwischen der Zwiege einschneiden.
8. Laden Sie eine 29 G Insulinspritze mit 50 μL Zellsuspension auf – dies entspricht 1 x 10⁶ CAhPSCs und 1 x 10⁶ Luciferase-markierten AsPC-1-Zellen pro Injektion. Montieren Sie es auf dem Injektionsgerät. Das Design und die Funktion dieser Injektionsvorrichtung werden in Abbildung 1b und ihrer Legende ausführlich erläutert.
9. Legen Sie den Geldbörsenabstrich über den Laparotomieschnitt und äußerlich dann die Milz und den Pankreasschwanz durch die Öffnung dieses Tupfers. Ziehen Sie die Geldbörse fest, um den Körper der Bauchspeicheldrüse sanft zu umschließen und den Pankreasschwanz für die Injektion freizulegen. Es ist wichtig, so eng zu sein, dass die Gaze die Bauchspeicheldrüse umlaufend kontaktiert und gleichzeitig nicht einschnürt.
10. Greifen Sie mit einer Zangen den Schwanz der Bauchspeicheldrüse und legen Sie vorsichtig eine seitliche Spannung darauf. Punktieren Sie die ventrale Peritonealoberfläche mit der Nadel in einem flachen Winkel und injizieren Sie dann die Zellsuspension langsam und kontrolliert (über 10-15 s) mit dem Injektionsgerät in die Bauchspeicheldrüse.
11. Achten Sie während des Injektionsprozesses sorgfältig auf Leckagen - sowohl um die Injektionsstelle (durch Reflux) als auch auf der anderen Seite des Pankreasläppchens (im Falle einer durchgehenden Penetration). Wenn eine sichtbare Leckage auftritt, stoppen Sie die Injektion und notieren Sie das Leckagevolumen, indem Sie das Volumen des verbleibenden Injektionsmittels in der Spritze überprüfen. Wenn die Leckage ein kleines Volumen (<10 μL) hat, absorbieren Sie dann jede Leckage mit Gaze und positionieren Sie die Nadel in ein anderes Pankreasläppchen, um die Injektion abzuschließen.
12. Ersetzen Sie Milz und Bauchspeicheldrüse und schließen Sie die Bauchdecke mit 5/0 Polyglykolsäurenaht in kontinuierlicher Weise. Schließen Sie die Skin mit Clips.
13. Überwachen Sie die Maus in einem erwärmten Käfig, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Sobald Sie wach und aufmerksam sind, bewegen Sie die Maus zurück in ihren Käfig.

2. Krebsresektionschirurgie: Distale Pankreatektomie und Splenektomie

1. Der Zeitpunkt der Resektion in Bezug auf die Implantation kann je nach experimentellem Protokoll variieren. Lassen Sie die Tumoren im Allgemeinen mindestens 3 Wochen vor der Resektion wachsen, optimieren Sie dies jedoch empirisch für die jeweilige implantierte Krebszellenlinie.
2. Führen Sie am Tag vor der Resektionsoperation eine Biolumineszenzbildgebung an den Tieren durch, um das Vorhandensein eines lokalisierten Primärtumors zu bestätigen. Beachten Sie, dass diese bildgebungsstudie einfach verwendet wird, um Mäuse mit offensichtlicher extrapankreasartiger Erkrankung von der Resektion auszuschließen. Weder Größe noch Strahlungsfluss sollten als Schwellenwerte für die Bestimmung der Eignung für die Resektion verwendet werden.
   1. Mäuse wiegen und intraperitoneal (150 mg/kg) mit D-Luciferin injizieren.
   2. Bestimmen Sie den Zeitpunkt des Bildgebungsschritts in Bezug auf die Luciferin-Injektion für jedes Experiment durch die Durchführung einer luciferin-kinetischen Kurve. Der Zeitraum, in dem der Strahlungsfluss über 90% seines Maximums liegt, stellt den optimalen Zeitpunkt für die Biolumineszenzbildgebung dar (in diesem Experiment 18 bis 26 Minuten nach der Injektion).
   3. Induzieren Sie die Anästhesie und halten Sie die Verwendung von Isofluran (4% bzw. 3% mit Sauerstoff) aufrecht und führen Sie die Bildgebung mit einem biolumineszierenden Bildgebungsgerät (z. B. IVIS Lumina II) durch. Verwenden Sie automatische Belichtungs- und Binning-Einstellungen (diese können jedoch für den erwarteten Strahlungsfluss optimiert werden).
3. Bereiten Sie die Biosicherheitswerkbank der Klasse II für das Verfahren vor. Verwenden Sie eine Heizmatte, die von einem sterilen Kunststoffvorhang überlagert wird. Verwenden Sie zur Vergrößerung während der Dissektion ein Paar 2,5- bis 3,5-fach vergrößerungs-chirurgische Lupen.
4. Betäuben Sie die Maus mit 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion.
5. 5 mg/kg Enrofloxacin Antibiotikaprophylaxe, 2,5 mg/kg Flunixin-Analgesie und 1 ml 0,9% Kochsalzlösung subkutan verabreichen.
6. Legen Sie die Maus auf das sterile Feld in Rückenlage und tragen Sie Povidon-Jod gefolgt von 70% Ethanol für die Hautvorbereitung auf.
7. Machen Sie einen Längsschnitt in die Haut des linken Schädelquadranten des Abdomens, vorzugsweise durch die vorherige Schnittstelle.
8. Sezieren Sie die Haut unverblümt von der darunter liegenden muskulösen Bauchdecke und legen Sie dann einen alm selbsthaltenden Retraktor, um die Hautwunde offen zu halten.
9. Schneiden Sie die Muskelschicht zwischen der Zette nur auf eine Seite der Nahtlinie der vorherigen Operation und verlängern Sie dann den Schnitt, um die gesamte vorherige Nahtlinie zu entfernen.
10. Äußeren Sie die Milz und die distale Bauchspeicheldrüse und ziehen Sie sie kranial zurück. Am kaudalen Aspekt der Bauchspeicheldrüse kann der Dickdarm durch filmische Adhäsionen gebunden sein. Wenn dies gefunden wird, sezieren Sie den Dickdarm unverblümt ab.
11. Geben Sie vorsichtig ein Paar Zangen dorsal an den Körper der Bauchspeicheldrüse und der Milzgefäße und öffnen Sie diesen Raum. Dies gibt ein Segment der Bauchspeicheldrüse für die nachfolgende Ligatur frei.
12. Ligaieren Sie den Körper der Bauchspeicheldrüse proximal zum Tumor mit einem Titanligaturclip und transektieren Sie dann die Bauchspeicheldrüse distal dazu mit Kauter. Eine alternative Möglichkeit, den Pankreasstumpf zu kontrollieren, besteht darin, ihn vor der Transsektion in Kontinuität mit 5/0 Polyglykolsäurenäht zu ligieren.
13. Ziehen Sie die Bauchspeicheldrüse kaudal zurück und kauterisieren Sie die gastrosplenischen Gefäße zwischen dem Schädelpol der Milz und dem Magen.
14. Entfernen Sie die Probe und bestätigen Sie die Hämostase.
15. Schließen Sie die Bauchdecke mit 5/0 Polyglykolsäurenaht kontinuierlich. Schließen Sie die Skin mit Clips.

3. Postoperatives Management

1. Überwachen Sie die Maus unmittelbar nach der Betäubung (für beide oben genannten Verfahren) in einem erwärmten Käfig, bis sie sich von der Betäubung erholt hat. Sobald Sie wach und aufmerksam sind, bewegen Sie die Maus zurück in ihren Käfig. Überwachen Sie die Tiere in der postoperativen Phase auf Schmerzen und Anzeichen von Stress. 0,05 mg/kg Buprenorphin durch subkutane Injektion verabreichen und die Tiere 12 Stunden lang genau beobachten.
2. Überwachen Sie anschließend die Mäuse täglich auf Gewicht, Nahrungsaufnahme und Aktivität. Untersuchen Sie Die Schnittstellen und tasten Sie die Tumorgröße ab. Entfernen Sie hautliche Clips am siebten postoperativen Tag.
3. Euthanasiern Sie die Maus, wenn humane Endpunkte erreicht sind. Zu diesen humanen Endpunkten gehören: Verlust des Körpergewichts >20%, Merkmale von nicht behandelbarem Stress (einschließlich gebeugter Haltung, Bewegungsmangel oder Pflege) und Tumorgröße größer als 1 cm^3, wie durch externe Palpation geschätzt.

Ergebnisse

Neunundfünfzig aufeinanderfolgende Mäuse wurden einer Implantationsoperation unterzogen. Bruttoleckagen traten bei acht (14%) Mäuse. Der Grad der Leckage zum Zeitpunkt der Injektion wird wie oben im Protokollabschnitt beschrieben geschätzt. Nach drei Wochen, um diese implantierten Tumoren wachsen zu lassen, wurde eine Biolumineszenz-Bildgebung vor der Resektion durchgeführt, um Mäuse mit grober metastasierender Erkrankung vor der Resektion auszuschließen. Fünfundvierzig (76%) Mäuse wurden einer chirurgischen Res...

Diskussion

Ein resektionales orthotopisches Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs ist wichtig, da es die Prüfung adjuvanter und neoadjuvanter Behandlungen ermöglicht. Dies ist besonders wichtig bei Bauchspeicheldrüsenkrebs, wo eine Operation die effektivste Behandlung bleibt, aber mit einem hohen Rezidivrisiko verbunden ist. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die zuverlässig einen Bauchspeicheldrüsenkrebs erzeugt, der potenziell mit Resektion heilbar ist, und repliziert das klinische Szenario, in dem eine neoadjuvante...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure
AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid)	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA		supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan
Autoclip wound clips, 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia
Cancer associated human pancreatic stellate cells	Pancreatic Research Group cell bank		In house cell bank
Cryogenic tubes, 1.0 mL	Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia	366656
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Foetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	16000044
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female	Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	21056023
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	15140122
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	11875085
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Trypsin 0.05%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25300054	For pancreatic stellate cells
Trypsin 0.25%, EDTA 0.02%	Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia	25200056	For ASPC-1 cells
U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA
Equipment for Resection Procedure
Alm self-retaining retractor			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Autoclip wound clips 9 mm	Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW	500346
Basic Dressing Pack	Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia	08-559NP
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15	Livingstone International, Mascot, NSW,	SCP15
Gilles fine tooth forceps 12 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Hand-held high temperature fine tip cautery	Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA	AA01
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery	Generic
IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device	Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA
Jewellers forceps 11.5 cm			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	C1049407
Portable weighing scale	Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex wound clip applier and clip remover	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500345
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip			Generic stainless steel microsurgical instrument set
Titanium “Weck style” Ligaclip, small	HZMIM, Hangzhou, China
Titanium Ligaclip applier for open surgery, small	HZMIM, Hangzhou, China
Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber	Generic		Generic vapouriser and induction chamber
Drugs for Procedures
70% w/w ethanol solution	Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia		Applied topically as surgical skin preparation
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 0.05 mg/kg s.c.
D-Luciferin (1 U/g)	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA	122799	diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p
Enrofloxacin 50 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 5 mg/kg s.c.
Flunixin 50 mg/mL	Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia		Dose: 2.5 mg/kg s.c.
Isoflurane	Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia		Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance
Ketamine 100 mg/mL	Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia		Dose: 80 mg/kg i.p.
Povidone-Iodine 10% w/v solution	Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia	RIO00802F	Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation
Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w)	Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia		Applied to both eyes
Sodium chloride 0.9% w/v	Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia	9481P	Dose: 900 μL s.c.
Water for injections BP	Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia		For dilution of drugs
Xylazine 20 mg/mL	Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia		Dose: 10 mg/kg i.p.